匹伐他汀對高尿酸血癥大鼠血尿酸、炎癥因子、血管內皮功能的影響①

尤 楊 戚國慶 高宏陽 楊志瑜 李 柳 趙紅亮

(河北醫科大學第一醫院心內三科，石家莊 050031)

隨著生活方式的改變，高尿酸血癥的發病率不斷升高，高尿酸血癥和高血壓、高血脂、肥胖、胰島素抵抗等傳統心血管疾病的危險因素關系密切，近來研究發現高尿酸血癥也是心血管疾病的獨立危險因素，若高尿酸血癥未得到有效控制，則增加心血管疾病的發生風險，因此探討如何防治高尿酸血癥具有重要意義。高尿酸血癥和其他相關疾病的病理機制復雜，其中炎癥反應和血管內皮功能損傷在高尿酸血癥引起心血管疾病中發揮重要作用，尿酸進入平滑肌細胞可導致細胞增殖，激活單核細胞趨化蛋白-1(VCAM-1)，導致炎癥細胞因子合成增多，造成組織損傷[1]；尿酸合成過程中產生的超氧陰離子可滅活內皮舒張因子一氧化氮(NO)，從而損傷內皮功能[2]。匹伐他汀為第三代他汀類藥物，具有較強的降低低密度脂蛋白和膽固醇的作用，在調節血脂、抑制炎癥反應和改善內皮功能中發揮重要作用[3-5]。本文對匹伐他汀對高尿酸血癥大鼠血尿酸、炎癥因子、血管內皮功能的影響進行研究，探討匹伐他汀是否通過抑制炎癥反應和改善內皮功能發揮對高尿酸血癥的防治作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 健康、清潔級、8周齡、體質量190～210 g、SD大鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK(滬)2009-3。

1.1.2藥品與試劑 匹伐他汀(北京雙鸛藥業公司，批號20180621)，鹽酸乙胺丁醇(四川天臺山制藥公司，批號20181005)，酵母膏(北京奧博星生物技術有限公司，批號20170814)，尿酸、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-6、NO ELISA試劑盒(美國Sigma公司)，蘇木素、伊紅染液(國藥集團化學試劑有限公司)，SP免疫組化染色試劑盒(美國Invitrogen公司)，兔抗鼠血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)單克隆抗體(美國Santa-Cruz公司)。

1.2方法

1.2.1動物分組 將60只大鼠根據隨機數字表法分為對照組(C組)、模型組(M組)、匹伐他汀低劑量組(LP組)、匹伐他汀高劑量組(HP組)，每組15只。

1.2.2建立高尿酸血癥大鼠模型 除C組外，其他各組均建立高尿酸血癥模型，具體方法為：將鹽酸乙胺丁醇12.5 mg/(kg·d)+酵母膏15 g/(kg·d)+適量蒸餾水配制成0.8 ml溶液，1次/d，灌胃，共6周，大鼠2次空腹血尿酸≥420 μmol/L表明高尿酸血癥模型建立成功[6]。C組大鼠每d給予等量生理鹽水灌胃，共6周。

1.2.3藥物干預 在建模的同時，即從建模第1天開始，LP組大鼠和HP組大鼠分別給予低劑量和高劑量匹伐他汀治療，根據文獻[7，8]，LP組大鼠給予0.21 mg/(kg·d)匹伐他汀、HP組大鼠給予0.42 mg/(kg·d)匹伐他汀，將各組匹伐他汀用生理鹽水配制成2 ml溶液，灌胃，共6周。C組和M組大鼠給予等量生理鹽水灌胃，共6周。

1.2.4標本采集 用藥結束后，乙醚麻醉大鼠，摘眼球取血，將血液標本采用高速低溫離心(3 000 r/min) 5 min，留取血清進行血清學檢查。取血后將大鼠仰臥位固定，沿大鼠左右腋前線剪開胸腔，暴露心臟，注射器抽取甲醛溶液和10%磷酸鹽緩沖液2 ml從心尖注入，分離周圍組織，充分暴露主動脈弓和胸主動脈，向下鈍性分離暴露腹主動脈，截取主動脈2.5 cm，將其放入含10%磷酸鹽緩沖液的甲醛溶液中固定，經石蠟包埋，用于HE染色和免疫組化染色。

1.2.5血清學指標檢測 血尿酸、TNF-α、IL-6、NO采用ELISA法測定，CRP采用免疫透射比濁法測定，ET-1采用放射免疫法測定。

1.2.6HE染色測定大鼠主動脈病理學變化 將主動脈石蠟切片脫蠟至水，放入蘇木素染液中染色7 min，蒸餾水沖洗1 min，鹽酸乙醇分色20 s，蒸餾水沖洗1 min，淡氨水返藍10 s，蒸餾水沖洗，將切片放入伊紅染液中染色5 min，蒸餾水沖洗1 min，梯度酒精脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察染色情況。

1.2.7免疫組化染色測定主動脈中VCAM-1蛋白表達 將主動脈石蠟切片脫蠟至水，枸櫞酸鹽緩沖液進行抗原熱修復，蒸餾水沖洗，加入過氧化氫孵育10 min，消除內源性過氧化物酶活性，蒸餾水沖洗，加入一抗(1∶100)過夜孵育，加入二抗孵育2 h，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木液染核5 min，蒸餾水沖洗，梯度酒精脫水，透明，封片，OLYMPUS BX60顯微鏡觀察染色情況，ImagePlus5.1圖像分析軟件測定陽性表達區域的積分吸光度，計算平均吸光度(積分吸光度/主動脈橫截面積)，以平均吸光度表示VCAM-1在主動脈中的表達強度。

2 結果

2.1各組大鼠血尿酸水平比較 與C組比較，M組、LP組和HP組血尿酸水平升高(P<0.05)；與M組比較，LP組和HP組血尿酸水平降低(P<0.05)，HP組血尿酸降低更為顯著(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血尿酸水平比較Tab.1 Comparison of blood uric acid levels in each group of

2.2各組血清炎癥因子水平比較 與C組比較，M組、LP組和HP組血清TNF-α、IL-6、CRP水平升高(P<0.05)；與M組比較，LP組和HP組血清TNF-α、IL-6、CRP水平降低(P<0.05)，HP組血清TNF-α、IL-6、CRP水平降低更為顯著(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP水平比較Tab.2 Comparison of serum TNF-α，IL-6 and CRP levels in each group of

2.3各組NO、ET-1水平比較 與C組比較，M組、LP組和HP組NO水平降低(P<0.05)，ET-1水平升高(P<0.05)；與M組比較，LP組和HP組NO水平升高(P<0.05)，ET-1水平降低(P<0.05)，其中HP組NO水平升高、ET-1水平降低更為顯著(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠NO、ET-1水平比較Tab.3 Comparison of NO and ET-1 levels in each group of

2.4各組主動脈HE染色比較 C組大鼠主動脈內皮完整，結構正常；M組大鼠主動脈見內皮細胞腫脹，向動脈腔凸起；LP組和HP組大鼠主動脈內皮細胞腫脹明顯減輕，其中HP組大鼠主動脈內皮細胞腫脹減輕更為顯著。見圖1。

圖1 各組主動脈HE染色(×400)Fig.1 HE staining of aorta in each group(×400)

2.5各組主動脈中VCAM-1表達比較 C組大鼠主動脈VCAM-1呈陰性；M組大鼠主動脈VCAM-1呈陽性表達；LP組和HP組大鼠主動脈VCAM-1表達較M組降低，其中HP組減弱更顯著。見圖2。與M組比較，LP組和HP組主動脈VCAM-1平均吸光度值降低(P<0.05)，其中HP組主動脈VCAM-1平均吸光度值降低更為顯著(P<0.05)。見表4。

圖2 各組主動脈VCAM-1免疫組化染色(×400)Fig.2 Immunohistochemical staining of aortic VCAM-1 in each group(×400)

表4 各組大鼠主動脈VCAM-1平均吸光度值比較Tab.4 Comparison of mean absorbance values of VCAM-1 in aorta of each group of

3 討論

高尿酸血癥可引起體內代謝紊亂，包括糖代謝紊亂、氨基酸代謝紊亂、脂肪代謝紊亂等，高尿酸血癥引起的機體代謝紊亂是高尿酸血癥發生發展以及腎臟疾病和心腦血管疾病的發病機制。他汀類藥物在高膽固醇血癥的治療以及心血管疾病發病的預防中被廣泛應用，具有良好效果。他汀類藥物對高尿酸血癥也有防治作用，如溫淼等[9]研究發現阿托伐他汀可降低缺血性卒中患者高尿酸血癥發生率。匹伐他汀作為第三代他汀類藥物，是否對高尿酸血癥也有防治作用？本文對其進行研究，發現高尿酸血癥模型大鼠血尿酸水平顯著升高，匹伐他汀可顯著降低血尿酸水平，高劑量匹伐他汀降低血尿酸水平的效果優于低劑量匹伐他汀組，表明匹伐他汀對高尿酸血癥具有防治作用。匹伐他汀降低血尿酸水平的機制尚不清楚，分析可能為：高尿酸血癥患者常存在腎臟損傷，匹伐他汀具有保護腎臟的作用，故匹伐他汀可能通過保護腎臟功能降低血尿酸水平。因篇幅有限，本研究未對匹伐他汀降低血尿酸的機制進行探討，后續將對其進行詳細研究。

高尿酸血癥和血清炎癥因子關系密切，研究發現高尿酸血癥患者血清炎癥細胞因子水平升高。血尿酸水平升高時，析出尿酸鹽結晶，尿酸鹽結晶在血管壁沉積，對血管內膜造成損傷，引起血管內膜的慢性炎癥損傷，損傷的內膜上黏附大量單核細胞，單核細胞釋放TNF-α、IL-6等炎癥因子，導致血清中TNF-α、IL-6水平升高；血尿酸水平升高可激活單核細胞NF-κB，單核細胞NF-κB釋放TNF-α、IL-6等炎癥因子，也導致血清TNF-α、IL-6等炎癥因子水平升高；尿酸鹽本身也是白細胞釋放TNF-α、IL-6等炎癥因子的使動因素[10，11]。CRP為急性相性蛋白，在巨噬細胞和中性粒細胞激活時在TNF-α、IL-6等炎癥因子刺激下，由肝細胞合成，故高尿酸血癥也可引起血清CRP水平升高[12]。血清炎癥因子水平的升高可引起血管內膜增厚，引起動脈硬化斑塊形成，從而導致心腦血管并發癥的發生。匹伐他汀具有抑制炎癥反應的作用，如Iqbal等[13]研究發現匹伐他汀通過抑制炎癥反應減輕心肌損傷；Mao等[14]研究發現匹伐他汀通過抑制單核細胞介導的炎癥反應抑制急性心肌梗死后左心室重構；Nakagomi等[15]研究發現匹伐他汀可抑制血脂異常患者體內的炎癥反應。本文對匹伐他汀對高尿酸血癥的炎癥反應的影響進行研究，發現高尿酸血癥大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP水平升高，匹伐他汀可顯著降低高尿酸血癥大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP水平。表明匹伐他汀對高尿酸血癥患者體內的炎癥反應具有抑制作用，匹伐他汀通過抑制高尿酸血癥的炎癥反應改善血管功能，從而降低心腦血管疾病的發生。

血管內皮損傷后體內一些物質濃度發生變化，這些可反映細胞內皮損傷和內皮功能的物質稱為內皮損傷標志物。NO和ET為常用的內皮損傷標志物。NO為主要的血管舒張因子，可引起血管平滑肌松弛，導致血管擴張；NO進入血液后可抑制血小板聚集，對抗血小板激活，具有防止血栓形成的作用，NO同時具有增加血管致密性的作用[16]。ET為作用最強的縮血管活性多肽，具有促進血管平滑肌細胞增殖的作用，正常情況下，血清ET水平極低，血管內皮細胞損傷后ET大量釋放，促進血管平滑肌細胞增生，導致動脈粥樣硬化斑塊的形成[17]。高尿酸血癥可引起血管內皮損傷；血尿酸水平升高可引起NO水平降低，ET水平升高，促進動脈粥樣硬化形成，在冠心病、高血壓等心血管疾病的發生發展中具有重要作用；高尿酸時析出的尿酸鹽結晶在血管壁沉積，損傷血管內膜，促進血小板黏附聚集，造成血栓形成；血尿酸鹽結晶也可導致炎癥的發生，從而促進動脈粥樣硬化的發生。血管內皮損傷時可釋放VCAM-1等細胞分子，VCAM-1為內皮細胞活化和損傷的標志物，正常情況下動脈內皮VCAM-1幾乎沒有表達，內皮細胞活化或損傷的情況下，VCAM-1表達量顯著增加[18]。匹伐他汀具有改善血管內皮功能的作用，如趙子粼等[19]研究發現匹伐他汀可改善急性冠脈綜合征血管內皮功能；Zhao等[20]研究發現匹伐他汀鈣可改善高膽固醇血癥患者的內皮功能，延緩其動脈粥樣硬化的進展；詹小娜等[21]研究發現匹伐他汀具有改善中青年高脂血癥合并頸動脈斑塊患者血管內皮功能的作用。本文對匹伐他汀對高尿酸血癥大鼠內皮功能進行研究，發現高尿酸血癥大鼠血清NO水平降低，ET-1水平升高，主動脈中VCAM-1表達量增加；匹伐他汀可升高高尿酸血癥大鼠血清NO水平，降低ET-1水平，降低主動脈中VCAM-1表達量，表明匹伐他汀可改善高尿酸血癥大鼠血管內皮功能，從而防止動脈粥樣硬化斑塊發生，降低心腦血管疾病發生率。

綜上所述，匹伐他汀干預可降低高尿酸血癥大鼠的血尿酸水平，抑制炎癥反應，改善血管內皮功能。