不同來源的植物乳桿菌基因組和抗生素抗性

殷瑞敏， 李曉姝， 毛丙永， 崔樹茂， 趙建新

（江南大學 食品學院，江蘇 無錫214122）

植物乳桿菌是一種極其多樣化的乳桿菌，其分布十分廣泛，包括植物、人的胃腸道、動物、蔬菜或發酵乳制品[1]。 植物乳桿菌及其發酵產品具有重要的生理功能，包括調節腸道菌群、提高機體免疫力、降膽固醇等[2-3]。 傳統的研究主要集中于采用生理生化實驗方法來篩選具有特定功能的菌株，但這種方法篩選效率較低。 隨著分子生物學技術和高通量測序技術的發展，采用基因組學和比較基因組學等手段將有助于系統了解植物乳桿菌的基因組結構，在分子水平上分析植物乳桿菌的功能，為高效篩選具有應用潛力的菌株提供新思路[4-5]。

近年來，研究人員采用 AFLP[6]、RAPD[7]、MLST[8]、CGH[9]等生物學手段，分析了植物乳桿菌基因組上的遺傳多樣性，同時，也進行了基因型和表型的比較研究。Molenaar 等人[10]研究了20 株植物乳桿菌的基因組，發現參與蛋白質和脂質合成或降解的基因在很大程度上是保守的，然而參與糖轉運和分解代謝的基因在菌株中差異很大。 在另一項研究中，Siezen 等人[11]評估了185 株植物乳桿菌中 24 種糖的代謝規律和生長特征。 然而，這些研究并未將基因型和表型相關聯。

大量使用抗生素促進了細菌不斷進化，導致耐藥細菌的出現[12]。因此，食品中所用菌株的安全性越來越得到重視。 食物鏈是人類和動物之間傳播耐藥菌的主要途徑，一些發酵食品會為耐藥細菌提供載體[13]。 發酵食品中常用的植物乳桿菌被認為是普遍安全的，但也存在將抗生素的耐藥基因轉移到病原菌的風險[14]。 因此，在將菌種應用到食品生產前，評估其抗生素抗性是十分必要的。 近段時間，一些學者對植物乳桿菌等益生菌的抗性基因和抗性之間的關系進行了探索， 但其研究多集中于單個菌株，忽略了菌株耐藥性與其分離源的密切關系。

作者研究了從不同環境中分離的33 株植物乳桿菌的基因組特征，包括同源基因和基于同源基因的系統發育樹， 并選取抗生素耐藥性這一特性，首次對不同分離源的33 株植物乳桿菌的耐藥性方面進行了全面研究，進一步探討了比較基因組揭示的進化關系、抗性基因、抗生素抗性三者之間的關系，探究分離源、 菌株進化對菌株生物學特性的影響，為今后植物乳桿菌的基因組學及生物學特性等方面的研究提供數據參考和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株 33 株植物乳桿菌， 分離自發酵醬、發酵泡菜和人的糞便，保藏于江南大學食品生物技術研究中心的菌種保藏中心。

1.1.2 試劑 胰蛋白胨、無水葡萄糖、一水合硫酸錳、牛肉浸膏、無水乙酸鈉、酵母粉、磷酸氫二鉀、檸檬酸氫二銨、七水合硫酸鎂：均購自國藥集團化學試劑有限公司；鏈霉素、氯霉素、四環素、氨芐西林、紅霉素、克林霉素、慶大霉素、新霉素、卡那霉素、環丙沙星、甲氧芐氨嘧啶：購自生工生物工程（上海）股份有限公司；IST 標準藥敏檢測肉湯培養基：購自山東拓普生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備 超凈工作臺：江蘇蘇凈集團有限公司；Whitley DG250 厭氧工作站：英國Don Whitley Scientific 公司；PCR 熱循環儀：美國 Bio-Rad 公司；凝膠成像系統：美國Bio-Rad 公司；酶標儀：美國Thermo Fisher Scientific 公司；UV1800 紫外可見分光光度計：日本島津公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 基因組測序 將植物乳桿菌接種到5 mL MRS 液體培養基中，37 ℃培養 12 h。 傳代培養兩次后， 接種到80 mL MRS 液體培養基中，37 ℃培養16~24 h。 培養結束，8 000 r/min 離心 5 min 收集菌泥， 送至上海美吉生物醫藥科技有限公司， 采用Illumina HiSeq 2000 進行基因組測序。

1.3.2 基因組組裝、 預測及功能注釋 使用SOAP denovo 軟件對基因組進行組裝， 驗證單個堿基，使用 GapCloser 軟件填充基因組內部缺口[15]；使用Glimmer 和 Genmark 軟件預測ORF （開放閱讀框）；在NCBI NR（非冗余蛋白質文庫）和COG（直系同源簇） 蛋白質組數據庫中通過BLASTp （蛋白質BLAST）對ORF 進行同源性比對和功能注釋。

1.3.3 同源基因韋恩圖繪制及系統發育樹構建使用OrthoMCL 軟件對每個菌株基因組進行直系同源基因預測[17]，然后使用MAFFT v7.3 軟件[18]比對直系同源基因， 通過 Perl 腳本繪制韋恩圖。 使用PHYLIP v3.6[19]（http：//evolution.genetics. washington.edu/phtlip.html）構建系統發育進化樹。

1.3.4 抗生素抗性基因分析 綜合抗生素抗性數據庫是CARD，使用BLAST 將植物乳桿菌的所有基因和CARD 數據庫中的基因[20]對比，以預測基因組中存在的抗生素抗性基因。 若基因在CARD 中的序列匹配度達到閾值20%，則認為該基因組中含有對應的抗生素抗性基因。

1.3.5 抗生素耐受性實驗 根據ISO 標準（ISO10932/ IDF223）， 使用肉湯微量稀釋法測定11種抗生素的最低抑菌濃度（MIC），抗生素包括環丙沙星、慶大霉素、新霉素、卡那霉素、氨芐西林、四環素、甲氧芐氨嘧啶、鏈霉素、氯霉素、紅霉素和克林霉素。

參照ISO10932 / IDF223 文件， 采用二倍數稀釋法，對 LSM（IST∶MRS=9∶1）培養基配置不同質量濃度抗生素稀釋液；在無菌的96 孔板中，每行第1孔添加200 μL 空白培養基做對照； 第2 孔至第11孔加100 μL 抗生素稀釋液（濃度由低到高），第12孔不加抗生素。 將菌株培養至穩定期，測菌液吸光度OD625；根據OD625值預估菌液的稀釋比例，使得稀釋后的菌液濃度在105~106CFU/mL。 將稀釋的菌懸液在第2~12 孔中加100 μL，置于厭氧工作站中37℃培養，48 h 后取出。 結合OD625吸光度值及肉眼觀察結果，無可見菌株生長的抗生素質量濃度即為該抗生素對菌株的MIC 值。 同一抗生素質量濃度，做平行3 個孔；做兩次獨立重復試驗，最終確定抗生素對菌株的MIC 值。植物乳桿菌對不同抗生素的臨界值判定依據EFSA 指南和EUC 標準，在EFSA 標準中，當測定的MIC 小于或等于臨界值時，判定為敏感。 EUC 標準中，當測量的MIC 小于臨界值時判定為敏感。 抗生素抗性實驗質量濃度范圍及臨界值見表1。

2 結果與分析

2.1 菌株基本信息和基因組概況

本研究共選擇了33 株不同來源的植物乳桿菌，其中12 株來自于發酵大醬，10 株來自于發酵泡菜，11 株來自于人體糞便，具體信息見表2。33 株植物乳桿菌基因組的大小范圍為3.00~3.31 Mb， 糞便源的植物乳桿菌平均為3.16 Mb， 要高于泡菜源植物乳桿菌的3.12 Mb 及發酵醬源的3.11 Mb。 這可能是來自糞便的植物乳桿菌其生存環境更為復雜，需要進化出更多的基因和功能來適應環境。33 株植物乳桿菌的基因數量為3 049~3 416， 植物乳桿菌GC 堿基數量占總堿基數量的45.32%~46.33%。 這與Maria 等人[24]的研究結果是一致的。

表1 抗生素實驗質量濃度范圍及臨界值Table 1 Antibiotic experimental concentration range and critical value

2.2 植物乳桿菌的同源基因及系統發育樹

為了進一步明確植物乳桿菌在基因組層面是否存在差異， 我們分析了33 株不同來源的植物乳桿菌的直系同源基因，并基于同源基因構建了系統發育樹。 在基因組進化過程中，同源基因是指具有相似生化功能的基因[25]，同源蛋白質的基因家族也稱為“核心基因家族”，菌株特有的基因稱為特定基因家族[25-26]。

基于基因組聚類結果和核心基因組群繪制韋恩圖，見圖1。 直系同源基因的個數顯示在圖中心，特異性基因數量呈現在韋恩圖的花瓣外側，總基因數標注在菌株名稱下方。 33 株植物乳桿中，共有2 245 個同源基因， 特殊基因的數量因來源不同存在明顯區別。來自泡菜的菌株的特殊基因的數量在7~20 個，平均12 個，來自糞便和發酵醬的菌株的特殊基因的數量明顯高于泡菜來源， 從7~147 個不等，發酵醬源為平均70 個，糞便源為平均71 個，這可能與樣品所處環境受到的脅迫有關。

表2 33 株植物乳桿菌基本信息Table 2 Basic information of 33 strains of Lactobacillus plantarum

基于同源基因構建的系統發育樹見圖2。 進化樹被分為3 大支， 其中來自發酵醬的DHLJZD13L6單獨分為一大支，表明在基因層面上這株菌與其他植物乳桿菌有較大區別。 剩下兩大分支表明來自泡菜、發酵大醬和糞便的植物乳桿菌能較好地根據來源聚成一簇，尤其是來自泡菜的植物乳桿菌，說明來源不同使得植物乳桿菌在基因層面上存在差異，生存環境賦予了菌株不同的基因型，從而使得其可能具有不同的功能。 Maria[24]等人研究了54 株來源于7 種分離源的植物乳桿菌的系統發育樹，他發現分離源僅使得部分蔬菜源菌株呈現聚類趨勢，整體上并沒有對植物乳桿菌的進化造成顯著影響，但這可能與蔬菜源菌株數多， 而其他分離源菌株數量少，導致規律不明顯有關。

圖1 33 株植物乳桿菌的直系同源基因Fig. 1 The orthologous gene of 33 strains of Lactobacillus plantarum

圖2 基于同源基因的系統發育樹Fig. 2 Phylogenetic tree based on homologous genes

2.3 抗生素抗性基因分析

依據抗生素抑菌機理的差異，可將抗生素大致分為以下5 種：抑制合成細胞壁、抑制合成核酸、抑制合成蛋白質、 改變細胞功能和抑制細胞代謝，本實驗中使用的11 種抗生素類型及其常見對應基因[27]見表 3。

表3 實驗中所用抗生素類型及基因Table 3 Types and genes of antibiotics used in the experiment

細菌耐受抗生素的分子和生化機制包括抗生素結合靶標的改變、耐藥酶催化抗生素失活等[28]。根據基因組測序結果， 在33 株植物乳桿菌中共檢測出74 種抗性基因， 其中有38 種基因屬于外排泵，見圖3。 36 種基因屬于使抗生素失活型基因或者結合靶標改變基因，見圖4。通過細菌細胞膜上的外排泵將抗生素排出胞外，是固有耐藥和獲得性耐藥性的主要機制[29]。本實驗中的33 株植物乳桿菌的外排泵機制主要屬于MFS 和ATP 結合盒， 能夠作用于多種類型的抗生素，例如氨基糖苷類、氟喹諾酮類等。 此外，發現紅霉素外排泵基因macB 豐度最高；tetT 等四環素外排泵在33 株植物乳桿菌中均有發現；苯酚類抗生素（氯霉素）外排泵基因cmlv 僅存在于糞便源植物乳桿菌中。

其他36 抗性基因涵蓋了氯霉素、環丙沙星、甲氧芐氨嘧啶、四環素、鏈霉素、克林霉素等，見圖4。在抗生素抗性基因層面，不同來源的植物乳桿菌的抗性基因差異不大，只在個別基因上有區別，比如糖肽類抗性基因vanRF 只存在于糞便源和發酵醬源的植物乳桿菌中，而在所有泡菜源植物乳桿菌的基因組中發現了另一種糖肽類抗性基因vanRI。 在本研究中還發現，有些抗性基因是無法共存，例如莫匹羅星抗性基因mupA 和mupB。

圖3 33 株植物乳桿菌抗性基因中的外排泵基因Fig. 3 Efflux pump gene in 33 strains of Lactobacillus plantarum resistance gene

圖4 33 株植物乳桿菌抗性基因中的其他類型基因Fig. 4 Other types of genes in the 33 strains of Lactobacillus plantarum resistance genes

2.4 植物乳桿菌抗生素抗性分析

為了明確基因型上的差異能否體現在表型上，測定了33 株植物乳桿菌對11 種抗生素的抗性，依據EFSA 和EUC 標準確定每種抗生素的臨界值，根據 MIC 值將菌株劃分為敏感（S）或抗性（R），并計算了不同來源的植物乳桿菌對每種抗生素的抗性菌株比例。

由表4 可知， 只有少數幾株菌對慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、紅霉素、新霉素、氨芐西林具有抗性，整體上表現出敏感；所有來源的菌株對四環素、環丙沙星具有抗性；對甲氧芐氨嘧啶、氯霉素，3 種來源的抗性菌株比例均達到70%以上。 不同來源的植物乳桿菌僅在克林霉素的耐受性上存在顯著差異，其中泡菜源抗性最高，有80%的菌株表現為耐受，另外兩種分離源的抗性菌株不足50%。

表4 3 種來源的植物乳桿菌對不同抗生素的抗性菌株比例Table 4 Proportion of resistant strains to different antibiotics from three sources

但進一步分析發現，雖然不同來源菌株對每種抗生素的MIC 范圍不同，但出現的頻率最高的MIC值基本是一致的，見圖5。例如卡那霉素，發酵醬源菌株的 MIC 為 16~64 μg/mL， 泡菜來源菌株的 MIC 為16~128 μg/mL，糞便來源菌株的 MIC 為 8~64 μg/mL，但最高頻率的MIC 值均為32 μg/mL。 其他抗生素的抗性結果也表現出了相似的規律，存在差異但不大。 這表明，分離源對植物乳桿菌的抗生素抗性影響并不顯著。

圖5 33 株植物乳桿菌對不同抗生素的MIC 值Fig. 5 MIC values of 33 Lactobacillus plantarumstrains for different antibiotics

楊梅[14]研究了93 株、9 個種屬的乳酸菌的耐藥性， 結果表明同種乳酸菌的抗生素抗性差異不大，不同種之間差異明顯，實驗中所有乳桿菌屬對青霉素和紅霉素耐藥性差，這與本研究結果一致。 周寧等[30]對分離自市售酸奶的18 株保加利亞乳桿菌的抗生素耐藥性進行研究， 結果表明18 株保加利亞乳桿菌均對羅紅霉素敏感， 而對卡那霉素均耐受。大量的研究表明， 乳酸菌中的乳桿菌屬對萬古霉素、卡那霉素、鏈霉素、甲硝哩、氟呱酸、環丙沙星等具有固有耐受性。

作者發現有兩株菌比較特別， 泡菜源的VCQBB3125L8 和發酵醬DHLJZD13L6，其耐受抗生素的種類要略廣于其他菌株。 出現這種情況的原因可能有兩種，一是這兩株都來自于發酵食品，制作過程中沒有經過高溫殺菌，導致菌株與環境中的其他微生物發生了耐藥基因的轉移；二是用于制作這兩種發酵食品的原料在生長過程中可能接觸到含有多種抗生素的農藥或肥料，導致分離出的這兩株菌的抗性增強。

2.5 抗生素抗性與抗性基因的關系

理論上，菌株的獲得耐藥性會增加耐藥基因轉移的風險，固有耐藥性的菌株因為缺乏相關抗性基因較為安全。 因此，研究菌株的抗性基因和抗性表型的關系，對于判斷菌株為獲得耐藥性還是固有耐藥性，改造菌株應用于實際生產具有重要意義。

分析抗生素的MIC 值和抗性基因檢測結果，我們發現大部分抗生素抗性可以與其抗性基因相關聯。 環丙沙星是典型的氟喹諾酮類抗生素，通過抑制核酸合成達到抑菌的效果[31]，所有菌株均含有氟喹諾酮類抗性基因gyrA、gyrB，MIC 結果表明菌株對環丙沙星具有抗性； 四環素抗性基因主要為tetT等，所有菌株均含有四環素類抗性基因和外排泵基因，實驗也發現所有菌株對四環素具有抗性；分析氨芐西林、氯霉素和甲氧芐氨嘧啶，也得到同環丙沙星和四環素類似的結果。

萬古霉素是糖肽類抗生素，主要通過抑制細胞壁合成達到抑菌效果[32]，以往的研究稱植物乳桿菌對萬古霉素有天然抗性[33]。本研究中33 株植物乳桿菌均含有大量的萬古霉素抗性基因 （van 系列），且33 株菌均篩選自含萬古霉素的培養基，因此可以判定33 株菌對萬古霉素均有抗性。

發酵醬源的DHLJZD13L6 對鏈霉素表現出抗性，在其基因組中發現了鏈霉素抗性基因ANT（9）-Ia；絕大部分菌株對慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素、新霉素敏感，在其基因組中沒有發現與這些抗生素密切相關的抗性基因。 研究發現泡菜源的VCQBB3125L8 也沒有相關基因，但其對慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素均表現出抗性，這可能與植物乳桿菌能對慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素和新霉素等低水平氨基糖苷類抗生素表現出固有抗性[22]有關。

但紅霉素和克林霉素基因和表型并不對應，可能是基因、移動元件及其細菌宿主之間發生了復雜相互作用[23]。 研究表明菌株對紅霉素產生抗性主要由 mefA 和存在于質粒上的 ermB 基因介導[16，21]。 雖然所有菌株都含有紅霉素外排泵基因macB，數量達到17 個，但只有DHLJZD13L6 表現出了抗性，可能是因為其質粒上含有ermB 基因。 所有菌株的基因中均檢測出克林霉素外排泵基因lmrC、vgaD， 但是3 種來源的菌株其抗性并不相同，糞便源最敏感，抗性菌株只占27.27%，泡菜源抗性達到80%。 這可能是因為泡菜是發酵制品，在制作過程中沒有高溫殺菌，暴露的環境、多樣的微生物對其產生了選擇作用。

值得一提的是， 來自發酵醬的植物乳桿菌DHLJZD13L6 對紅霉素、鏈霉素、克林霉素也都表現出了抗性，一是因為其含有相關抗性基因，二是以往的研究表明這3 種抗生素有交叉耐藥性。 同時，我們發現DHLJZD13L6 含有多個獨特的抗性基因，如 ANT（9）-Ia、oleC、murA，這與系統發育樹表現的結果相同。 這表明，比較基因組學對于挖掘可能具有同種生理特性和功能的菌株具有指導意義。

3 結 語

對33 株不同來源的植物乳桿菌的多樣性進行了初步探究， 包括基因組層面以及抗生素抗性層面。 比較基因組學結果表明，分離源對植物乳桿菌的遺傳進化具有較為顯著的影響。 糞便源的菌株在基因組大小和特殊基因數量上均多于泡菜源和發酵醬源的菌株，這與其生存環境復雜有關。 33 株植物乳桿菌中共檢測出74 種抗性基因， 不同來源的菌株僅在vanRI 等個別抗生素基因上呈現聚類的趨勢，整體上分離源對菌株的抗生素抗性基因和抗性上并沒有造成明顯的差異。33 株植物乳桿菌均含有環丙沙星、四環素、氯霉素、甲氧芐氨嘧啶和萬古霉素的抗性基因， 其抗性菌株比例也達到90%以上。絕大多數菌株對慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素、新霉素、氨芐西林敏感，基因組中也沒有發現與其對應的抗性基因。 但對于紅霉素和克林霉素，其基因和表型并不對應。

抗生素抗性實驗結果表明，基因型和表型有很強的聯系，證明了基因組學對于表型分析有指導意義。 同時，菌株的抗性結果遵循比較基因組學得出的規律，表明比較基因組學對于挖掘可能具有同種生理特性和功能的菌株具有重要意義。