食管癌腫瘤標志物的研究進展

張麗亞，賈培君，尚晉文，張成娟

(鄭州大學附屬腫瘤醫院、河南省腫瘤醫院生物樣本中心，河南 鄭州 450008)

食管癌是惡性程度較高的消化系統腫瘤之一,分為食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinomas,ESCC)與食管腺癌,2018年全球癌癥數據最新統計顯示,全球食管癌新發病例約為57.2萬例,在36種惡性腫瘤中占3.2%,排第7位，死亡病例約為50.8萬例,占5.3%,排第6位[1]。我國亦是食管癌的高發地區，2015年的研究分析顯示，食管癌的發病率占全部惡性腫瘤的第6位，死亡率占第4位[2]。早期食管癌癥狀不明顯，且無特異性診斷方法,因此，大部分患者確診時已屬中晚期，根治性治療手段有限，臨床上預后較差[3]。

腫瘤標志物是指存在于特定的惡性腫瘤細胞,或由惡性腫瘤細胞產生,或腫瘤對宿主的刺激產生,并能反映腫瘤發生、發展和監測腫瘤對治療反應的一類物質。臨床上尋找有效的腫瘤標志物,對食管癌患者提高生存率降低死亡率等具有十分重要的意義。本文就近年來報道的食管癌腫瘤標志物進行總結，分別從DNA、RNA和蛋白質等方面進行闡述。

1 DNA類腫瘤標志物

1.1 DNA甲基化DNA甲基化是一種常見表觀遺傳過程，在不影響基因組DNA序列本身的情況下，通過DNA甲基化轉移酶的作用在含胞嘧啶、鳥嘌呤的二核苷酸的胞嘧啶上添加一個甲基基團，可導致基因表達的抑制[3]。DNA甲基化在惡性腫瘤發生、發展的各個階段都發揮著重要的作用，單個或多個基因的甲基化可作為分子生物標志物，用于惡性腫瘤的分類、早期診斷、治療監測以及復發轉移的預測。

Tang等[4]通過焦磷酸測序法發現ESCC腫瘤組織中成對盒基因1(paired box gene 1,PAX1)、性別決定區域Y-box-1(sex determining region Y-box-1,SOX1)和鋅指蛋白582(zinc finger protein582,ZNF582)的DNA甲基化水平均高于配對的癌旁組織和正常組織，提示檢測PAX1、SOX1、ZNF582基因的甲基化狀態可能是一種有前途的ESCC篩查和診斷的生物標志物。Kurimoto等[5]對78例經手術切除的ESCC患者采用定量甲基化特異性PCR(quantitative methylation specific PCR,qMSP)評價PAX5的甲基化狀態，結果顯示ESCC腫瘤組織平均qMSP值較鄰近正常組織高，高qMSP值者無復發生存率較低，并且PAX5敲除細胞的增殖和對順鉑的耐藥性明顯增加，提示PAX5基因甲基化預示ESCC患者較差的生存結局和順鉑敏感性，可作為惡性腫瘤治療方案選擇的有效輔助工具。Chen等[6]采用MSP檢測135例ESCC組織中性多聚甲醛固定石蠟包埋組織的轉錄因子叉頭框F2(Forkhead box F2,FOXF2)啟動子甲基化狀態，結果發現FOXF2啟動子甲基化可以獨立預測ESCC患者的總體生存率，提示FOXF2啟動子甲基化可能是一種有用的ESCC患者預后的生物標志物。

1.2 融合基因融合基因是由2個先前獨立的親本基因形成的雜交基因。以往，基因融合被視為惡性腫瘤中常見的驅動突變，與血液、淋巴和骨髓組織有關，但在實體腫瘤中也扮演著越來越重要的角色，并且可以作為診斷和治療的分子靶點。Jiang等[7]通過全轉錄組測序在ESCC中發現了一種新的融合基因人類白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)-E和HLA-B，這將成為ESCC診斷的生物標志物和治療靶點，為更好了解ESCC的腫瘤發生機制提供新的思路。Blum等[8]通過綜合RNA測序評估了55例預治療食管腺癌和49例巴雷特食管內鏡檢查患者的非惡性活檢組織的基因融合情況，發現21個新的候選食管腺癌相關融合基因，選擇2個候選融合體進行PCR和Sanger測序驗證，觀察到核糖體蛋白S6激酶β1(RPS6KB1)-泡膜蛋白1(vacuole membrane protein 1，VMP1)基因融合在大約10%的食管腺癌病例中反復發生，并且RPS6KB1-VMP1融合的食管腺癌患者總體生存期明顯較差。RPS6KB1-VMP1是一種通過調節自噬相關過程促進食管腺癌的基因融合，為其分子發病機制提供了新的見解。

1.3 單核苷酸多態性單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性。SNP作為第3代遺傳標記，具有分布廣泛、數量多、遺傳特性穩定和易于快速、規模化篩查的特點，既是闡明腫瘤易感性的分子基礎，揭示腫瘤異質性的根本原因，也可作為鑒別易感人群和靶向治療的分子標志[9]。Vashist等[10]從190例單純行食管癌全切除的患者外周血白細胞中提取基因組DNA并分析臨床數據，發現T393C-SNP是食管癌患者復發和生存的一個強有力的獨立預后因素。因此，T393C GNAS1多態性作為食管癌獨立預后標志物，術前確定GNAS1基因型可將患者分為不同的風險狀況，并可能有助于定制治療和隨訪方案。Yang等[11]對中國寧夏地區80例惡性腫瘤患者和200例非惡性腫瘤對照采用PCR直接測序法鑒定了p21Waf1/Cip1基因3種變異(codon31、IVS2+16、SNP309)，并分析了3種SNP的單倍型和單個SNP與食管癌的關系，發現密碼子31Ser等位基因純合性，無論是單獨或與其他2個SNP結合，可能與食管癌的發展有關。見表1。

表1 DNA類腫瘤標志物

2 RNA類腫瘤標志物

2.1 長鏈非編碼RNA長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是長度大于200個核苷酸的不能翻譯成蛋白的功能性RNA,參與基因組印記、轉錄激活、轉錄干擾、核內運輸等多種調控過程。許多lncRNA在多種惡性腫瘤組織中表達失調，在腫瘤發生和腫瘤進展中發揮重要作用,可作為一種新的腫瘤標志物和潛在的治療靶點。

一個典型例子就是由HOXC位點表達的同源異型盒基因轉錄反義RNA(HOX transcript antisense RNA,HOTAIR)。Lv等[12]通過原位雜交和定量逆轉錄酶PCR(quantitative reverse transcriptase PCR,qRT-PCR)檢測HOTAIR的表達差異，發現ESCC組織中HOTAIR表達明顯增高，HOTAIR在ESCC患者中的高表達水平與臨床分期、TNM分級、組織學分化程度呈正相關。因此，HOTAIR是ESCC預后的一種潛在的腫瘤標志物，其失調可能在ESCC進展中起重要作用。Bao等[13]采用qRT-PCR檢測147例ESCC患者發現ESCC組織中FOXD2相鄰的反鏈RNA1(FOXD2-AS1)表達高于鄰近非腫瘤組織，而且Kaplan-Meier分析結果顯示，ESCC患者中FOXD2-AS1高表達與預后不良相關。因此，FOXD2-AS1可能作為ESCC患者判斷預后的腫瘤標志物。

2.2 嵌合RNA嵌合RNA由2個或2個以上基因的外顯子組成，并具有編碼新蛋白改變細胞表型的潛力。嵌合RNA不僅可以在DNA水平上通過染色體重排產生，還可以在RNA水平上通過基因間剪接產生。嵌合RNA可以發揮新的細胞復雜性能，與惡性腫瘤發生、發展存在著密切關系，可作為腫瘤診斷和預后的生物標志物。

Zhang等[14]分析了32個復發性惡性腫瘤嵌合RNA在ESCC及其細胞株中的表達情況，發現GOLM1-MAK10是ESCC中的一種惡性腫瘤富集嵌合RNA，而且原位雜交顯示，嵌合體的表達主要局限于患者的腫瘤細胞，在正常受試者的非腫瘤性食管組織中幾乎檢測不到。總的來說，這些發現為ESCC的分子機制研究提供了新的思路，并為食管癌未來的治療提供了新的潛在靶點。Lin等[15]使用qRT-PCR檢測唾液外泌體GOLM1-NAA35嵌合RNA，并分析其診斷準確性、治療反應的縱向監測和無進展生存期的預測，結果顯示體外GOLM1-NAA35嵌合RNA在ESCC細胞和裸鼠ESCC異種移植中均可檢測到，GOLM1-NAA35嵌合RNA水平反映體內腫瘤負荷。因此，唾液外泌體GOLM1-NAA35嵌合RNA是一種有效的非侵入性生物標志物，可方便、可靠地評估治療反應、復發和早期檢測。

2.3 微小RNA微小RNA(microRNA,miRNA)是一類由內源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，其參與轉錄后基因表達的調控。MiRNA表達的改變也會改變癌基因和抑癌因子的表達，影響了包括ESCC在內的胃腸道腫瘤細胞的增殖、凋亡、能動性和侵襲性[16]。多種miRNA表達譜可能提供有用的生物標志物和治療靶點。

Wang等[17]通過qRT-PCR檢測新鮮ESCC組織中miR-3651的表達水平,統計并分析miR-3651表達與臨床特征和預后的關系，結果顯示，腫瘤組織中miR-3651的表達較癌旁組織明顯下調，miR-3651的表達與ESCC的腫瘤浸潤程度呈負相關。MiR-3651可能在惡性腫瘤進展中發揮重要作用，并可作為ESCC患者的預后標志物。Jiang等[18]的研究結果顯示食管癌患者血清中miR-218的表達明顯低于健康人,分化較差、晚期、淋巴結轉移的患者血清中miR-218的表達更低，因此，血清miR-218可能是食管癌患者早期檢測和臨床評價的潛在生物標志物。Kurashige等[19]采用RT-PCR檢測71例ESCC患者和39例健康對照者血清miR-21水平后發現，ESCC患者血清miR-21明顯高于健康對照者，術后樣本與術前樣本相比，血清miR-21水平顯著降低。此外，miR-21水平在對化療有反應的ESCC患者中顯著降低(P=0.003)，而在無反應的ESCC患者中無顯著變化。因此，血清miR-21被認為是診斷ESCC的一種新的生物標志物，也可以作為ESCC患者化療期間的反應標志物。見表2。

表2 RNA類腫瘤標志物

3 蛋白質類腫瘤標志物

Numb蛋白在細胞分裂過程中的不對稱分離決定了細胞的結局,其具有多種功能，涉及發育神經生物學和腫瘤生物學等多個研究領域。Liu等[20]通過對212例患者的組織芯片分析發現,與對應的非腫瘤組織相比,ESCC組織中的Numb蛋白明顯上調。Kaplan-Meier生存分析提示,高表達的Numb蛋白與高腫瘤復發率(P=0.015)和低整體術后生存(P=0.016)顯著相關。因此，Numb蛋白有潛力作為一種新的預后標志物和治療靶點。

CD59是一種膜結合的補體調節蛋白，可以通過脂質筏上的Src激酶傳遞信號，從而發揮與補體無關的作用。Zhou等[21]發現CD59的表達水平與食管癌細胞系和臨床標本的耐輻射性呈正相關。在接受放療的ESCC患者中高表達的CD59提示較差的總生存率和無病生存率。CD59表達的遺傳改變調節了食管癌細胞對電離輻射的敏感性。因此，CD59可能是預測ESCC對放療的敏感性的潛在生物標記。

血管生成素樣蛋白2(angiopoietin-like protein,ANGPTL2)介導慢性炎癥，腫瘤細胞來源的ANGPTL2促進腫瘤侵襲和血管生成。ANGPTL2在腫瘤細胞中的過表達與腫瘤的進展有關，在肺癌、乳腺癌、結腸癌和胃癌中均有發現。Ide等[22]研究發現ANGPTL2低表達降低了食管癌細胞系的增殖、侵襲和遷移能力，高分化的ESCC組織中ANGPTL2表達明顯升高，ANGPTL2高表達患者的總生存率和無病生存率明顯低于低表達患者。因此，ANGPTL2可作為食管癌診斷和預后的一種新的生物標志物。

自身抗體是指針對自身組織、器官、細胞及細胞成分的抗體。抗腫瘤相關抗原的自身抗體已在多種惡性腫瘤中發現，并可作為早期惡性腫瘤診斷的生物標志物。Chen等[23]收集149例ESCC患者和98例健康對照者，通過酶聯免疫吸附試驗測定發現早期ESCC患者血清中針對成束蛋白的自身抗體水平明顯高于正常對照組(P<0.05)。這提示成束蛋白自身抗體可能是一種潛在的ESCC早期檢測的生物標志物。Ye等[24]的研究發現叉狀頭/翅膀狀螺旋轉錄因子(forkhead/winged helix transcription factor,FOXP3)循環IgG自身抗體可能是早期診斷食管癌的潛在生物標志物。某些自身抗體聯合檢測，可以在獲得較高水平的特異性的同時獲得更高的敏感性[25]。見表3。

表3 蛋白質類腫瘤標志物

4 結語

腫瘤標志物對食管癌患者的診斷治療和判斷預后有一定的幫助，但是許多標志物仍處于實驗探索階段，具有一定的局限性，缺乏高敏感性和特異性，有些檢測方法繁瑣且昂貴不適合于臨床大規模應用。另外，部分研究樣本量較小，結果說服力不強。然而腫瘤標志物在早期診斷中簡單易行且相對無創的優點還是十分明確的。相信未來隨著檢測技術的不斷發展，腫瘤標志物敏感性和特異性均會得到提高，其將會成為越來越重要的輔助檢測手段，而且多個腫瘤標志物的聯合檢測可以提高敏感性和特異性，更好為食管癌患者的診斷治療和判斷預后提供指導意義。