差速離心法聯合聚乙二醇6000富集脂肪間充質干細胞來源的外泌體

李萍，王靜，沈美萍，戴成祥，李蘇克，劉必佐

干細胞是胚胎或成體個體中存在的可以持續自我更新，并具有多向分化能力的細胞，按照分化潛力的大小，干細胞分為全能干細胞、多能干細胞及單能干細胞。其中，間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）是一種多能干細胞，是來源于中胚層的體細胞，廣泛存在于骨髓、脂肪、胎盤、新生兒臍帶等組織中[1]。間充質干細胞在促進損傷組織修復，抗炎調節免疫等方面具有重要作用。其中脂肪間充質干細胞取材方便，不存在倫理問題，并且已經在治療膝骨關節炎等疾病方面表現出良好的療效[2]，呈現出巨大的醫療潛力而備受關注。

目前，間充質干細胞促進組織修復和拮抗炎癥的作用機制還不是十分明確，大量研究表明，除了依靠自我增殖和分化，間充質干細胞的大部分功能是通過分泌蛋白與外泌體等囊泡與其他細胞相互作用進行的[3-4]。外泌體是從細胞中釋放出來的病毒大小的膜囊[5]。它是一種由活細胞通過內吞-融合-外排等一系列生物學機制產生，并通過主動分泌的方式排出細胞膜外的脂質雙分子層膜囊，直徑 ＜ 150 nm[6]。它們含有介導細胞間通訊的蛋白質和核酸物質[7-9]，如脫氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）、微小 RNA（miRNA）等。外泌體還包含主要組織相容性復合體（MHC）I 和 II[10]；四跨膜蛋白超家族，如 CD81、CD82、CD63、CD9[11-12]和腫瘤易感基因 101（TSG101）等[13]。

目前富集外泌體的方法包括差速離心法、超濾法及沉淀法等，其中最常用的是差速離心法[14]。所謂差速離心法，就是通過逐步增加離心力（比較典型的就是離心力達到 100 000 × g，甚至更高）去除較小的不需要的細胞碎片和較大的囊泡亞群[15-16]。差速離心法的難點是濃縮和純化所需的費用巨大和處理時間較長，特別是藥物研發實驗階段需要濃縮大量的培養基來提取囊泡蛋白。超濾法是基于大小對溶液中的囊泡進行篩選，大量提取時對設備有較高要求。沉淀法是目前大多數外泌體分離試劑盒采用的方法，采用多種助沉降的試劑組分將蛋白因子和囊泡沉聚下來，再結合超濾或層析法篩選得到目標大小的囊泡[17]。然而試劑盒處理的樣本體積有限，且沉淀溶液采用的試劑成分復雜，不適合囊泡 的后續醫療用途。所以我們希望探索一種通過單一成分將外泌體進行富集并純化的方法，以滿足生產需要。聚乙二醇（PEG）是由重復的乙二醇單元[-(CH2CH2O)n]組成的聚合物，是大部分沉淀法試劑盒采用的核心原料。PEG 也是藥物傳遞系統的 首選聚合物，因其良好的可塑性和安全性而備受 推崇：它是任何配方開發過程中所選用輔料的首 選[18]。聚乙二醇溶液用于病毒的濃縮和純化已經有 50 多年的歷史[19]。Rider 等[20]發現，終濃度 8% 的 PEG 6000 沉淀結合超離清洗相較于差速離心法，分離 293T 外泌體的得率提高，純度也沒有受到太大影響。而我們由于使用的是脂肪間充質細胞，其大小分布可能不同，且培養基成分也不同，結合文獻中關于使用 PEG 富集大腸桿菌包涵體的方法，重新實驗確定最佳的沉淀濃度，進一步優化外泌體富集的方法[21]，為我們的商用外泌體分離提供一種廉價有效的替代方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與耗材 人脂肪經知情同意情況下獲得，符合倫理要求。超速離心管購于美國貝克曼公司；聚乙二醇 6000（PEG 6000）和 PKH-67 購于美國 Sigma 公司；BCA 試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司；抗體 CANX、CD63、CD81 和 TSG101 均購于美國 Thermo 公司；蛋白預制膠和 SDS 預制膠電泳緩沖液均購于上海天能科技有限公司；CD73-FITC、CD90-PerCP-Cy5.5、CD105-APC、CD34-PE、CD45-PE、HLA-DR-FITC 均購于美國 Biolegend 公司；成脂、成骨、成軟骨誘導分化培養基購于美國 Sciencell 公司；人血小板裂解物 EliteGro 購于美國 Elitecell 公司；miRNeasy Mini Kit 購于美國 Qiagen 公司；TaqMan?Advanced miRNA Assays 和 Exo-spin columns 購于美國 Thermo 公司。

1.1.2 儀器 Optima XPN-90 超速離心機購于美國貝克曼公司；FACS Canto II 分析型流式細胞儀購于 BD 公司；ZetaView 納米顆粒追蹤分析儀購于德國 Particle Metrix 公司；實時熒光定量 PCR 儀、NanoDrop 和 Evos 熒光顯微鏡購于美國 Thermo 公司。

1.2 方法

1.2.1 hAdMSC 的分離培養 無菌條件下在 50 ml 脂肪懸液中，加入 I 型膠原酶，37 ℃ 恒溫 消化 0.5 h，待組織發白，終止消化。將消化液室溫 500 × g 離心 10 min。離心結束后懸液分為三層，吸去上中兩層，保留最下層。最下層懸液使用 PBS 進行重懸，500 × g 離心 10 min。收集細胞沉淀加入含 5% EliteGro 的 α-MEM 培養細胞，置于 37 ℃、5% CO2培養箱內進行培養。待細胞達到約 90% 融合度，使用 0.25% 胰酶進行消化傳代，接種密度為 1 × 104/cm2，每 2 天換一次液。

1.2.2 hAdMSC 表面抗原鑒定 收集 P3 代細胞懸液，1500 r/min 離心 5 min，棄上清（留 100 μl 左右液體）。加抗體（CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、HLA-DR），避光 20 min 孵育。每管加 1 ml PBS，1500 r/min 離心 5 min，棄上清。加 500 μl PBS，樣品用于上機。

1.2.3 hAdMSC 三向分化 取 P3 代 hAdMSC 接種于 6 孔板中，細胞密度為 1 × 105個/cm2，于 37 ℃、5% CO2培養箱中培養，待細胞融合度達到 60% 左右，棄去原培養基，分別更換為成脂、成骨、成軟骨誘導分化培養基，誘導分化培養基的使用方法見 Sciencell 誘導培養基的使用說明書。

1.2.4 培養基去除外泌體 將 EliteGro 按照體積比 15% 添加至 α-MEM 基礎培養基中，120 000 × g 離心 6 h。離心完畢，使用移液管從上層開始輕吸收取培養基，至離心管底部 0.5 cm 處的培養基棄去。使用 α-MEM 基礎培養基，將超速離心收取的培養基稀釋，兩者體積比為 2:1，稀釋后 4 ℃ 儲存。

1.2.5 PEG 沉淀法收集外泌體 P3 代 hAdMSC 90% 融合后，棄去完全培養基，使用去除外泌體的培養基于 37 ℃、5% CO2條件孵育 48 h，并收集細胞培養上清液，3 000 × g 離心 15 min，吸取上清液，去除沉淀；10 000 × g 離心 0.5 h，吸取上清液，去除細胞碎片。離心后的培養基等體積分成 4 份，分別添加含 100 mmol/L NaCl 的 8%、12%、16% 和 20% 的 PEG 6000，4 ℃ 過夜；3200 × g，4 ℃ 離心 1 h，去上清，使用 PBS 重懸沉淀； 120 000 × g 離心 70 min，去上清，使用 PBS 重懸離心管底部收集沉淀。篩選最適濃度 PEG 6000 做后續與差速離心法獲取外泌體的比較實驗。

1.2.6 差速離心法收集外泌體 P3 代 hAdMSC 90% 融合后，棄去完全培養基，使用去除外泌體的培養基于 37 ℃、5% CO2條件孵育 48 h，并收集細胞培養上清液，3000 × g 離心 15 min，吸取上清液，去除沉淀；10 000 × g 離心 0.5 h，吸取上清液， 去除細胞碎片；120 000 × g 離心 70 min，去上清，使用 PBS 重懸離心管底部沉淀；120 000 × g 離心 70 min，去上清，使用 PBS 重懸并收集離心管底部沉淀。

1.2.7 Western blot 檢測 使用加過蛋白酶抑制劑的 NP-40 裂解外泌體。使用 BCA 試劑盒檢測外泌體蛋白濃度，剩下的樣品添加 4 × loading buffer，95 ℃ 煮 5 min。樣品分別以同蛋白量或者同體積上蛋白預制膠，80 V 跑 0.5 h，120 V 跑 1 h。跑完膠，轉 PVDF 膜，恒流 250 mA，轉 1.5 h。轉膜完畢，封閉 0.5 h。使用一抗（CD63、CD81、TSG101）（1:1000）添加至封閉液中，4 ℃ 孵育過夜。使用 TBST 洗膜，10 min/次，洗 3 次，使用對應種屬的二抗（1:3000），室溫孵育 3 h。使用 TBST 洗膜，10 min/次，洗 3 次，HRP 顯色。

1.2.8 外泌體粒徑濃度（NTA）檢測 以去離子水清洗 ZetaView 納米顆粒追蹤分析儀樣本池。儀器使用聚苯乙烯微球校準。以 PBS 清洗樣本池。樣本以 PBS 進行稀釋并檢測。取待測樣品 10 ～ 20 μl 滴在碳網上，靜置 1 min，讓待測顆粒吸附在碳膜上，用濾紙吸去液滴，然后取 2% 醋酸雙氧鈾滴在碳網上染色 1 min，用濾紙吸去染液，干燥后，在 TecnaiTMG2 Spirit Bio TWIN 電鏡平臺上觀察樣本形態。

1.2.9 miRNA qRT-PCR 按照 1.2.5 和 1.2.6 所述分離出的外泌體，各取 40 μl，使用 miRNeasy Mini Kit 分離 miRNA，使用 NanoDrop 定量，統一用量為 10 ng，進行后續反轉實驗。使用 TaqMan?Advanced miRNA Assays 反轉錄為 cDNA，-20 ℃ 保存。由于 hsa-miR-93-5p 在血清和血漿中能夠穩定表達[22]，因此使用 hsa-miR-93-5p 作為內參。qRT-PCR 測定外泌體中 miR-133b、miR-124-3p 的 miRNA 的表達。PCR 擴增條件：95 ℃，20 s；40 個 PCR 循環（95 ℃，1 s；60 ℃，20 s）。

1.2.10 外泌體攝取實驗 按照 1.2.5 和 1.2.6 所述分離出的外泌體，各取 3 μg，使用 PKH-67 進行熒光標記，使用 Exo-spin columns 對標記完畢 的外泌體進行過柱洗滌。將成纖維細胞按照 1 × 104個/cm2接種于 48 孔板，培養 24 h。將使用 PKH-67 標記后的外泌體加入孔板中，20 h 后在免疫熒光顯微鏡下鏡檢。

1.3 統計學處理

使用 GraphPad Prism 5.0（La Jolla，USA）對數據進行分析。

2 結果

2.1 hAdMSC 表面抗原鑒定

流式檢測 P3 代 hAdMSC 表面抗原標志物，結果顯示 CD34-/CD45-/HLA DR-陰性細胞數百分比為 0.98%，表達特異性抗原 CD73+、CD90+、CD105+陽性細胞數分別為 99.0%、100.0%、100.0%（圖 1），符合國際細胞治療協會定義的 MSCs 標志性抗原表達鑒定標準。

2.2 hAdMSC 三向分化能力鑒定

hAdMSCs 經成脂誘導培養 21 d，油紅 O 染色后觀察到細胞的胞漿出現大小不等的紅色脂滴（圖 2B）；hAdMSCs 經成骨誘導培養 16 d，茜素紅 S 染色后出現大量橘色沉淀顆粒，有明顯的“礦化”結節（圖 2C）；hAdMSCs 成軟骨誘導培養 28 d，阿利新藍染色后觀察到細胞基質和纖維呈藍紫色（圖 2D）。表明本研究獲得的 hAdMSCs 具有很好的成脂、成骨和成軟骨分化潛能。

2.3 PEG 沉淀法和差速離心法收集外泌體

將分別添加含 100 mmol/L NaCl 的 8%、12%、16% 和 20% PEG 6000 的分離出的外泌體按照相同的總蛋白量上樣，進行 CD63 鑒定（圖 3A），發現 12% PEG 6000 和 16% PEG 6000 分離出的外泌體的 CD63 表達量最高，本著盡量減少終樣品中 PEG 殘留的原則，我們在后續實驗中使用 12% PEG 6000 對外泌體進行沉淀分離。

將使用 12% PEG 6000 分離 200 ml 培養基所獲得的外泌體和超速離心分離 350 ml 培養基所獲得的外泌體進行蛋白標志物鑒定、電鏡分析、NTA 檢測（圖 3）。按照同體積和同蛋白量上樣進行 CANX、TSG101 和 CD81 鑒定。其中，無論是同體積還是同蛋白做 Western blot 鑒定，PEG 6000 分離出的外泌體的目的蛋白量都遠大于差速離心法分離出的外泌體的量。電鏡結果顯示差速離心（圖 3E）和 PEG 沉淀（圖 3F）所得外泌體均為茶托樣的雙層膜結構。NTA 結果顯示，PEG 6000 分離出的外泌體的濃度為 1.35 × 108個/ml，差速離心分離出的外泌體的濃度為 6.8 × 107個/ml；PEG 6000 分離出的外泌體粒徑大小為（126.6 ± 2.09）nm，差速離心分離出的外泌體的粒徑大小為（137.8 ± 3.8）nm。實驗結果表明，12% PEG 6000 分離出的外泌體產量比差速離心分離出的產量高得多，且 PEG 并不影響外泌體的粒徑大小。

圖1 hAdMSCs 表面標志性抗原流式鑒定結果（A：總細胞散點分布；B：陰性對照；C ～ E：CD73+、CD90+、CD105+ 細胞比例）Figure 1 Phenotype characterization of hAdMSCs through flow cytometry (A: Total particles scatter diagram; B: Negative control; C-E: CD73+, CD90+, CD105+ cells ratio)

圖2 hAdMSCs 成脂、成骨、成軟骨分化潛能鑒定（A：正常 hAdMSCs 細胞形態；B：油紅 O 染色；C：茜素紅 S 染 色；D：阿利新藍染色；標尺：100 μm）Figure 2 Adipogenic, osteogenic and chondrogenic differentiation capacities of hAdMSCs (A: Normal hAdMSCs cell morphology; B: Oil red O staining; C: Alizarin red S staining; D: Alcian blue staining; Scale: 100 μm)

2.4 PEG 6000 和差速離心分離出的外泌體的 miRNA 的表達情況

使用 qRT-PCR 檢測差速離心法和 PEG 6000 沉淀法分離出的外泌體中 miR-133b 和 miR-124-3p 的表達情況（引物序列見表 1）。從實驗數據來看（圖 4），PEG 6000 沉淀法獲得的外泌體表達 miR-133b 和 miR-124-3p 的量比差速離心法獲得的外泌體多。

2.5 成纖維細胞攝取外泌體

使用 PKH-67，將差速離心法分離出的外泌體和 PEG 6000 分離出的外泌體進行標記（圖 5B 和圖 5C）。使用成纖維細胞攝取兩種分離方法的外泌體。從圖 5 可以發現，PEG 6000 分離出的外泌體并不影響成纖維細胞對外泌體進行攝取，而且在相同蛋白量（3 μg）的條件下，PEG 6000 富集的外泌體要比差速離心法分離出的外泌體更多。

3 討論

在此次研究中，使用 12% PEG 6000 分離 P3 代 hAdMSC 產生的外泌體。該方法分離出的外泌體與金標準差速離心法分離出的外泌體高度相似，且產量遠勝于差速離心法。hAdMSC 來源的外泌體表達四跨膜蛋白超家族的 CD63 和 CD81 以及腫瘤易感基因 TSG101，不表達內質網來源蛋白，如鈣連接蛋白（calnexin，CANX）[23]。使用不同濃度的 PEG 6000 進行 hAdMSC 來源的外泌體分離，可以發現，12% 和 16% 濃度的 PEG 所分離出來的外泌體 CD63 表達量最多。但是，考慮到 PEG 的非降解性和免疫原性[24-25]，后續實驗使用 12% PEG 6000 進行分離外泌體。

圖3 Western blot 和 NTA 檢測 PEG 沉淀法和差速離心法收集的外泌體的產量[A：M：Marker；1 ～ 4：分別為 8%、12%、16% 和 20% PEG 6000 分離出的外泌體的 CD63 表達量（同蛋白量上樣）；B：M：Marker；1：hAdMSC；2 和 4：差速離心分離的外泌體的蛋白表達情況；3 和 5：12 % PEG 6000 分離出的外泌體的蛋白表達情況；C：NTA 檢測 PEG 6000 和差速離心分離出的外泌體粒子濃度，*P ＜ 0.05；D：NTA 檢測 PEG 6000 和差速離心分離出的外泌體粒徑大小；Error bars，S.D.；E：差速離心法分離出的外泌體透射電鏡圖；F：PEG 6000 分離出的外泌體透射電鏡圖]Figure 3 Western blot and NTA detection for exosome yield collected by PEG precipitation and ultracentrifugation [A: M: marker; 1-4: The CD63 expression of exosomes isolated respectively from 8% PEG 6000, 12% PEG 6000, 16% PEG 6000 and 20% PEG 6000 (the same quantity of the protein); B: M: marker; 1: hAdMSC; 2 and 4: The protein expression of exosomes isolated by differential centrifugation; 3 and 5: The protein expression of exosomes isolated from 12% PEG 6000; C: NTA was used to detect the concentration of exosomes separated by PEG 6000 and differential centrifugation, *P ＜ 0.05; D: NTA was used to detect the size of exosomes separated by PEG 6000 and differential centrifugation; error bars, S.D.; E: TEM of exosomes isolated by differential centrifugation; F: TEM of exosomes isolated by PEG 6000]

表1 miRNA qRT-PCR 引物序列Table 1 miRNA primer sequences for qRT-PCR

圖4 差速離心法和 PEG 6000 沉淀法分離出的外泌體的 miRNA 表達量（*P ＜ 0.05）Figure 4 miRNA expression of exosomes isolated by ultracentrifugation and PEG 6000 precipitation (*P ＜ 0.05)

圖5 成纖維細胞攝取差速離心法和 PEG 6000 沉淀法分離出的外泌體（A：沒有攝取外泌體的成纖維細胞；B：成纖維細胞攝取 3 μg 差速離心法分離的外泌體；C：成纖維細胞攝取 3 μg PEG 6000 分離出的外泌體；藍色：Hochest 染色的細胞核；綠色：PKH-67 標記的外泌體；標尺：100 μm）Figure 5 Fibroblasts uptake exosomes isolated by ultracentrifugation and PEG 6000 precipitation (A: Fibroblasts uptake no exosome; B: Fibroblasts uptake 3 μg exosomes isolated by differential centrifugation; C: Fibroblasts uptake 3 μg exosomes isolated by PEG 6000; Blue: Hochest; Green: PKH-67 labeled exosomes; Scale: 100 μm)

通過 Western blot 可以發現，不管是同體積上樣還是同蛋白量上樣，PEG 6000 分離出的外泌體 CD81 和 TSG101 的蛋白表達量都高于差速離心法，且兩種方法分離出的外泌體都不表達 CANX。從粒徑大小和濃度來看，PEG 6000 捕獲的囊泡數量更多；從 miRNA 水平和成纖維細胞攝取外泌體的情況來看，PEG 6000 并不影響外泌體的 miRNA 的表達水平以及成纖維細胞攝取外泌體的能力，相反效果更好。

PEG 6000 分離法與差速離心法相比具有很大的優勢，它所分離出的外泌體的純度和數量都超過金標準，而且 PEG 6000 遠比商業外泌體分離試劑更便宜。同時，PEG 6000 分離法也可以很容易地被改變一些參數用于其他樣品的分離。比如，通過添加超濾步驟或者施加較大或較小的離心力，可以獲得較大或較小的顆粒。目前，細胞外囊泡作為疾病的生物標志物受到了廣泛的關注，因此 PEG 6000 法也可以被用于臨床。有數據表明，在某些情況下，用聚乙二醇孵育 1 h 就足以濃縮囊泡[26]。如果不需要高純度的制劑，臨床樣品可以在 1 h 左右被檢測。