一種中性普魯蘭酶及其在紅薯粉絲制作中的應用

朱新文 ， 德青美朵 ， 王 婕 ， 邵羅楠 ， 姚 雁 ，沈 微 *，， 楊海泉 ， 陳獻忠 ， 樊 游

（1． 江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室， 江蘇 無錫 214122；2． 無錫先秦生物科技有限公司， 江蘇 無錫214073；3． 江南大學 中國高校工業微生物資源數據平臺，江蘇 無錫 214122）

粉絲是我國特有的傳統美食，已有上千年的歷史[1-2]。 根據原料的不同，粉絲可以分為不同的種類，其中市場上最常見的是綠豆粉絲和薯類粉絲。 不同種類的淀粉對粉絲品質的影響很大[3]，以綠豆淀粉為原料制作的粉絲質量普遍優于薯類淀粉粉絲。 金茂國等研究發現，綠豆淀粉含有較高比例的直鏈淀粉，尤其是其中較多的不溶性直鏈淀粉是綠豆粉絲質量高的關鍵原因[3]。 薯類淀粉的原料來源豐富，價格低廉， 但薯類淀粉粉絲質量明顯不如綠豆淀粉。按傳統工藝生產薯類粉絲時一般需要添加明礬以防止粉絲間互相粘連、提高產品的耐煮性并降低斷條率。 由于長期攝入明礬可能對人體健康帶來危害， 為此科研工作者研究了黃原膠、 復合磷酸鹽、CMC 纖維素、海藻酸鈉等多種明礬替代物[4-8]，這些明礬替代物在一定程度上解決了由明礬帶來的食品安全問題，但其用量較大，一般要達到粉絲淀粉總量的0.3%以上，這增加了粉絲的生產成本也可能帶來新的食品安全隱患。 普魯蘭酶專一性水解淀粉中的α-1，6-糖苷鍵， 可以將支鏈淀粉水解為直鏈淀粉。 理論上講，用普魯蘭酶處理淀粉可以提高其直鏈淀粉的含量，但這種方法在實際應用時存在兩方面的困難。 一是淀粉分子在低溫下一般以結晶的顆粒狀存在，在淀粉的水懸液中大部分分子接觸不到酶，淀粉的酶解難以實現。 二是淀粉水懸液在高溫糊化時形成很高的粘度，而高濃度的水懸液幾乎可以變成固體狀，酶解同樣無法實現。 劉程玲等[9]用普魯蘭酶直接水解淀粉水懸液，使紅薯淀粉中直鏈淀粉的含量提高了8.57%。 這種方法的缺點是普魯蘭酶與淀粉水懸液需要在55 ℃下搖瓶反應15 h，生產時需要專門的設備并且動力消耗較大。 本課題組在前期研究中建立了一種以普魯蘭酶水解芡糊的酶法粉絲制作方法[10]，反應時間只有30 min，在完全不添加明礬及其它添加劑的情況下，制作出的成品粉絲在斷條率等質量指標上與添加明礬制得的粉絲基本一致。 針對這一工藝，本課題組還開發了一種來源于嗜熱脂肪地芽孢桿菌的普魯蘭酶GsP[11]，研究表明，這種中性耐熱型普魯蘭酶在粉絲制作中的使用量明顯小于目前商品化的耐酸性普魯蘭酶[12]。酶本身是一種蛋白質，加熱變性后與其他蛋白質并沒有本質的差異，其水解產生的直鏈淀粉也是淀粉的正常成分，因此從食品安全考慮，用普魯蘭酶水解芡糊是一種比較理想的無明礬粉絲制作方法。 本課題組在江蘇省東海農村進行酶法粉絲技術應用試驗中發現，以GsP 或商品化普魯蘭酶水解芡糊制作粉絲的方法在應用于純淀粉為原料的工藝中時均能獲得穩定的結果，但以未經提純的淀粉質原料制作粉絲時則結果很不穩定，重要原因之一是以這些材料制作的芡糊的pH 有比較大的波動，導致普魯蘭酶的作用效果不穩定。 對此，本課題組對前期收藏的地芽孢桿菌屬的菌株進行篩選，獲得了一株編號為 XQ3665 的地表地芽孢桿菌（Geobacillussubterraneus）， 這株菌所產普魯蘭酶具有較為寬泛的pH 適應范圍， 有可能在一定程度上解決以非純淀粉原料制作粉絲時遇到的問題。 作者研究了這種普魯蘭酶在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中的表達以及重組酶在以紅薯面為原料的粉絲制作中的應用效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株與質粒 地表地芽孢桿菌XQ3665 菌株：從無錫先秦生物科技有限公司菌種庫中篩選得到，已進一步在江南大學中國高校工業微生物資源數據平臺進行正式保藏，保藏編號為CICIM B6904；大腸桿菌表達載體pLac03： 由作者所在課題組保藏[11]；枯草芽孢桿菌表達載體pUP43：由無錫先秦生物科技有限公司提供，是一種以P43 啟動子控制外源基因表達的大腸桿菌-芽孢桿菌穿梭型表達載體，其在芽孢桿菌中的復制原點和卡那霉素抗性基因均來源于質粒pUB110， 該質粒已保藏在江南大學中國高校工業微生物資源數據平臺，保藏編號為CICIMB6941。

1.1.2 工具酶及主要試劑 聚合酶ExTaq 以及限制性內切酶EcoRI、XbaI 等： 大連寶生物工程有限公司產品；質粒提取試劑盒：北京博大泰克生物技術有限公司產品；PCR 產物純化試劑盒及DNA 片段膠回收試劑盒：康寧生命科學（ 吳江） 有限公司產品；普魯蘭糖：Sigma 公司產品；蛋白質標準相對分子質量：賽默飛世爾（中國）有限公司產品；預染蛋白質相對分子質量標準PageRulerTM 26616、氨芐青霉素鈉、卡那霉素、IPTG、SDS-PAGE 電泳預制膠： 上海生工生物工程技術服務有限公司產品；其它試劑： 國藥集團上海化學試劑有限公司產品；紅薯粉（紅薯面）：本課題組在江蘇省東海縣農村收購。

1.1.3 引物合成及測序 根據地表地芽孢桿菌KCTC3922 的 基 因 組 序 列 （NCBI 登 錄 號 ：CP014342.1）設計擴增普魯蘭酶基因的引物：

Pxw01：5′-AATTACCGGAATTCTTATGCTTCAC ATTCACCGAAC-3′

Pxw02：5′ -AATTACCGTCTAGATTAGCGGGCA TTGATCGCTT C-3′

Pxw03：5′ -AATTACCGACTAGTAGGAGGAAT CTTATGCTTCACATTCACCGAAC-3′

Pxw04：5′ -AATTACCGGGATCCTTAGCGGGCA TTGATCGCTT C-3′

引物中帶下劃線部分為內切酶識別位點，帶方框部分為引物自帶的核糖體結合位點序列。

引物由上海賽百盛基因技術服務有限公司合成，測序由蘇州泓迅生物科技有限公司完成。

1.1.4 培養基 LB 培養基：10 g/L 蛋白胨，10 g/L NaCl，5 g/L 酵母粉，加入1.5%的瓊脂粉為固體培養基， 使用時均補加氨芐青霉素至終質量濃度為100 μg/mL。 發酵培養基為TB 培養基，北京吉美生物科技有限公司產品，用于大腸桿菌發酵時補加終質量濃度為100 μg/mL 的氨芐青霉素和終質量濃度為0.5 mmol/L 的IPTG，用于枯草芽孢桿菌發酵時添加 15 μg/mL 卡那霉素。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組質粒pLac03-pul3665 的構建 提取地表地芽孢桿菌XQ3665 的基因組DNA， 以Pxw01、Pxw02 為引物進行PCR 擴增。擴增產物電泳分離后回收，與pMD-18TSimple 連接過夜，轉化大腸桿菌JM109 感受態細胞， 在含有氨芐青霉素的LB 平板上挑取轉化子，提取質粒酶切驗證后測序。 選取重組質粒用EcoRI、XbaI 酶切， 分離其中的插入片段與經同樣酶切的表達載體pLac03 連接，轉化JM109感受態細胞， 挑取轉化子并提取質粒進行酶切驗證，驗證正確的重組質粒命名為pLac03-pul3665。

1.2.2 重組質粒pUP43-pul3665 與重組枯草芽孢桿菌的構建 以重組質粒pLac03-pul3665 為模板，以 Pxw03、Pxw04 為引物進行 PCR 擴增， 擴增產物經電泳分離并回收后用SpeI 和BamHI 酶切， 并與經同樣酶切的載體pUP43 連接，連接物轉化JM109感受態細胞， 在含氨芐青霉素的平板上挑選轉化子，提取質粒后酶切鑒定，驗證正確的重組質粒命名為pUP43-pul3665。

采用 Spizizen 法[13]將質粒 pUP43-pul3665 和空質粒pUP43 分別轉化枯草芽孢桿菌1A717。 在含有15 μg/mL 卡那霉素的LB 平板上檢出轉化子。 挑取轉化子劃線分離后提取質粒。 由于芽孢桿菌中提取的質粒電泳條帶模糊，所以將從重組芽孢桿菌中提取的質粒再次轉化大腸桿菌JM109， 在含氨芐青霉素的LB 平板上檢出轉化子， 挑取轉化子后再從大腸桿菌中提取質粒酶切鑒定。 從芽孢桿菌中提取質粒的方法同文獻[14]。

1.2.3 重組普魯蘭酶的誘導表達 重組大腸桿菌誘導表達方法如下：取重組菌株于LB 平板劃線，取單菌落于 20 mL LB 液體培養基，37 ℃、200 r/min振蕩培養10 h。按照1%的接種體積分數接種50 mL TB 培養基， 搖瓶培養至 OD600為 0.6~0.8 時加入IPTG 誘導表達，在 37 ℃、200 r/min 振蕩培養 48 h。取培養液于 8 000 r/min 離心 10 min，按文獻[9]方法，收集細胞內、周質空間和胞外成分檢測酶活。

重組枯草芽孢桿菌誘導方法如下：接種重組菌單菌落于 20 mL LB 液體培養基，30 ℃、200 r/min搖瓶培養12 h。按2%接種體積分數接種TB 液體培養基，30 ℃、200 r/min 搖瓶培養， 每隔 8 小時取樣，取部分樣品檢測OD600。 其余樣品8 000 r/min 離心10 min，取上清液直接檢測酶活。沉淀細胞用磷酸鹽緩沖液懸浮后超聲波破細胞檢測胞內酶活，芽孢桿菌發酵試驗均做3 個平行樣。

1.2.4 重組普魯蘭酶的純化及酶活測定 取胞外粗酶液 5 mL， 經 0.22 μm 濾膜過濾后用 Hitrap Desalting 柱脫鹽，緩沖液為 pH 7.0、0.02 mol/L 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，收集脫鹽后的酶液。

用HiTrap QFF 陰離子交換柱進行第一次純化，平衡及上樣緩沖液為pH 7.0、0.02 mol/L 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，用含1 mol/L NaCl 的pH 7.0、0.02 mol/L 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液進行線性梯度洗脫，收集酶液檢測酶活力。

用HiTrap Butyl HP 疏水柱對上一步純化得到的酶液進行疏水柱層析。 用pH 7.0、0.02 mol/L 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液進行線性梯度洗脫， 收集酶液檢測酶活并用SDS-PAGE 電泳檢測蛋白質純度。

考馬斯亮藍法測定純酶的蛋白質含量，用于計算酶的比活力。 普魯蘭酶酶活測定方法同文獻[15]。

1.2.5 重組普魯蘭酶酶學性質的研究 最適溫度的測定：將酶液置于40~70 ℃反應，測定不同溫度對酶活性的影響。 以最高酶活力為100%，計算相對酶活性。

最適pH 的測定： 配制 pH 為5~8 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液， 測定不同pH 對酶活性的影響。以最高酶活力為100%，計算相對酶活性。

重組酶溫度耐受性的測定：將純酶分別放置于50、55、60 ℃金屬浴，間隔 1 h 取樣。 以未進行熱處理酶液的酶活為100%，計算相對酶活性。

酶學性質分析均做3 個平行樣。

1.2.6 重組普魯蘭酶對普魯蘭糖的降解 配制10 g/L的葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖標準樣及普魯蘭糖，取10 g/L 的普魯蘭多糖溶液與過量普魯蘭酶反應，將完全降解產物及標準樣品用0.22 μm 的濾膜過濾處理，進行 HPLC 檢測。 色譜條件：Bio-Rad Aminex HPX-87H column（300 mm×7.8 mm），流動相為5 mmol/L 的 H2SO4，超聲波脫氣，流量為 0.5 mL/min，柱溫65 ℃。檢測器為HITA-CHI 高效液相色譜儀示差折光檢測器。

1.2.7 紅薯粉絲傳統制作方法

1）制芡糊 取紅薯粉100 g，用100 mL 溫水懸浮，在55 ℃水浴鍋中保溫5 min，一次性沖入700 mL沸水，并劇烈攪拌制成芡糊。

2）和面 芡糊中加入4 g 食鹽及900 g 紅薯粉手工和面，揉成面團后用保鮮膜覆蓋，在20 ℃恒溫箱中放置30 min。

3）制絲、煮絲 取一普通水鍋加入約5 L 以上的自來水，將水煮沸。 將面團放入粉絲機中壓制成絲，壓出的絲直接進入沸水中，一般煮制1~2 min 后撈出，轉移到一盛有涼水的鍋中冷卻。

4）理絲、晾干：將冷卻的粉絲撈出后掛在竹竿上，手工將并條的粉絲分開，在陰涼通風處晾干即為成品粉絲。

明礬粉絲制作時是在制芡糊階段在紅薯粉懸液制成后加入相當于粉絲中淀粉總質量0.1%的明礬，待明礬充分溶解后進入后續階段。 酶法粉絲制作是在芡糊制成后加入一定量的酶液，混合后在55℃保溫30 min。 粉絲制作時所述普魯蘭酶酶活均為55 ℃、pH 6.5 條件下檢測的酶活。 粉絲機為永康市博寧工貿有限公司產品，型號為HN-2006。

1.2.8 粉絲斷條率計算 準確截取10 cm 長，無損傷的成品粉絲100 根， 平均放在5 個盛有500 mL去離子水的沸水杯中，微沸騰煮沸20 min。

1.2.9 膨潤度和煮沸損失率計算 取無損傷的粉絲若干，截成5 cm 長，在65 ℃烘箱中烘干至恒質量，稱取 5~6 g （m1），投入一裝有 300 mL 已煮沸的去離子的水燒杯中，持續微沸騰煮沸20 min，過程中不斷加水以保持水量基本恒定。 完成后將燒杯放入冰水混合物中迅速冷卻， 冷卻至約30 ℃時取出粉絲，用新華濾紙吸干表面水分，稱濕質量（m2）。 將上述粉絲放入65 ℃烘箱中烘至恒質量（m3）。

膨潤度（%）=m2/m3×100%

煮沸損失率（%）=（m1-m3）/m1×100%

膨潤度、煮沸損失率和斷條率試驗均做兩個平行樣。

2 結果與分析

2.1 普魯蘭酶基因pul3665 在大腸桿菌中的表達

提取地表地芽孢桿菌XQ3665 的基因組DNA作為模板，用引物 Pxw01、Pxw02 進行 PCR 擴增，電泳結果顯示目的條帶大小約為2.2 kb， 與基因組序列（NCBI 登錄號：CP014342.1）中預測的普魯蘭酶基因大小一致。PCR 產物純化后與pMD-18TSimple 連接，連接物轉化大腸桿菌JM109，任選4 個轉化子提取質粒后測序，結果顯示，4 個轉化子質粒中插入片段的序列完全一致。 將上述測序結果提交NCBI 用Blast 軟件進行序列搜索比對，結果顯示，該插入片段的序列與地表地芽胞桿菌KCTC3922 基因組序列（NCBI 登錄號：CP014342.1）中一段推測為普魯蘭酶的基因的同源性最高為99%，所克隆基因命名為pul3665 用于進一步研究。

上述載體分別用EcoRI 和XbaI 酶切后分離其中2.2 kb 的插入片段， 與經同樣酶切的表達載體pLac03 連接， 連接物轉化大腸桿菌JM109， 任取4個轉化子提取質粒后用EcoRI 和XbaI 酶切電泳，結果顯示4 個轉化子所含質粒雙酶切后均獲得2.6 kb 和2.2 kb 的兩個片段， 符合重組質粒pLac03-pul3665 應有特征（圖 1（a））。 圖 1（b）是其中一個轉化子的質粒的酶切電泳圖，該質粒轉化子命名為大腸 桿 菌 JM109/pLac03 -pul3665， 簡 稱 JM109/pLac03-pul3665，用于重組酶的表達。

圖1 重組質粒pLac03-pul3665 結構與酶切圖譜Fig. 1 Map and restriction analysis of pLac03-pul3665

將重組菌JM109/pLac03-pul3665 和含空質粒的重組菌JM109/pLac03 分別接種TB 培養基培養并誘導表達， 取不同的細胞成分檢測普魯蘭酶酶活。 結果顯示，含空質粒的對照菌JM109/pLac03 細胞各組分中均未檢測到普魯蘭酶酶活。 重組菌JM109/pLac03-pul3665 的各組分中均有明顯的普魯蘭酶酶活，其中發酵液中的酶活大約為6.8 U/mL，周質和胞質酶活分別為8.5 U/mL 和33.6 U/mL。 可見，基因pul3665 編碼的蛋白質確實為普魯蘭酶，為便于敘述該蛋白質命名PUL3665。表達載體pLac03本身并沒有信號肽編碼區， 而pul3665 表達產物大量分泌到周質和發酵液中，顯然是在PUL3665 自身信號肽控制下完成的。普魯蘭酶PUL3665 的蛋白質序列與來源于嗜熱脂肪地芽孢桿菌的普魯蘭酶GsP的同源性高達83%，顯然是同一類型的分子。 用信號肽分析軟件SignalP 對兩者進行分析， 均未發現明顯的信號肽，這兩種分子很可能都是通過雙精氨酸途徑向細胞外分泌，對此我們在有關GsP 蛋白的研究中進行了比較詳細的論述[11]， 作者主要研究PUL3665 的應用性能，對此不再贅述。

2.2 重組酶PUL3665 的純化

由于發酵液中雜蛋白質相對較少，因此取發酵液濃縮后進行蛋白質純化。 重組菌的表達情況及純化結果見圖2。由圖2 的1、2 泳道比較可見，JM109/pLac03-pul3665 發酵液相比對照菌有一條明顯的差異表達條帶，用軟件Image Lab4.0 分析，這一差異條帶代表的相對分子質量約81 000， 與根據pul3665 基因序列推測的蛋白質的理論相對分子質量81 100 一致，結合酶活分析可以進一步確認重組菌JM109/pLac03-pul3665 表達產物為普魯蘭酶PUL3665。 進一步用離子交換層析及疏水柱層析純化酶液，結果見圖 2 中 3、4、5 泳道。 泳道 3 是經過離子交換層析的結果，可見雖然蛋白質得到了一定的純化但仍有雜帶，4、5 泳道對應的是疏水柱純化后兩個收集管中的蛋白質的條帶， 均為單一條帶，可見經過兩次純化后獲得了電泳純的重組酶PUL3665。 國內外對地芽孢桿菌屬部分菌株來源的普魯蘭酶已有一定的報道[11，16-17]，但目前尚未見有關地表地芽孢桿菌普魯蘭酶重組表達及酶學性質的研究報道，因此取泳道4 對應的收集管中的蛋白質進行純酶酶學性質研究。

2.3 重組酶PUL3665 酶學性質分析

在緩沖液pH 6.5 的條件下測定溫度對重組酶PUL3665 酶活力的影響，結果見圖3。當反應溫度由40 ℃升至55 ℃，重組酶的相對酶活逐漸升高。60 ℃時，PUL3665 酶活明顯低于55 ℃時的酶活。 當溫度高于60 ℃后，相對酶活迅速下降。

圖2 重組酶PUL3665 表達及純化結果Fig. 2 SDS-PAGE analysis of expression and purification of the PUL3665

圖3 溫度對PUL3665 酶活的影響Fig. 3 Effects of temperature on the activity of PUL3665

在反應溫度為55 ℃時測定pH 對酶活的影響，結果見圖 4。PUL3665 的最適 pH 為 6.5，但在 pH 為5.5~7.5 范圍內時，重組酶的相對酶活均在最高酶活的80%以上。 結合最適溫度檢測結果，PUL3665 的最適反應條件為55 ℃、pH 6.5， 進一步結合所用樣品純酶蛋白質質量的測定結果可計算得到PUL3665 純酶在最適條件下的比酶活為32 U/mg。對比文獻對 GsP 的研究[11]，GsP 和 PUL3665 的最適pH 均為 6.5， 但 GsP 對 pH 變化很敏感， 在 pH 5.5和pH 7.5 條件下其酶活只有最高酶活的60%左右。GsP 的最適溫度為65 ℃， 純酶比酶活為38 U/mg。可見GsP 的熱穩定性和比酶活優于PUL3665，而PUL3665 的pH 適應性優于前者。

圖4 pH 對PUL3665 酶活的影響Fig. 4 Effects of pH on the activity of PUL3665

在最適pH 條件下， 測定PUL3665 的熱穩定性，結果見圖5。 50 ℃保溫5 h，相對酶活力可保持80%。 55 ℃保溫1 h， 相對酶活力可保持約80%以上，保溫2 h，相對酶活力可保持60%。 重組酶在60 ℃失活較快， 但保溫1 h 仍可保持50%以上的酶活。

圖5 PUL3665 的熱穩定性Fig. 5 Thermal stability of PUL3665

2.4 重組酶PUL3665 對普魯蘭糖的降解

取過量普魯蘭酶作用于1%的普魯蘭多糖，其降解產物經HPLC 分析結果見圖6。對照1%標準葡萄糖、麥芽二糖及麥芽三糖的響應值，只有在麥芽三糖處與標準的響應值相當。 普魯蘭酶的降解產物中只有麥芽三糖。 普魯蘭糖是一種多個麥芽三糖通過α-1，6-糖苷鍵連接而成的多糖， 對圖6 分析可知，PUL3665 不水解普魯蘭糖中麥芽三糖內部的α-1，4-糖苷鍵。 可溶性淀粉是一種葡萄糖，主要通過α-1，4-糖苷鍵連接而成的多糖， 與碘反應呈藍色。 進一步將PUL3665 與1%的可溶性淀粉混合后長時間反應，結果顯示反應液的藍值沒有明顯的變化，可見PUL3665 不降解α-1，4-糖苷鍵。上述實驗可見， 普魯蘭酶PUL3665 只特異性水解α-1，6-糖苷鍵，為Ⅰ型普魯蘭酶。

圖6 PUL3665 降解普魯蘭多糖的產物分析Fig. 6 Products of PUL3665 decomposition of pullulan

2.5 普魯蘭酶基因pul3665 在枯草芽孢桿菌中的表達

從PUL3665 酶學性質的分析可見，PUL3665 是一種具有比較寬泛pH 適應性的I 型普魯蘭酶，比較適合于粉絲制作工藝。 枯草芽孢桿菌是一種公認為食品安全的微生物，相對于大腸桿菌具有更強的向細胞外分泌外源蛋白質的能力，顯然更適合于表達用于粉絲制作的外源蛋白質。 我們進一步以淀粉酶基因缺失的枯草芽孢桿菌1A717 菌株為宿主對PUL3665 進行異源表達。

以載體 pLac03-pul3665 為模板， 以 Pwx03、Pxw04 為 引物進 行 PCR 擴 增， 獲 得 2.2 kb 的pul3665 基因，用SpeI 和BamHI 酶切后與經同樣酶切的枯草芽孢桿菌表達載體pUP43 連接，轉化大腸桿菌 JM109。 圖 7（a）是其中 2 個轉化子所含質粒的酶切圖譜，圖7（b）是重組質粒pUP43-pul3665 結構圖。 由圖 7 可見，這兩個質粒用 SpeI 和 BamHI 酶切后獲得兩個條帶， 一條約2.2 kb 與插入片段基因pul3665 一致， 另一條約 7.0 kb 的條帶與 pUP43 空質粒一致，均符合pUP43-pul3665 應有特征。 大量提取重組質粒pUP43-pul3665 轉化枯草芽孢桿菌1A717， 在含卡那霉素的LB 平板上檢出轉化子，任取10 個轉化子劃線分離后提取質粒并將所提取的質粒再轉化大腸桿菌JM109， 再一次從大腸桿菌轉化子中提取質粒酶切電泳。 結果顯示，從上述10 個枯草芽孢桿菌轉化子中提取后又轉回大腸桿菌的質粒的酶切電泳條帶與圖7（a）中的條帶完全一致，可見上述10 個轉化子都是pUP43-pul3665 的轉化子。 取上述10 個枯草芽孢桿菌轉化子進行搖瓶發酵，酶活檢測顯示，在TB 培養基中10 個轉化子均有較高的酶活。含空質粒pUP43 的重組菌則只有很微弱的酶活，這可能是枯草芽孢桿菌自身普魯蘭酶基因表達產物[17]。 取其中一株編號為XWB08 的重組質粒的轉化子命名為B. subtilis 1A717/pUP43-pul3665 XWB08，簡稱XWB08，用于后續研究。

圖7 重組質粒pUP43-pul3665 結構與酶切圖譜Fig. 7 Map and restriction analysis of pUP43-pul3665

在TB 培養基中進行發酵實驗，結果見圖8。重組菌XWB08 發酵至48 h 時酶活達到最高值，為113 U/mL，以后迅速下降，這可能源于宿主菌自身蛋白酶對外源蛋白質的降解[19-20]。 進一步取發酵液適當稀釋后進行SDS-PAGE 電泳，結果見圖9。相對于含pUP43 空質粒的對照菌，含重組質粒的菌株XWB08 在相對分子質量81 000 附近有一明顯的差異表達條帶，該條帶相對分子質量與PUL3665 理論相對分子質量一致，結合酶活測定結果可以認定為枯草芽孢桿菌表達的PUL3665 分子。

取各個發酵時間段的重組菌細胞，超聲波破碎后檢測細胞內酶活，結果顯示，重組菌細胞內均未檢測到酶活。 同樣條件下，取細胞破碎液進行SDSPAGE 電泳，結果顯示含XWB08 和含空質粒的對照菌的蛋白質條帶在81 000 附近未發現明顯的差異表達條帶。 酶活檢測和SDS-PAGE 電泳結果均顯示， 基因pul3665 在枯草芽孢桿菌中的表達產物可以全部分泌到細胞外。 這個結果與pul3665 在大腸桿菌中的表達的情況基本一致，只是PUL3665 在枯草芽孢桿菌中的分泌效率更高，可以全部分泌到細胞外。 與pLac03 一樣，表達載體pUP43 本身也沒有信號肽編碼區，pul3665 表達產物在芽孢桿菌中的高效分泌顯然是依靠自身結構實現的。

圖8 重組菌B. subtilis 1A717/pUP43-pul3665 XWB08發酵進程Fig. 8 Fermentation process of B. subtilis 1A717/pUP43-pul3665 XWB08

圖 9 重組菌 B. subtilis 1A717/pUP43-pul3665 XWB08 胞外蛋白質Fig. 9 SDS-PAGE analysis of extracellular protein of B. subtilis 1A717/pUP43-pul3665 XWB08

2.6 普魯蘭酶PUL3665 在紅薯粉絲制作中的應用

將XWB08 表達的普魯蘭酶用超濾機進行濃縮，獲得的濃縮酶液的酶活為1 055 U/mL，用于紅薯粉絲的制作。 由表1 可見，按傳統方法進行粉絲制作時，如果不添加普魯蘭酶或明礬，在煮絲階段粉絲間會發生比較嚴重的并條，給后續理絲工作帶來很大困難， 所制得的粉絲幾乎都帶有表面損傷，難以進行后續試驗。 在制芡糊階段按每克芡糊紅薯粉使用1 U 的PUL3665，則煮絲階段的并條現象明顯減少， 但由此制得的粉絲的斷條率約為15%，未能達到粉絲行業斷條率10%以下的質量要求。 如果加入2 U 的PUL3665 處理芡糊則并條和斷條現象均進一步減少，粉絲斷條率降至10 %以下，可以獲得質量合格的粉絲。 繼續提高酶的用量，產品質量不再有明顯提高，但也沒有明顯的負面影響。 考慮生產成本，用PUL3665 制作粉絲時，酶的用量以2 U 為比較合適。 表2 是本課題組前期工作中獲得的另一種中性普魯蘭酶GsP[10-11]用于粉絲制作的情況。由表2 可見，GsP 用于粉絲制作時， 使用效果與PUL3665 基本一致，其最適用量也是每克芡糊紅薯粉加酶2 U 為合適。 表3 所列是采用目前市場上可以購買得到的一種耐酸性普魯蘭酶X 的實驗結果，從這個結果可知，用市售普魯蘭酶X 處理芡糊也能制作出質量合格的粉絲， 但存在兩個方面的問題。首先是酶的用量比較大，每克芡糊紅薯粉的酶用量為10 U。市售普魯蘭酶是針對制糖工藝開發的酸性普魯蘭酶，這種酶在中性條件下不穩定，這可能是酶的用量大的原因。 根據本課題組了解，這種普魯蘭酶來源于 Bacillus deramificans， 其最適 pH 為4.0， 在其最適條件下酶活可以達到3 800 U/mL，而在pH 6.5 條件下這種酶的酶活只有320 U/mL，這與文獻報道的這種酶的性質基本一致[15]。 第二個問題是酶的用量需要嚴格控制，酶的用量低于5 U 或高于20 U 都有可能出現嚴重并條或爛糊現象。 過量使用普魯蘭酶X 導致出現爛糊現象可能與這種普魯蘭酶中的淀粉酶有一定的關系。 目前市售普魯蘭酶一般是用重組地衣芽孢桿菌生產的，而地衣芽孢桿菌本身是耐高溫α-淀粉酶的生產菌，因此普魯蘭酶產品中很可能有α-淀粉酶。 對此，作者將1%的可溶性淀粉和上述3 種普魯蘭酶混合后進行保溫，結果顯示，PUL3665 或GsP 和淀粉混合后，混合液與碘反應后始終顯示藍色，而普魯蘭酶X 與淀粉的混合液與碘反應的顏色初期為藍色，大約15 min后變為淺黃色，顯示淀粉已經被降解。 可見，普魯蘭酶X 中混雜的淀粉酶活性有可能對淀粉進行過度降解，因此這種酶在粉絲制作中使用時需要嚴格控制用量。

紅薯粉是一種未經純化的初級農產品，由于紅薯品種、加工方法等的不同其品質差異很大，其中之一是以紅薯粉制成的芡糊的pH 波動范圍比較大。 本課題組在江蘇省東海縣農村調查的情況看，紅薯粉制成的芡糊的pH 一般在6.0~7.0 之間，但有些農戶家的紅薯粉可以達到pH 5.5 甚至更低，這可能對酶的作用產生較大的影響，表4—5 是一種pH 5.5 的編號為2 號的紅薯面用于制作粉絲時普魯蘭酶 PUL3665 和 GsP 的作用效果。 比較表 4、表 1 可見， 以2 號紅薯粉為原料制作粉絲時，PUL3665 的作用效果與其作用于1 號紅薯粉的效果相當。 比較表5 和表2 可見， 以2 號紅薯粉為原料制作粉絲時，GsP 的作用效果與作用于1 號紅薯粉的效果有明顯差異，前者需要按照每克芡糊淀粉4 U 的量添加酶處理2 號紅薯粉芡糊才能獲得斷條率在10%以下的成品粉絲。 這個差異顯然與兩種普魯蘭酶對pH 變化的適應性差異有關。 GsP 對pH 變化高度敏感，pH 5.5 時其酶活只有最適條件pH 6.5 時酶活的60%， 而 PUL3665 則對 pH 變化相對不敏感，在pH 5.5~7.5 的范圍內其酶活均在最高酶活的80%以上。

表1 PUL3665 不同添加量對紅薯粉絲質量的影響Table 1 Effects of PUL3665 on the quality of sweet potato flourvermicelli

表2 GsP 不同添加量對紅薯粉絲質量的影響Table 2 Effects of GsP on the quality of sweet potato flour vermicelli

表3 普魯蘭酶X 不同添加量對紅薯粉絲質量的影響Table 3 Effects of pullulanase X on the quality of sweet potato flourvermicelli

表4 PUL3665 不同添加量對紅薯粉絲質量的影響Table 4 Effects of PUL3665 on the quality of sweet potato flourvermicelli

表5 GsP 不同添加量對紅薯粉絲質量的影響Table 5 Effects of GsPon the quality of sweet potato flourvermicelli

3 結 語

作者克隆了地表地芽孢桿菌XQ3665 的普魯蘭酶基因pul3665 并實現了異源表達， 獲得了重組酶PUL3665。 PUL3665 是一種 I 型普魯蘭酶，最適溫度為55 ℃，比酶活32 U/mg。 與本課題組前期研究過的另一種地芽孢桿菌來源的普魯蘭酶GsP 相比，PUL3665 最重要的特點是其具有較為寬泛的pH 適應范圍，在pH 5.5~7.5 范圍內其酶活均在最高酶活的80%以上。 這一特點使這種酶在原料成分復雜、品質變化較大的紅薯粉為原料的粉絲制作中表現出一定的優勢。 目前，粉絲的傳統生產工藝的主要應用場所是農村小作坊，其原料大多從農戶家中收購，產品品質變化大，而由于條件所限也很難對原料性質進行分析和質量控制，因此很難根據原料的變化對酶的使用量和使用方法進行調整。 針對這種情況，酶的使用效果的穩定性就成為影響其將來市場推廣的重要因素。作者選擇了pH 為6.5 和5.5 的1 號和2 號兩種紅薯粉進行粉絲制作的試驗， 初步研究結果顯示，PUL3665 的最適用量均為每克芡糊粉2 U，而用GsP 的最適用量則前者為2 U 后者為4 U， 初步證明在紅薯粉絲制作中PUL3665 使用效果更為穩定。

構建的重組菌B. subtilis 1A717/pUP43-pul3665 XW08 在未經優化的搖瓶發酵條件下發酵后最高酶活為113 U/mL，重組酶全部分泌到發酵液中，便于產品的提取。 XW08 的發酵液經超濾獲得的濃縮酶液的活力為1 055 U/mL。 在紅薯粉絲制作中，酶的用量為每克芡糊粉2 U。 芡糊粉一般占粉絲紅薯粉總量的10%，即每千克粉絲中酶的用量為200 U，相當于濃縮酶液0.19 mL，即添加量為0.019%，這個添加量遠低于明礬或目前已見報道的其它明礬替代物的添加量，如果考慮酶液中絕大部分為水，則實際干物質的添加量更小。 酶是一種蛋白質，一般來講在加熱變性后與普通蛋白質并沒有不同。 普魯蘭酶水解芡糊的產物為直鏈淀粉，蛋白質和直鏈淀粉都是紅薯粉的正常成分， 因此從食品安全角度考慮，普魯蘭酶水解芡糊是一種值得重視的粉絲制作方法。

綜上所述，PUL3665 有希望開發成一種用量小、使用效果穩定的新型明礬替代物。