人淋巴細胞國家參考品的研制

胡澤斌，高飛，曲守方，孫彬裕，楊振，孫晶，黃杰

淋巴細胞是正常機體免疫功能最重要的一大細胞群，按其發生遷移、表面分子和功能的不同可分為 T 細胞、B 細胞和自然殺傷（NK）細胞。T 細胞亞群與細胞免疫功能有關，B 細胞與體液免疫功能有關，NK 細胞與非特異免疫功能有關。外周血 T、B 和 NK 淋巴細胞亞群檢測已成為臨床醫學中最常用的檢查項目之一。對于評價機體的免疫功能，診斷與監測肺部疾病、艾滋病、惡性腫瘤、器官移植等具有重要意義[1-3]。目前臨床檢測中常用流式細胞法（flow cytometry，FCM）對淋巴細胞亞群的表型和數量進行分析[1,4]。

流式細胞法分析是一種在大分子水平上對單細胞或其他生物粒子進行定量分析的檢測手段，可以在短時內高速分析大量細胞或生物粒子的物理和化學特征參數。流式細胞分析主要靠流式細胞儀和各種特定發光物質標記的單克隆抗體試劑組合檢測來實現[4]。

目前 T/B/NK 淋巴細胞亞群檢測試劑主要有兩類：單一的單克隆抗體試劑和組合類的單克隆抗體試劑盒。近年來，涉及流式細胞分析對淋巴細胞亞群進行檢測的企業越來越多，不同廠家的產品在抗體原材料克隆號和熒光素的選擇、試劑組合方式，是否有匹配的溶血素、適用機型及配套自動分析軟件或手動分析軟件、產品絕對計數的方式（體積法/微球法）和成品質量控制等方面有所差異，導致檢測結果的準確性也受到影響[5-8]。如何公正客 觀地衡量同一項目不同廠家試劑的質量優劣？目前國內外尚無此類標準物質，臨床操作或實驗室質控通常使用進口的不同廠商的商品化質控血，不僅價格昂貴、購買費時費力、有效期較短，而且還缺乏標準化的賦值結果[9-12]。為解決這些問題，就需要研制基質效應小、均一性和穩定性良好的人淋巴細胞國家標準物質，不僅可填補國內市場的空白，降低使用成本，還可以提高檢驗結果的準確性和互認度，以及保障此類體外診斷試劑檢驗檢測、審評和監管的需要。因此根據實際調研情況和探索實驗結果，本科室開展了人淋巴細胞國家參考品的研制工作。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 冷凍離心機購自德國 Eppendorf 公司；倒置顯微鏡購自上海光學儀器六廠；生物安全柜購自江蘇蘇凈集團有限公司；分裝機購自保定蘭格恒流泵有限公司；凍干機購自寧波新芝生物科技有限公司；電子天平購自福州華志科學儀器有限公司；移液器購自美國 Thermo 公司；渦旋儀購自上海醫大儀器廠；FACS Calibur 和 Canto II 流式細胞儀由美國 BD 公司提供；ACEA Novocyte 流式細胞儀由艾森生物提供；Navios 流式細胞儀由北京曠博生物技術股份有限公司提供。

1.1.2 試劑 人淋巴細胞分離液為深圳市達科為 生物工程有限公司產品；PBS 溶液為美國 BD 公司產品；細胞固定液和凍干保護劑為巴德生物科 技有限公司產品；淋巴細胞亞群檢測試劑盒和絕 對計數管為美國 BD Biosciences 公司產品；6 色 CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PerCP-Cy5.5/CD4- PC7/CD19-APC/CD8-APC-Cy7 熒光單克隆抗體試劑盒（流式細胞儀法）和絕對計數微球為北京同生時代公司產品；ACEA CD3/CD16+56/CD45/CD4/ CD19/CD8 淋巴細胞亞群檢測試劑盒為艾森生物公司產品。

1.2 方法

1.2.1 人淋巴細胞國家參考品候選品的制備 收集健康志愿者的新鮮外周血白細胞，用 PBS 稀釋后緩慢加入人淋巴細胞分離液上方，300 × g 離心 30 min。小心吸取離心后的中間白細胞層，即得到外周血單個核細胞（PBMCs）。將 PBMCs 均勻重懸于細胞固定液，于 2 ～ 8 ℃ 靜置過夜。之后離心去除細胞固定液，加入適量凍干保護液重懸細胞。每支西林瓶按 1 ml 進行分裝，分裝后的細胞進行凍干，制備成人淋巴細胞國家參考品候選品。

1.2.2 人淋巴細胞國家參考品候選品液體瓶間分裝均勻性檢驗 按照國家標準 GBT15000.3-2008《標準樣品工作導則⑶標準樣品定值的一般原則和統計方法》、CNAS-GL03《能力驗證樣品均勻性和穩定性評價指南》及《一級標準物質技術規范》進行。在候選品制備過程中溶液分裝的初始、中 間、終結階段進行隨機取樣，各隨機抽樣 10 支，共 30 支。采用精密度良好的電子天平對抽取樣本進行稱重測定。

1.2.3 人淋巴細胞國家參考品候選品凍干瓶間均勻性檢驗 隨機抽取凍干后的候選品 24 支，采用流式細胞法，使用 BD 淋巴亞群檢測試劑盒以免 洗方案進行細胞染色后，在 BD FACS Calibur 流式細胞儀上進行 T/B/NK 淋巴細胞表面抗原百分比檢測和數據收集。所獲取的 FCS 文件，使用 FlowJo 軟件分析：CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD16+CD56+、CD3-CD19+細胞亞群的百 分數。

1.2.4 人淋巴細胞國家參考品候選品的基質效應評估 參考衛生行業標準 WS/T356-2011《基質效應與互通性評估指南》進行基質效應評估。收集至少 20 份健康人的新鮮抗凝全血臨床樣本，標記 BD 公司的 4 色 T/B/NK 檢測抗體，使用 BD 公司的絕對計數管，采用流式細胞法在兩種檢測平臺 （BD FACS Calibur 和 BD Canto II）上同時對選定的新鮮臨床樣本和標準物質候選品進行 T/B/NK 淋巴細胞亞群的百分比和絕對計數的檢測和分析，利用兩種平臺測定臨床樣品的結果建立數學關系（回歸）。以臨床樣本測定結果做散點圖，y 軸為以 BD FACS Calibur 測定的結果，x 軸為 BD Canto II 測定的結果，進行線性相關性分析。

1.2.5 人淋巴細胞國家參考品候選品穩定性實 驗 候選標準物質采用不同時間點放入，最終時間點取出，統一檢測，每個溫度和時間點放入 2 ～ 3 支候選品；采用同一批號的試劑盒、同一臺測 試儀器、同一批實驗人員在同一天內完成測試， 每個樣本測定 2 次。候選品在加熱 37 ℃、室溫 （20 ～ 25 ℃）兩種溫度條件下，分別放置 3、7、14、21、30 d，以 -20 ℃ 保存的候選品為對照，使用 CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PerCP-Cy5.5/ CD4-PC7/CD19-APC/CD8-APC-Cy7 熒光單克隆抗體試劑盒（流式細胞儀法）和絕對計數微球試劑盒（流式細胞法）在 Naviuos 流式細胞儀上對以上穩定性樣本進行 T/B/NK 淋巴細胞亞群的百分比和絕對計數的分析測定。

1.2.6 人淋巴細胞國家參考品候選品復溶穩定性實驗 將 5 支候選標準物質復溶后放置2 ～ 8 ℃ 冷藏，在 0、2、6 h 3 個時間點分別取出 50 μl，標記 6 色 T/B/NK 淋巴細胞亞群抗體試劑在流式細胞儀上進行百分比和絕對計數的分析測定。使用 GraphPad Prism 軟件，利用秩和檢驗對所得數據進行統計分析。

2 結果

2.1 候選品分裝均勻性檢驗結果

液體分裝過程的前中后段隨機抽取 30 瓶，每瓶稱重 1 次，結果如表 1 所示，30 瓶間液重總體變異系數的 CV 值僅為 0.08%，說明分裝瓶間均勻性良好。

2.2 T/B/NK 細胞表面抗原凍干均勻性檢驗結果

隨機抽取凍干后的候選品 24 支，每支檢測 T/B/NK 淋巴細胞百分比 3 次，然后求平均值，實驗操作和數據分析亞群需參照 WS/T 360-2011《流式細胞術檢測外周血淋巴細胞亞群指南》。結果如表 2 所示，24 支瓶間 CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、CD16+56+淋巴細胞百分比的總體變異系數 CV 值分別僅為 0.37%、1.13%、0.99%、2.24%、2.24%，說明凍干瓶間均勻性良好。

表1 候選品分裝稱重數據Table 1 Weighing data of sub-packed candidates

表2 候選品凍干后 T/B/NK 細胞表面抗原檢測數據Table 2 Detection data of T/B/NK cell surface antigen after lyophilization

表3 穩定性研究實驗結果Table 3 The results of stability study

2.3 人淋巴細胞國家參考品候選品穩定性實驗結果

凍干候選品在室溫和 37 ℃ 條件下，放置不同時間之后，與 -20 ℃ 保存的標準品候選品（作為 0 天對照）進行 T/B/NK 淋巴細胞亞群的百分比和絕對計數的分析比較，效價均在 0.89 ～ 1.01 之間。結果表明，候選品在室溫條件和 37 ℃ 條件下保存 30 d 內非常穩定，見表 3 和表 4。

表4 不同實驗條件與 -20 ℃ 的效價比較Table 4 Comparison the titer of different experimental conditions with -20 ℃

圖1 復溶穩定性研究實驗結果Figure 1 The stability results of dissolved candidates

圖2 互通性實驗結果（A：CD3Abs；B：CD4Abs；C：CD8Abs）Figure 2 The results of commutability evaluation (A: CD3Abs; B: CD4Abs; C: CD8Abs)

2.4 復溶穩定性結果

秩和檢驗對復溶穩定性實驗結果進行數據統計分析，結果如圖 1 所示，復溶 2 h 和 0 h 相比，T/B/NK 的百分比結果并無顯著性差異，P 值均大于 0.05，復溶 6 h 和 0 h 相比，除 NK 細胞（CD16+CD56+）的 P 值為 0.02 外，其他 T/B 細胞的 P 值均大于 0.05，說明候選品復溶后在 2 ～ 8 ℃ 條件下可保存至少 2 h。

2.5 互通性評估

以 25 份臨床樣本 CD3+、CD4+、CD8+各亞群淋巴細胞絕對數量的測定結果做散點圖，y 軸 為以 BD FACS Calibur 測定的結果，x 軸為 BD Canto II 測定的結果，進行線性回歸分析。樣本回歸曲線及其 ±95% 上下限區間以及相關系數 r 值，如圖 2 所示。圖中以虛線標示 ±95% 上下限區間，綠色散點代表 4 支國家參考品候選品在此 2 個流式平臺測得的數值。結果表明，CD3+、CD4+、CD8+細胞絕對數量在此 Calibur 和 Canto II 平臺的互通性良好。

3 討論

適用于流式細胞法的 T/B/NK 淋巴細胞亞群檢測試劑在臨床上主要用于評價機體的免疫功能、診斷與監測惡性腫瘤、器官移植、免疫性疾病如 艾滋病、原發性免疫缺陷病、自身免疫病等，尤其是 CD4 陽性的淋巴細胞的絕對數量和 CD4/CD8 比值監測還是艾滋病患者用藥指導的一個重要指 標[13-14]。制定統一的國家標準品有助于使各實驗室間的檢測結果具有可比性，實現檢測標準化。將健康人外周血淋巴細胞進行凍干之后作為標準物質具有易于操作標準化、方便客戶使用、利于運輸保存的優勢，相比傳統液氮深低溫保存的細胞更適合作為標準物質[15-17]。

本文通過對標準物質瓶間均勻性、穩定性分析和互通性評估的實驗研究，此批凍干型人淋巴細胞國家參考品候選品滿足作為國家標準物質的要求，可用于人 T/B/NK 淋巴細胞亞群檢測試劑的準確性評價。