人脂肪間充質干細胞條件培養基凍干粉促進皮膚成纖維細胞遷移、細胞外基質合成和抑制巨噬細胞炎癥

陳應爐，宋曉樂，雷繼剛，任程潔，戴成祥

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一類能夠自我更新和具有多向分化潛能的多能干細胞，廣泛存在于全身多種組織中，如骨髓、臍帶、胎盤、外周血和脂肪等，間充質干細胞能治療心肌梗死、大腦和脊髓損傷、腦卒中、糖尿病、軟骨和骨骼損傷、克羅恩病和移植物抗宿主病等多種疾病[1]，全球已經有多款間充質干細胞產品獲批上市[2]。研究發現間充質干細胞在緩解疾病方面的作用被歸因于它們的細胞因子分泌和免疫調節，而不是它們分化成所需細胞的能力[3-4]。間充質干細胞因為出廠有效期較短，同時需要冷鏈運輸，在使用時并不方便。間充質干細胞分泌條件培養基中包含多種生長因子、細胞因子、趨化因子、血管生成因子和外泌體，以及外泌體微囊泡包裹的蛋白、脂類、miRNA、lncRNAs 等，這些物質更容易制造、冷凍干燥、包裝和運輸[1,5]，其在促進細胞的遷徙、增殖和抗炎中有顯著效果[6-9]。此外，因為它沒有細胞，不需要匹配供體和受體來避免排斥問題，使用相對安全。因此，干細胞條件培養基在再生醫學中具有廣闊的應用前景[10]。近年來，間充質干細胞及相關產品在化妝品行業應用也越來越廣泛。

隨著年齡的增加，皮膚老化是一個不可避免的進程[11]。這主要與皮膚再生能力的下降和重塑能力降低有關[12]。隨著時間的推移，皮膚真皮層中的膠原蛋白和彈性蛋白的總量也會減少，導致的組織成 分發生質的退化[13]。這些過程導致面部皮膚松弛、褶皺和表面變化，包括皮膚粗糙和干燥病。條件培養基中的細胞因子、生長因子和外泌體等在促進膠原蛋白和彈性蛋白合成中有顯著效果[8,14]，尤其是人脂肪間充質干細胞分泌的 TGF-β1、bFGF、EGF、PDGF-BB、HGF 和 VEGF 等在促進皮膚損傷修復、膠原蛋白和透明質酸合成中起重要作用[15]。但是條件培養基常溫保存容易失效，而且容易滋生細菌造成污染，運輸和使用不便。因此，將條件培養基凍干能顯著增加其穩定性，延長有效期[16]。人脂肪間充質干細胞條件培養基凍干粉（human adipose-derived mesenchymal stem cells conditioned medium lyophilized powder，hADMSCs-CMLP）是一個很好的選擇，其生物材料取材方便、來源豐富、安全效果好、無倫理爭議、容易大規模生產、易存儲和運輸。本文以人脂肪間充質干細胞條件培養基凍干粉為原料，以人成纖維細胞和小鼠巨噬細胞為模型，探討了凍干粉水化后在細胞模型中對細胞遷移、細胞外基質合成影響和抗炎作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與耗材 人皮膚成纖維細胞 HFF-1 購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫；小鼠單核巨噬細胞白血病細胞 Raw264.7 購自武 漢普諾賽生命科技有限公司；FITC-CD73、PerCP/Cy5.5-CD90 、 APC-CD105 、 PE-CD34 、FITC-HLA-DR、FITC Mouse IgG1、PE Mouse IgG1、APC Mouse IgG1、PerCP/Cy5.5 Mouse IgG1 購自美國 Biolegend 公司；基因引物購自美國 Invitrogen 公司；滅菌注射用水購自山東華魯制藥有限公司；RNA 小量提取試劑盒購自美國 Qiagen 公司；胰蛋白酶、α-MEM、DMEM 和反轉錄試劑盒購自美國 Thermo Fisher 公司；EliteGro 血清替代物購自 EliteCell 公司；成骨、成脂、成軟骨誘導分化試劑盒 購 自 Sciencell 公司；Radius?24-Well Cell Migration Assay 購自美國 Cell Biolabs 公司；Transwell 小室購自美國 BD 公司；脂多糖（LPS）、CellTiter-Lumi?Plus 發光法細胞活力檢測試劑盒、mouse IL-6 ELISA kit 和 mouse TNF-α ELISA kit 檢測試劑盒購自碧云天生物技術公司。qRT-PCR 基因探針引物 COL1A1（ID：Hs00164004_m1）、FN1（ID：Hs01549976_m1）、ELN（ID：Hs00355783_m1） 和 MMP1（ID：Hs00899658_m1）均購自美國 Thermo Fisher 公司。

1.1.2 儀器 1374 型 II 級生物安全柜、Quant StudioD 實時熒光定量 PCR 儀、自動細胞計數儀和 ST-16R 低溫離心機為美國 Thermo 公司產品；酶標儀為 Bio-Rad 產品；MCO-20AIC 型 CO2培養箱為日本三洋公司產品；1800 系列-190 氣相液氮罐為美國 MVE 公司產品；FACS Calibur 流式細胞儀為美國 BD 公司產品；Celldiscoverer 7 活細胞工作站為德國蔡司公司產品；LYO-0.5 型凍干機為上海東富龍科技股份有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 人脂肪間充質干細胞培養和表面標志物鑒定 待 P3 代 hADMSCs 細胞長滿 80% 左右，用 0.25% 胰酶消化 3 min，離心收集細胞，用 PBS 調整細胞密度為 6 × 106個/ml，取 1 ml 細胞，分別加入鼠抗人單克隆標記抗體 FITC-CD73、PerCP/Cy5.5-CD90、APC-CD105、PE-CD34、FITC -HLA-DR，以鼠抗人的 IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-APC、IgG1-PerCP/Cy5.5 作為同型對照，室溫避光孵育 30 min，離心清洗后，經流式細胞儀上樣檢測。

1.2.2 人脂肪間充質干細胞三向分化檢測 將 P3 代 hADMSCs 接種于六孔板中，接種細胞密度為 1 × 104個/ml，2 ml/孔，置于 37 ℃、5% CO2中培養，待細胞融合度達到 70% ～ 80% 時，棄去原培養基，分別更換為成脂和成骨誘導分化培養基，成軟骨置于 15 ml 離心管培養，每 3 天更換一次培養基。成脂、成骨誘導 21 d 后，分別用油紅 O 染液、茜素紅 S 染液染色，成軟骨誘導 28 d 后，成軟骨的軟骨小球先固定切片后用阿利新藍染色，在倒置相差顯微鏡下觀察 MSCs 的成脂、成骨、成軟骨分化水平。所有操作均按照成脂、成骨和成軟骨誘導試劑盒說明書進行。

1.2.3 人脂肪間充質干細胞條件培養基凍干和再水化 將 P3 代對數生長期 hADMSCs 接種于 T175 培養瓶中，按細胞密度為 1 × 104個/cm2接種，待細胞融合度達 80% 左右，換無血清培養基，24 h 后收集條件培養基上清，將收集的條件培養基上清按 1 ml/瓶分裝至西林瓶中進行凍干操作。凍干步驟：預凍溫度 -45 ℃，設定時間 45 min，持續時間 150 min。一次干燥的第一階段溫度 -5 ℃，設定時間 60 min，持續時間 600 min，設定真 空 0.01 mbar，第二階段設定溫度 10 ℃，設定時間 60 min，持續 120 min，設定真空 0.01 mbar。干燥 設定溫度 30 ℃，設定時間 60 min，持續時間 240 min，設定真空 0.001 mbar。凍干完成后存儲于 -20 ℃，使用時用蒸餾水按 1 ml/瓶水化溶解。

1.2.4 凍干粉濃度篩選（細胞劃痕實驗） 成纖維細胞（HFF-1）按（0.15 ～ 0.3）× 106個/ml 添加到 6 孔板，每孔添加 2 ml DMEM + 10% FBS， 待細胞完全長滿，吸去培養基。用 1 ml 移液槍 頭從中間進行劃痕。劃痕后用 PBS 2 ml 進行清 洗，洗去漂浮的細胞。分成 4 組（DMEM，15% hADMSCs-CMLP，50% hADMSCs-CMLP，100% hADMSCs-CMLP），每組 3 個復孔。0、16、24 h 分別在 10 × 鏡下觀察拍照。

1.2.5 成纖維細胞遷徙實驗 在加細胞之前先將 Radius? 遷移板加預制膠溶液處理 20 min，然后加洗滌液洗滌，洗滌后 HFF-1 按（0.15 ～ 0.3）× 106/ml，每孔添加 500 μl，培養 24 h，待細胞長滿后，去除凝膠，吸掉培養基，對照組加入完全培養基，實驗組添加含 50% 凍干粉溶解液的培養基，放入活細胞工作站中培養 24 h，觀察細胞生長和 遷移情況并統計細胞遷移面積。細胞遷移實驗詳 見 Radius?24-Well Cell Migration Assay 試劑盒說明書。另按相同方法接種于 96 孔板，用 CellTiter-Lumi?Plus 發光法細胞活力檢測試劑盒檢測細胞增殖情況。Transwell 觀察細胞遷徙情況： 24 孔板加入含 50% 凍干粉溶解液的培養基 600 μl（下層小室），HFF-1 細胞按 3 × 104/200 μl 無血清 DMEM 培養基加入 transwell 的上層小室，置于 37 ℃，5% CO2培養箱中培養 24 h，取出 transwell 小室，用棉簽將小室內膜上未遷移細胞擦除，然后將朝下一側的膜反轉，置于新的 24 孔培養板中，加入 600 μl 4% 多聚甲醛固定 20 min，用 0.1% 結晶紫染色液染色 3 min。PBS 漂洗 3 次，除去未結合的結晶紫，棉簽輕輕擦去小室側壁的結晶紫染料，適當風干。將每個小室置于新的 24 孔板中，置于倒置顯微鏡下（10 ×），隨機拍攝 6 個視野，并統計分析其遷移細胞數。

1.2.6 qRT-PCR 檢測細胞外基質基因 mRNA 表達 將 HFF-1 細胞按 5 × 104個/cm2接種六孔板，對照組每孔加 2 ml 完全培養基，實驗組每孔加 2 ml 含 15% 凍干粉的完全培養基，每組設置 3 個平行，置于 37 ℃，5% CO2培養箱中培養 48 h。提取細胞總 RNA，反轉錄為 cDNA，-20 ℃ 保存。qRT-PCR 測定細胞外基質相關蛋白 I 型膠原蛋白（collagen I）、MMP-1、彈性蛋白（elastin）、 纖維粘連蛋白（fibronectin）mRNA 表達。PCR 擴增條件：50 ℃ 保持 2 min，95 ℃ 預變性 10 min，95 ℃ 變性 15 s，60 ℃ 退火 1 min，循環 40 次。

1.2.7 基于 LPS 刺激巨噬細胞的抗炎功效評 估 以小鼠的 Raw264.7 巨噬細胞為模型，采用 LPS 誘導其發生炎癥反應，研究人源脂肪間充質干細胞條件培養基凍干粉的抗炎作用。Raw264.7 巨噬細胞接種量按 1 × 105個/孔接種于 12 孔培養板中，每孔加入 1 ml 完全培養基，分四組：control、脂多糖（LPS）、LPS + Dex 和 LPS + 50% hADMSCs-CMLP。加藥濃度為 LPS（100 ng/ml）、Dex（5 μg/ml）、50% CMLP（凍干粉 1 ml 蒸餾水稀釋后與完全培養基 1:1 混勻），置于 37 ℃，5% CO2培養箱中培養 24 h；收集細胞上清，用 IL-6 和 TNF-α ELISA 試劑盒檢測細胞培養上清液中的細胞炎癥因子（IL-6 和 TNF-α）水平，使用酶標儀檢測 450 nm 吸光度值。

1.3 統計學處理

采用 FlowJo V10 軟件分析流式檢測結果，用 GraphPad Prism 6.0 軟件進行作圖、統計學分析，采用單因素方差分析 one-way ANOVA，當 P ＜ 0.05 時表示差異有統計學意義，所得計量數據用± s表示。

2 結果

2.1 hADMSCs 表面抗原鑒定

流式細胞術檢測 P3 代 hADMSCs 表面抗原標志物，結果顯示 CD34+、CD45+、HLA-DR+陽性細胞數百分比分別為 0.19%、0.06%、0.72%，表達特異性抗原 CD73+、CD90+、CD105+陽性細胞百分比分別為 99.76%、99.46%、98.53%（圖 1），符合國際細胞治療協會定義的 MSCs 標志性抗原表達鑒定標準。表明本研究采用的 hADMSCs 具有很好的間充質干細胞生物學特性。

2.2 hADMSCs 分化能力鑒定

hADMSCs 經成脂誘導培養 21 d，油紅 O 染色后于顯微鏡下觀察到細胞的胞漿內出現大小不等的紅色脂滴，隨著誘導培養時間的延長，脂滴持續增大、增多，同時細胞形態從梭形、多角形向橢球形轉變，表現出脂肪細胞特點；hADMSCs 經 成骨誘導培養 21 d，觀察到單個細胞體積增大，開始形成多層結節狀結構，經茜素紅 S 染色后出現大量橘紅色沉淀顆粒，有明顯的“礦化”結節，提示細胞產生鈣化基質沉積，具有成骨細胞特點； hADMSCs 成軟骨誘導培養 28 d，觀察 15 ml 離心管底部出現軟骨小球，經固定切片和阿利新藍染色后，軟骨小球的黏多糖會被阿利新藍染成湛藍色，具有成軟骨細胞樣特點（圖 2）。表明本研究獲得的 hADMSCs 具有很好的成脂、成骨和成軟骨分化潛能。

圖1 hADMSCs 表面標志物流式鑒定結果（A ～ C 分別是CD34+、CD45+、HLA-DR+ ＜ 2.00%；D ～ E 分別是 CD73+、CD90+、CD105+ ＞ 95.00%）Figure 1 Results of flow cytometry identification of hADMSCs surface markers (A-C was CD34+, CD45+, HLA-DR+ ＜ 2.00%; D-E was CD73+, CD90+, CD105+ ＞ 95.00%, respectively)

圖2 hADMSCs 成骨、成脂、成軟骨分化潛能鑒定（A：陰性對照，正常 hADMSCs 細胞形態；B：成骨茜素紅 S 染色；C：成脂油紅 O 染色；D：成軟骨小球切片阿利新藍染色）Figure 2 Osteogenic, adipogenic, chondrogenic differentiation potency of hADMSCs (A: Negative control, normal hADMSCs cell morphology; B: Alizarin red S staining; C: Red O staining; D: Alcian blue staining of chondroblast sections)

2.3 hADMSCs 條件培養基凍干粉促進成纖維細胞遷移

HFF-1 長滿后劃痕，比較 0、16、24 h 鏡檢結果，發現 3 個實驗組成纖維細胞遷移能力均高于陰性對照 DMEM，且死細胞少，劃痕大部分已經修復，其中 50% hADMSCs-CMLP 的細胞修復能力最強（圖 3）。

HFF-1 細胞按上述方法處理后，活細胞工作站培養觀察 24 h，明顯能看到細胞在加入 50% 的凍干粉后，實驗組 HFF-1 基本長滿圓形空白部分，對照組 HFF-1 還有很大空白（圖 4B）。說明凍干粉能顯著促進 HFF-1 細胞遷移。相同的處理方法接種于 96 孔板，培養 24 h 后，酶標儀檢測顯示添加 50% 的凍干粉，HFF-1 細胞 ATP 含量相對于對照組無明顯增高，表明凍干粉對成纖維細胞是促進遷移，而非增殖（圖 4A 和 C）。另外用 transwell 方法，可以觀察到細胞向含有 50% hADMSCs-CMLP 培養基下層遷移，結晶紫染色明顯能看到下層膜細胞變多，統計學差異顯著（n = 3）（圖 4D ～ F）。

圖3 凍干粉濃度篩選（細胞劃痕實驗）（10 ×）Figure 3 Lyophilized powder concentration screening (cell wound healing test) (10 ×)

2.4 hADMSCs 條件培養基凍干粉對 HFF-1 細胞外基質基因表達的影響

hADMSCs 條件培養基凍干粉共培養下，利用 qRT-PCR 的方法，檢測 HFF-1 的細胞外基質相關蛋白基因的 mRNA。結果顯示，與對照組相比，共培養 48 h 時 HFF-1 的纖連蛋白、彈性蛋白、I 型膠原基因表達水平顯著升高（圖 5A ～ C）；共培養 48 h，MMP-1 mRNA 表達顯著降低（圖 5D）。表明 hADMSCs 條件培養基凍干粉與 HFF-1 共培養能夠顯著促進體外細胞基質相關基因的表達。

2.5 hADMSCs 條件培養基凍干粉能抑制 Raw264.7 細胞炎癥因子的分泌

為了研究 hADMSCs 條件培養基凍干粉的抗炎能力，以 LPS 誘導其炎癥模型，加入 50% hADMSCs 條件培養基凍干粉共培養 24 h 后收集上清，檢測其 TNF-α 和 IL-6 因子表達量，結果顯示，條件培養基凍干粉抗炎效果極佳，能明顯 抑制 TNF-α 和 IL-6 的分泌，抑制效果能達到地塞米松水平，差異均具有統計學意義。表明 hADMSCs 條件培養基凍干粉有很好的抗炎作用（圖 6A 和 B）。

3 討論

近年來，隨著人們對 MSCs 認識的提高和技術的發展，越來越多的人對 MSCs 在體內是否分化為再生組織提出疑問，Caplan[17]提出，MSCs 定位于損傷或疾病部位，并分泌具有免疫調節和營養(再生)的生物活性因子，意味著這些細胞可以就地制造具有藥用價值的治療藥物。原位新組織構建可能得益于外源供應 MSCs 分泌的生物活性因子，所以提出是否將 MSCs 翻譯為藥物信號細胞更為合適。脂肪間充質干細胞條件培養基凍干粉含有多種細胞因子、生長因子和趨化因子等；其中，VEGF 在脂肪間充質干細胞條件培養基凍干粉中表達顯著高于其他來源的干細胞收集的條件培養基。研究證實，旁分泌因子 MCP-1 和 VEGF 在血管生成和細胞遷移過程中發揮重要作用[1,18]，我們研究發現，脂肪間充質干細胞條件培養基凍干粉能顯著促進細胞遷移。成纖維細胞在傷口愈合中起著關鍵作用，Saheli 等[19]研究表明，間充質干細胞條件培養基處理后的成纖維細胞，細胞活力、增殖和遷移情況顯著提高。EGF 和 bFGF 基因表達水平上升，能夠促進創傷愈合，PDGF 和 bFGF 表達上升能顯著促進創傷部位細胞外基質的合成。盡管間充質干細胞在皮膚創面愈合中起著重要的作用，但有證據表明，由于細胞在損傷組織成活率低和干細胞歸巢效應，移植的間充質干細胞在創面愈合中的原位貢獻十分有限。

圖4 hADMSCs-CMLP 對成纖維細胞遷移的影響的觀察結果（A：凍干粉對細胞增殖無影響；B：成纖維細胞遷移在活細胞工作站中 24 h 觀察圖，50% hADMSCs-CMLP 明顯能促進成纖維細胞遷移；C：細胞遷移統計圖，有顯著性差異，n = 3；D：Transwell 驗證細胞遷移 24 h 觀察圖；E：Transwell 結晶紫染色；F：Transwell 驗證細胞遷移統計圖，n = 3；nsP ＞ 0.05，*P ＜ 0.001）Figure 4 Fibroblast migration observation (A: Conditioned medium lyophilized powder had no effect on cell proliferation; B: Fibroblast migration was observed in live cell imaging system for 24 h. 50% hADMSCs-CMLP significantly promoted fibroblast migration; C: Statistical graph of cell migration with significant difference, n = 3; D: 24 h of cell migration was verified by transwell. There was less cell migration in the control group, and the addition of 50% hADMSCs-CMLP fibroblast migration increased; E: Transwell crystal violet staining; F: Statistical graph of cell migration was verified by transwell, with significant difference, n = 3, nsP ＞ 0.05，*P ＜ 0.001)

外泌體是一種細胞主動分泌的大小均一、直徑為 50 ～ 150 nm 的脂質雙分子層結構囊泡，可由樹突細胞、淋巴細胞、成纖維細胞、間充質干細胞和腫瘤細胞等多種不同類型細胞釋放。外泌體含有多 種 RNA、蛋白質、脂質、DNA 等物質。脂肪干細胞可通過旁分泌途徑分泌外泌體，在多種組織間起到信息傳遞作用，外泌體經凍干可長期保存，安全可靠[20]。脂肪干細胞條件培養基含大量外泌體和細胞因子，經干細胞條件培養基處理后的 HFF-1 細胞纖維粘連蛋白、彈性蛋白、I 型膠原蛋白顯著升高，MMP-1 mRNA 水平表達顯著降低。Deng 等[21]研究也證實脂肪干細胞條件培養基能促進細胞外基質的合成。早在 2016年國際細胞治療協會就建議免疫功能檢測作為間充質干細胞臨床試驗的放行標準[22]。現在普遍認為 MSC 類細胞藥物的主要作用是由間充質干細胞的旁分泌及間充質干細胞驅動的內源性組織修復。間充質干細胞分泌的生長因子和細胞因子具有促炎和抗炎的作用，在治療慢性炎癥性疾病有巨大潛力。間充質干細胞條件培養基在治療效果方面持續更長[23]，其在系統性硬化癥 和克羅恩病中具有抗炎、抗纖維化和促血管生成的潛力，這些功能可能與 MSCs 分泌的 IDO、PGE2、HLA-G、TGF-β、HGF、IL-10 和 IL-1β 有關[24]。Pacienza 等[25]證實間充質干細胞來源的外泌體有顯著抗炎效果，能夠顯著抑制 LPS 刺激巨噬細胞分泌的 IL-6 和 TNF-α 細胞因子表達水平。我們提取的脂肪干細胞凍干粉也有相同的效果。

圖5 HFF-1 細胞外基質相關蛋白基因表達檢測結果（A：纖連蛋白；B：彈性蛋白；C：I 型膠原蛋白；D：基質金屬蛋白酶-1；*P ＜ 0.001）Figure 5 HFF-1 extracellular matrix related protein gene expression results (A: Fibronectin; B: Elastin; C: Collagen I; D: Matrix metalloproteinase-1; *P ＜ 0.001)

圖6 hADMSCs 條件培養基凍干粉抑制 Raw264.7 細胞炎癥因子的分泌檢測結果（A：TNF-α 檢測結果；B：IL-6 檢測結果；*P ＜ 0.01，**P ＜ 0.001）Figure 6 hADMSCs conditioned medium lyophilized powder inhibited the secretion of inflammatory cytokines in Raw264.7 cells (A: TNF-α detection results; B: IL-6 detection results; *P ＜ 0.01, **P ＜ 0.001)

脂肪間充質干細胞條件培養基凍干粉在促進細胞遷徙、促進細胞外基質合成和抗炎方面有顯著效果，并且安全性和便捷性要優于間充質干細胞本身，在皮膚創傷修復和慢性炎癥性疾病中有廣闊的應用前景。條件培養基受限于間充質干細胞的狀態，其分泌物組分存在動態變化，其成分分析、組分動態變化、分子機制、條件培養基的制備等方面 的研究還有待深入[26]，另外不同來源的外泌體具有多種活性，包括抗炎、抗免疫、抗凝血、促血管生成和致瘤，也需要進行一系列的檢測[25]。