布魯氏菌IV型分泌系統(tǒng)蛋白BMEII0735基因的原核表達(dá)

豆曉霞 莘海亮 張森 王俊峰 侯秀發(fā)

[摘要][目的]構(gòu)建布魯氏菌IV型分泌系統(tǒng)蛋白BMEII 0735基因的原核表達(dá)載體，進(jìn)行表達(dá)、鑒定。[方法]本研究從羊種布魯氏菌（B.melitensis） 043株的基因組中克隆BMEII 0735基因片段，亞克隆到pMD 19-T載體中，并測(cè)序，克隆至表達(dá)載體pET-28 a，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a -BMEII 0735，利用大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)，并進(jìn)行Western-Blot檢測(cè)。[結(jié)果]成功構(gòu)建了pET-28a-BMEII 0735原核表達(dá)栽體，并在大腸桿菌中成功表達(dá)了BMEII 0735基因。經(jīng)過SDS-PAGE檢測(cè)，重組蛋白的分子量大約是64 KDa。經(jīng)Western-Blot檢測(cè)，BMEII 0735蛋白可與布魯氏菌的陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，表明其具有良好的反應(yīng)原性。[結(jié)論]本實(shí)驗(yàn)成功表達(dá)了布魯氏茵IV型分泌系統(tǒng)蛋白BMEII 0735基因，并成功獲得了BMEII 0735蛋白。BMEII 0735蛋白具有與布魯氏菌自身蛋白相同的抗原性，為進(jìn)一步研究布魯氏菌病的鑒別診斷以及其免疫原性和保護(hù)性奠定了基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]布魯氏菌;BMEII 0735;鑒定;原核表達(dá);反應(yīng)原性

[中圖分類號(hào)] S852.61

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

由布魯氏菌（Brucella）所引起的一種人和多種動(dòng)物共患的傳染病，稱為布魯氏菌病，簡(jiǎn)稱為布病，又稱為波浪熱或馬爾他熱。該病的傳染源主要是患病動(dòng)物和隱性患畜（包括野生動(dòng)物），其中在布病流行病學(xué)上最為重要寄生為羊、豬和牛。羊在國內(nèi)為主要傳染源，其次為豬和牛。該病的病原——布魯氏菌，是一種小球桿狀菌，細(xì)胞內(nèi)寄生，革蘭氏染色陰性，沒有鞭毛，不形成芽孢，專性需氧菌，主要寄生在巨噬細(xì)胞和胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞內(nèi)，對(duì)外界環(huán)境抵抗力較強(qiáng)，在不同的介質(zhì)里面可長期穩(wěn)定存活，如在水中可生存5天-4個(gè)月，在塵埃里可存活21-72天，在鮮牛乳中可存活18個(gè)月之久，在土壤和糞尿中可生存5月有余，但布魯氏菌對(duì)濕熱、紫外線、常用消毒劑等比較敏感。布魯氏菌病感染主要特征為人表現(xiàn)多汗、長期發(fā)熱、肌肉和關(guān)節(jié)疼痛及肝、脾腫大等;母畜表現(xiàn)為生殖器官和胎膜發(fā)炎、流產(chǎn)、不育等;公畜表現(xiàn)為睪丸炎、附睪炎等，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展和公共衛(wèi)生健康。現(xiàn)下，能有效預(yù)防和控制布魯氏菌病傳播的疫苗還沒有研制出來，也沒有能夠使得該病徹底康復(fù)的有效措施。就全世界范圍而言，布魯氏菌病廣泛流行于很多國家，南美洲、地中海地區(qū)和亞洲等地是布魯氏菌病的高發(fā)區(qū)。在中國，布魯氏菌病波及全國大多數(shù)范圍，自20世紀(jì)初，在我國重慶地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)布魯氏菌病以來，現(xiàn)已在全國絕大多數(shù)省、市區(qū)存在程度不一的流行，特別是北方農(nóng)牧區(qū)，例如新疆、河南、內(nèi)蒙古、東北三省等地，被《中華人民共和國傳染病防治法》規(guī)定為二類疫病。并且隨著畜牧業(yè)的發(fā)展以及近些年布病的流行趨勢(shì)，世界范圍內(nèi)的布病的人畜疫情均出現(xiàn)了回升趨勢(shì)，并且日趨嚴(yán)重。新疆等西部地區(qū)布魯氏菌病動(dòng)物的感染率為15%左右，有些養(yǎng)殖場(chǎng)的發(fā)病率為40%以上。布魯氏菌侵染宿主細(xì)胞涉及黏附、侵入、轉(zhuǎn)運(yùn)、傳播及復(fù)制多個(gè)復(fù)雜過程。大量研究表明，布魯氏菌的分泌蛋白能夠使機(jī)體獲得有效的免疫應(yīng)答，可作為候選靶標(biāo)進(jìn)行布魯氏菌病的診斷性抗原的篩選和亞單位疫苗的研制。細(xì)菌的分泌蛋白有著良好的橋梁作用，使得細(xì)菌和機(jī)體之間進(jìn)行互相作用，被認(rèn)為是最有潛力的保護(hù)性抗原。布魯氏菌大多數(shù)的分泌蛋白，在侵入宿主細(xì)胞的過程中都有著重要的作用，但是其具體的分子作用機(jī)制，目前還不清楚。有結(jié)果顯示，布魯氏菌IV型分泌系統(tǒng)蛋白在布魯氏菌侵入宿主細(xì)胞的過程中起著重要的作用，能夠使機(jī)體受到刺激，產(chǎn)生較好的免疫應(yīng)答。因?yàn)槠渚哂性撎攸c(diǎn)，布魯氏菌IV型分泌系統(tǒng)蛋白在布病的鑒別診斷和有效的疫苗研制中有著非常重要的作用和研究價(jià)值。本研究選取羊布魯氏菌IV型分泌系統(tǒng)蛋白BMEII 0735基因作為研究對(duì)象，構(gòu)建BMEII 0735基因的原核表達(dá)載體，通過Western-Blot檢測(cè)其反應(yīng)原性，為進(jìn)行布魯氏菌的保護(hù)性抗原分子篩選、疫苗免疫與布魯氏菌鑒別診斷靶點(diǎn)的研究等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌和載體

石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，動(dòng)物疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供布魯氏菌羊種043株、菌株E.coli DH 5 a、pET-28 a載體菌株、BL21（DE 3）菌株;Promega公司購買pMD 19-T載體。

1.2 主要試劑

石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院/動(dòng)物疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存的布魯氏菌羊種陽性血清;Merck公司購買誘導(dǎo)劑IPTG;由大連寶生物工程有限公司提供限制性內(nèi)切酶（BamH I/Xho I）、T4連接酶和DNA marker;細(xì)菌質(zhì)粒小提取試劑盒以及瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限責(zé)任公司;蛋白Marker、HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG、購自北京康為世紀(jì)生物科技有限責(zé)任公司;BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒購自生工生物工程（上海）有限股份公司;剩余試劑均為本實(shí)驗(yàn)室常用分析純度的產(chǎn)品。

1.3 目的基因擴(kuò)增

登錄GeneBank，查找布魯氏菌（NC-003317）BMEII 0735的基因序列，設(shè)計(jì)引物，由北京六合華大基因有限公司進(jìn)行合成，序列見表1。

布魯氏菌羊種043分離株的滅活菌液（90℃金屬浴滅活30min）做為模板，進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系（20 uL）見表2，反應(yīng)條件見表3。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠凝膠電泳或4℃保存。回收目的基因片段，并與載體pMD19-T在16℃水浴條件下進(jìn)行連接，連接體系（10 uL）見表4，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD 19-T-BMEII 0735。再將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli DH 5 α感受態(tài)細(xì)胞，在氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行陽性篩選，進(jìn)行菌液PCR和雙酶切鑒定陽性克隆，并將提取的質(zhì)粒送往上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4 構(gòu)建BME110735基因原核表達(dá)載體

將測(cè)序正確的pMD 19-T- BMEII 0735質(zhì)粒和pET-28 a載體用BamH I和Xho I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切處理，目的片段和酶切后的線性pET-28 a載體用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收。將線性pET-28 a載體和目的片段，在16℃水浴條件下用T4連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli BL 21（DE 3）感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)LB固體培養(yǎng)基（卡那抗性）篩選陽性克隆，進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證和酶切鑒定。

1.5 重組蛋白表達(dá)及表達(dá)條件的優(yōu)化

將篩選出的陽性克隆菌置于LB液體培養(yǎng)基中，200r/min、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，將過夜培養(yǎng)的菌液按1：100的比例，接種至新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，200r/min、37℃繼續(xù)培養(yǎng)1h左右，使其OD值為0.4-0.6，在其他條件不變的情況下，按照不同的誘導(dǎo)劑（IPTG）濃度（終濃度為0.2mM，0.6mM，1.0mM）、誘導(dǎo)不同時(shí)間（0h，4h，6h，8h），收集菌體。取1ml菌液2000r/min離心后，棄掉上清，并在離心管中按照1：4的比例加入稀釋后的1×SDS蛋白上樣緩沖液，在振蕩器上震蕩，使菌體和蛋白上樣液充分混勻，在金屬加熱器上100℃加熱10 min，取20ul樣品進(jìn)行15%蛋白電泳。觀察電泳結(jié)果。篩選目的基因的最佳表達(dá)條件，并以最佳的誘導(dǎo)表達(dá)條件，進(jìn)行蛋白大量誘導(dǎo)表達(dá)，并采用AKTA蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行蛋白純化，進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定。

1.6 重組蛋白的Western-Blot檢測(cè)

篩選出蛋白的最佳表達(dá)條件后，以最佳誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，并對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，將重組蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上，以200mA的電流轉(zhuǎn)膜1h。再將NC膜放入雜交瓶（預(yù)先用TBST緩沖液洗滌）中。37℃封閉2h，NC膜用TBST緩沖液洗滌3次，每次7 min。加入1：500比例稀釋的經(jīng)石河子大學(xué)動(dòng)物疾病防控兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定的布魯氏菌羊種陽性血清，37℃孵育2h，NC膜用TBST緩沖液洗滌3次，每次7min，然后加入1：5000比例稀釋的辣根過氧化氫酶標(biāo)記的兔抗綿羊IgG，37℃孵育2h，NC膜用TBST緩沖液洗滌3次，每次7min。避光條件下，DAB顯色劑進(jìn)行顯色后拍照。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的擴(kuò)增及酶切鑒定

NCBI中記錄的羊種布魯氏菌BMEII0735基因的片段大小為1578 bp，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析后，與實(shí)際的大小一致，如圖l所示。用相應(yīng)的（ BamH I/Xho I）限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，得到大小與預(yù)期結(jié)果相符合的基因條帶。表明羊種布魯氏菌IV型分泌系統(tǒng)蛋白BMEI10735基因已經(jīng)成功插入pET-28 a表達(dá)載體中，如圖2所示。

2.2 重組蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化

為探尋重組蛋白表達(dá)的最佳誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)時(shí)間，分別在誘導(dǎo)時(shí)間不變的前提下，設(shè)置誘導(dǎo)劑濃度梯度，篩選最佳誘導(dǎo)劑濃度;在誘導(dǎo)劑濃度不變的前提下，設(shè)置時(shí)間梯度篩選最佳誘導(dǎo)時(shí)間。結(jié)果顯示，在誘導(dǎo)劑IPTG的終濃度為1 mmol/L誘導(dǎo)8h條件下，重組蛋白表達(dá)量最高，如圖3所示。重組蛋白大量誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)AKTA蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行蛋白純化。SDS-PACE分析表明，純化后的蛋白條帶清晰，無雜帶，顯示純化效果較好，結(jié)果如圖4所示。

2.3 Westem-Blot檢測(cè)

將誘導(dǎo)8h后的重組蛋白純化后，進(jìn)行Western-Blot檢測(cè)，200mA恒流電流下轉(zhuǎn)膜1h，可見明顯的陽性條帶。結(jié)果表明，誘導(dǎo)得到的重組蛋白能被HRP標(biāo)記的兔抗綿羊IgG抗體識(shí)別，且大小與pET-28分子質(zhì)量加上目標(biāo)分子蛋白質(zhì)量的重組蛋白總分子質(zhì)量相符，結(jié)果如圖5所示。

3 討論

在我國，將布魯氏菌病列為職業(yè)病。2019年，布魯氏菌病又被農(nóng)業(yè)農(nóng)村部列為畜牧業(yè)強(qiáng)制免疫的傳染病之一，可見布病的危害影響。防控布魯氏菌病的關(guān)鍵在于疫苗免疫和檢疫凈化。目前，國內(nèi)市面上現(xiàn)有的布病疫苗雖然有一定的免疫效果，但其免疫效果并未達(dá)到我們所期望的高度，重點(diǎn)是不能區(qū)分布魯氏菌野毒感染和疫苗免疫，為布病的檢疫凈化帶來重重困難。

自2002年羊種布魯氏菌16M參考基因組測(cè)序工作完成以來，已經(jīng)有300多株布魯氏菌基因組完成了測(cè)序，其中有16株基因組已經(jīng)進(jìn)行了精細(xì)的物理圖譜繪制。目前，隨著部分布魯氏菌菌株的基因組序列測(cè)序的完成，使我們?cè)诜肿訉用嫜芯坎剪斒暇闹虏C(jī)理有了進(jìn)一步的提高和發(fā)展。總之，布魯氏菌與易感動(dòng)物群之間的相互作用是一個(gè)非常復(fù)雜的過程。本文通過構(gòu)建布魯氏菌BMEI10735基因的原核表達(dá)載體并對(duì)其反應(yīng)原性進(jìn)行鑒定，有助于進(jìn)一步了解布魯氏菌蛋白質(zhì)的功能，為布魯氏菌的鑒別診斷研究和生物信息學(xué)分析提供參考，為進(jìn)一步探究布魯氏菌的分子致病機(jī)制以及布魯氏菌的鑒別診斷奠定了基礎(chǔ)。

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