蜂毒肽在大腸桿菌中的高效融合表達與純化

周麗仙 ， 張榮珍 *， 李利宏 ， 徐 巖

（1. 江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學 工業微生物教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

蜂毒肽來自于歐洲蜜蜂（Apis mellifra），是蜜蜂毒液中的主要毒性成分，是一種重要的陽離子生物活性肽，具有很好的抗菌[1-3]、抗炎癥[4-7]、抗腫瘤[8-11]和抗艾滋[12]等生物功能。

蜂毒肽由 26 個氨基酸殘基組成 （NH2-GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ -CONH2）， 其中疏水性主要集中在氨基末端區域（殘基1~20），而親水性主要集中在含有一段帶正電荷的氨基酸殘基的羧基末端區域（殘基21~26）[13]。 蜂毒肽因具有兩親性質而具有水溶性，容易結合在帶負電荷的膜表面[14]，對膜具有強擾動活性，通過形成跨膜孔或離子通道或以表面活性劑的活性方式作用，伴隨著原子、離子和分子的泄漏以及膜滲透性的增強來干擾磷脂雙分子層的完整性[15-17]。 在蜜蜂的生物合成過程中，首先形成含信號肽和前導肽的前體蛋白——前蜂毒肽（proMET），經過剪切前導肽和信號肽后釋放形成蜂毒肽（MET）[18]。 由于蜂毒肽前體蛋白富含酸性氨基酸和脯氨酸，且前結構域帶有高度負電荷而賦予分子整體負電荷，因而比蜂毒肽具有更大的溶解度，也因此降低了對細胞膜的破壞能力[10]。

制備蜂毒肽主要有3 種途徑：從天然蜜蜂毒液中直接分離純化[19]、化學合成法以及生物法制備。目前， 蜂毒肽的獲得方式主要是從蜂毒中分離提純，或者通過化學合成的方式來獲得。 由于蜂毒肽只占蜂毒干質量的50%，從蜂毒中分離大量蜂毒肽存在極大的局限性。 且分離純化蜂毒肽首先要獲得蜂毒，生產中常用電刺激蜜蜂采取蜂毒，往往以蜜蜂生命為代價，不利于蜜蜂群勢發展和養蜂生產。 并且由于蜂毒成分復雜，存在多種蛋白質，且各組分相對分子質量接近，尤其是與蜂毒肽相對分子質量接近的磷脂酶A2，造成了純化上的困難、操作的繁瑣以及高成本， 使蜂毒肽的廣泛應用受到了限制。化學合成法主要是以氨基酸為原料，通過固相合成法等方法合成多肽或蛋白質，具有污染嚴重且目標蛋白質得率低等缺點。

生物法制備蜂毒肽，由于蜂毒肽相對分子質量只有2 900 且不容易活性表達， 同時在蜂毒肽的純化過程中也存在困難。 因為蜂毒肽表現出對細胞高效的致死性， 并且容易被細菌體內的蛋白酶降解，因而直接在原核系統中難以表達。 因此充分開發利用生物法制備蜂毒肽，具有很好的社會經濟效益和應用前景。

作者選用麥芽糖結合蛋白基因與蜂毒肽基因進行融合表達，獲得高效可溶性表達的蜂毒肽融合蛋白。 融合表達具有多方面的優點：實現外源基因的高效轉譯， 有助于減少或防止包涵體的產生，促進蛋白質的正確折疊，限制蛋白酶降解和有助于純化等。 麥芽糖結合蛋白 （maletose-binding protein，MBP）是大腸桿菌中麥芽糖積累途徑里一個重要的蛋白質，有研究報道 MBP 具有強助溶作用，可以顯著提高與之融合的外源蛋白質的可溶性表達[20]。 將麥芽糖結合蛋白質基因分別克隆在前蜂毒肽基因、蜂毒肽基因N 端，并插入6 個組氨酸標簽，構建在質粒pET15-b 上，在大腸桿菌中能夠高效可溶性表達目標蛋白質。 經兩步親和純化，得到了純度高達90%以上的融合蛋白質， 通過牛津杯抑菌實驗確定了融合蛋白質的抑菌功能。 該制備方法為生物法制備蜂毒肽奠定了較好的研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 質粒pET15b、MBP3、大腸桿菌（E. coli）JM109 和 BL21（DE3）菌株：江南大學釀造微生物學與應用酶學研究室保存；promet 基因：由生工生物工程（上海）股份有限公司（Sangon）合成；質粒pMD19-T： 購自寶生物工程 (大連) 有限公司（Takara）；引物合成和測序：由金唯智生物科技有限公司（蘇州）完成。

1.1.2 主要試劑 氨芐青霉素、 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 IPTG： 購自 Sangon 公司；PrimeStar?Max(Premix)、rTaq DNA polymerase for PCR、限制性內切酶 BamH I 和 Xho I、T4 DNA 連接酶、DNA marker、蛋白質相對分子質量marker： 購自 Takara 公司；PCR 產物純化試劑盒、DNA 膠回收試劑盒、 質粒抽提試劑盒：購自Omega 公司。

1.1.3 主要儀器 Ni 柱 （5 mL）、Dextrin Sepharose HP 親和吸附柱 （1 mL），?KTA purifier 蛋白質純化系統：購自美國GE Healthcare 公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR 引物的設計與合成根據Dmitry S.Perekalin等[21]報道的蜂毒肽氨基酸序列（含信號肽和前導肽）進行密碼子優化化學合成promet 基因， 并設計引物，序列見表 1。 上游引物 PF1、PF2，引入 His6 基因， 下游引物PR2 引入Xho I 酶切位點（用下劃線表示）。 以質粒MBP3 為模板設計引物， 上游引物PF3，5‘引入 Nco I 酶切位點，下游引物 PR2。

1.2.2 met、promet 基因與 mbp 基因的擴增 以化學合成的promet 基因為模板， 由引物對PF1/PR1、PF2/PR1 經 PCR1 分別擴增 MET 片段和 proMET 片段。 PCR 條件設為：98 ℃預變性 30 s，以 98 ℃變性15 s，55 ℃退火 15 s，72 ℃延伸 20 s， 進行 30 個循環，72 ℃保溫10 min；以質粒MBP3 為模板，由引物PF3、PR2 進行 PCR2 擴增 MBP 片段。 PCR 條件設為：98 ℃預變性 30 s， 以 98 ℃變性 15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸 1 min 10 s，進行 30 個循環，72 ℃保溫10 min； 以 MET 片段和 MBP 片段為模板，由引物對PF3/PR2 重疊延伸擴增MBP-MET 片段，以proMET 片段和MBP 片段為模板， 由引物對PF3/PR2 重疊延伸擴增 MBP-proMET 片段。PCR 條件設為：98 ℃預變性 30 s， 以 98 ℃變性 15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸 1 min 20 s，進行 10 個循環。 加入引物 PF3 和 PR2 再進行 20 個循環，72 ℃保溫10 min。PCR 產物用1 g/dL 的瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR 產物純化后用T4 DNA 連接酶與載體pMD19-T 于16 ℃連接4 h， 連接產物轉化E. coli JM109 感受態細胞，100 μg/mL 氨芐青霉素（Amp）抗性 LB 平板篩選陽性克隆，提取的質粒經瓊脂糖凝膠電泳及測序鑒定， 質粒分別命名為 pMD19T-MBP-MET 和pMD19T-MBP-proMET。

表1 引物Table 1 Primers

1.2.3 重組表達載體pET-MBP-MET 和pETMBP-proMET 構建 限制性內切酶Xho I 和Nco I 分別雙酶切重組克隆質粒pMD19T-MBP-MET 和pMD19T-MBP-proMET， 瓊脂糖凝膠回收插入片段MBP-MET 和MBP-proMET， 分別與用相同限制酶雙酶切的表達載體pET15-b 過夜連接，連接產物轉化E. coli JM109 感受態細胞，涂布 100 μg/mL Amp抗性LB 平板，挑取單菌落抽提質粒進行測序，序列正確的質粒分別命名為pET-MBP-MET 和pETMBP-proMET，構建示意圖見圖1。

圖 1 標簽融合的 pET-MBP-MET、pET-MBP-proMET質粒構建示意圖Fig. 1 Schematic representations of the tag-fused pETMBP-MET, pET-MBP-proMET constructs

1.2.4 融合蛋白質的誘導表達 分別轉化重組表達 質 粒 pET-MBP-MET、pET-MBP-proMET 至E. coli BL21（DE3）感受態，涂布于含有 100 μg/mL Amp 的 LB 的固體培養基上，37 ℃培養過夜， 挑取單菌落接種于含有100 μg/mL Amp 的LB 的液體培養基中，37 ℃、200 r/min 振蕩培養 10 h 后， 按體積分數1%的轉接至100 mL 新鮮的含有100 μg/mL Amp 的 LB 的液體培養基中，37 ℃、200 r/min 振蕩培養至OD600約為0.6 時，添加終濃度為0.1 mmol/L的誘導物異丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG），于30 ℃、200 r/min 誘導培養16 h。 4 ℃下離心收集菌體細胞，超聲破碎后收集離心的上清液及沉淀，加入4×SDS-PAGE loading buffer 煮沸 10 min， 用 9%SDSPAGE 進行驗證。

1.2.5 融合蛋白質MBP-MET 和MBP-proMET 的純化 重組大腸桿菌E. coli BL21/pET-MBP-MET、E. coli BL21/pET-MBP-proMET 分別在上述條件誘導培養后，將500 mL 發酵菌液離心收集菌體，加入50 mL Ni 柱平衡緩沖液 A1 （20 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0, 150 mmol/L NaCl），4 ℃高壓勻漿破碎后，12 000 r/min 離心 30 min 收集上清液， 經 0.22 μm微孔濾膜過濾，緩慢上樣于Ni 柱親和吸附柱，緩沖液 B1 （20 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 150 mmol/L NaCl，500 mmol/L 咪唑）線性洗脫，紫外檢測儀在線檢測洗脫峰，收集洗脫液進行SDS-PAGE 電泳檢測。

將初步純化后的樣品超濾濃縮，并更換緩沖液A2 （20 mmol/L Tris -HCl, pH 8.0, 200 mmol/L NaCl），上樣于 Dextrin Sepharose HP 親和吸附柱上，用緩沖液A2 洗脫雜蛋白質，緩沖液B2（20 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 200 mmol/L NaCl，10 mmol/L 麥芽糖） 洗脫目標蛋白質。 收集洗脫液， 用9% SDSPAGE 電泳檢測純化效果。

1.2.6 牛津杯法抑菌活性測定 準備E. coli BL21/pET-MBP-MET 細胞破碎上清液、 純化后 MBPMET、MBP-proMET 融合蛋白液。 從 E. coli JM109無抗平板上挑取單菌落至5 mL LB 液體培養基，37 ℃培養 4 h， 轉接 500 μL 種子液至 50 mL LB 培養基中，37 ℃培養 2 h 至 OD600=0.5。 預先傾倒20 mL LB 培養基至玻璃平板鋪平凝固。 吸取1 mL菌液至200 mL 保溫于50 ℃的瓊脂培養基中混勻，快速吸取5 mL 至平板鋪平待凝。 待上層培養基凝固后，將滅菌后的牛津杯（8 mm × 6 mm × 10 mm）垂直立于平板標志附近。 牛津杯中分別加入過濾除菌的 100 μL E. coli BL21/pET-MBP-MET 細胞破碎上清液和純化后MBP-MET、MBP-proMET 融合蛋白液（0.25 mg/mL），100 μL Amp（0.1 mg/mL）做陽性對照。 蓋上平皿蓋，將平皿置于37 ℃恒溫培養箱培養16~18 h。 觀察抑菌圈情況。

1.2.7 最小抑菌濃度（MIC）測定 采用微量稀釋法測定MBP-MET、MBP-proMET 融合蛋白質的最低抑菌濃度。 對數生長期的E. coli JM109 菌液按1 :105稀釋至 106cfu/mL， 取 100 μL 菌懸液加入 U 型微量板。 過濾除菌后的 MBP-MET、MBP-proMET 稀釋至終質量濃度分別為 160、140、120、100、80、60、40、20、10、5 μg/mL， 聚苯乙烯 U 型微量板每孔加入100 μL 稀釋后蛋白質液。 對照組加入 100 μL 無菌水，37 ℃振蕩培養18~20 h 后觀察結果。

2 結果與分析

2.1 met、promet 基因與 mbp 基因的擴增

蜂毒肽met、 前蜂毒肽promet 與麥芽糖結合蛋白 mbp 基因經 PCR 擴增后分別獲得 126、252、1 152 bp 的特異性片段， 見圖2。 重疊延伸后得到MBP-MET 和 MBP-proMET 片段。 將 PCR 產物連接至克隆載體pMD19-T，測序結果表明MBP-MET 基因片段正確插入pMD19-T 載體。

圖2 pET-MBP-MET 表達載體構建Fig. 2 Construction of pET-MBP-MET expression vector

2.2 重組表達載體pET-MBP-MET、pET-MBP-proMET 構建

對 pMD19T-MBP-MET、pET-MBP-proMET 和pET15-b 分別使用限制性內切酶Xho I 與Nco I 進行雙酶切處理， 膠回收片段大小為1 300 bp 的MBP-MET 基因片段、1 400 bp 的 MBP-proMET 片段和5 600 bp 的pET15-b 線性片段，使用T4 DNA連接酶過夜連接，連接產物轉化E. coli JM109，在氨芐抗性平板上挑取陽性克隆，提取的質粒進行測序鑒定， 得到 6 917 bp 的 pET-MBP-MET 和 7 043 bp的pET-MBP-proMET。

2.3 蜂毒肽融合蛋白質的誘導表達

將表達質粒 pET-MBP-MET 轉入 E. coli BL21，挑取單菌落培養，在 0.1 mmol/L IPTG、30 ℃條件下誘導表達，收集細胞，每100 mL 培養基能收集0.6 g 濕菌。 重懸并超聲破碎后離心收集上清液，進行SDS-PAGE 驗證。 結果如圖3 所示，上清液可見相對分子質量 46 200（見圖 3（a））和 50 800（見圖3 （b）） 的條帶， 分別與融合蛋白質 MBP-MET 和MBP-proMET 理論大小一致，且上清液中目標條帶濃度高于沉淀。 經凝膠電泳成像儀分析，上清液的目標條帶占全細胞總量的15%， 說明融合蛋白質MBP-MET 在重組大腸桿菌中主要以可溶性蛋白質的形式表達。

圖 3 E. coli BL21/pET-MBP-MET、E. coli BL21/pETMBP-proMET 表達產物SDS-PAGEFig. 3 SDS-PAGE analysis of expression products of E. coli BL21/pET-MBP-MET and E. coli BL21/pET-MBP-proMET

2.4 融合蛋白質MBP-MET 和MBP-proMET 的純化

將誘導表達后的重組菌E. coli BL21/pETMBP-MET 和 E. coli BL21/pET-MBP-proMET 分別離心收集菌體， 加入緩沖液A1 （20 mmol/L Tris -HCl, pH 8.0, 150 mmol/L NaCl） 重懸后用高壓勻漿機破碎， 離心后的上清液經0.22 μm 微孔濾膜過濾，使用Ni 柱親和吸附柱純化，分別用含30 mmol/L咪唑和100 mmol/L 咪唑的緩沖液B1 洗脫， 紫外檢測到出現洗脫峰。 收集洗脫液進行SDS-PAGE 電泳檢測，結果見圖4。 30 mmol/L 咪唑洗脫大量雜蛋白質，100 mmol/L 咪唑洗脫時目標蛋白質幾乎全部洗脫下來。 但經過Ni 柱親和柱純化后的目標蛋白質里含有雜質，需經過進一步純化。 因此將初步純化后的樣品超濾濃縮， 并更換平衡緩沖A2（20 mmol/L Tris - HCl, pH 8.0, 200 mmol/L NaCl），上樣于Dextrin Sepharose HP 親和吸附柱上， 用緩沖液A2 洗脫雜蛋白質， 以10 mmol/L 麥芽糖的緩沖液B2 洗脫目標蛋白質，SDS-PAGE 結果見圖 5。 經凝膠電泳成像儀分析SDS-PAGE 結果，最終得到純度高達90%的蛋白質樣品。 通過計算，每升菌液可以純化得到20 mg 左右的純蛋白質。

圖 5 融合蛋白質 MBP-MET、MBP-proMET 的 Dextrin Sepharose HP 純化Fig. 5 Purification of fusion protein MBP -MET and MBP-proMET with Dextrin Sepharose HP

2.5 牛津杯法測定MBP-MET 和MBP-proMET的活性

通過牛津杯實驗鑒定融合蛋白質MBP-MET 和MBP-proMET 的抑菌活性。 從圖6 可知，與陰性對照相比，純化后的MBP-MET 和MBP-proMET 均對大腸桿菌有明顯的抑制效果。 經測量MBP-MET 的抑菌圈直徑為 9.2 mm（見圖 6（a）），MBP-proMET 的抑菌圈直徑為 8.8 mm（見圖 6（b））。MBP-MET 的抑菌效果比MBP-proMET 好。可能由于融合蛋白質的相對分子質量比較大且結構較抗生素復雜，并且實現其生物活性還需要其特定的空間結構，而瓊脂平板的網狀結構不利于融合蛋白質快速的擴散到周圍，使得其抑菌圈相對抗生素的較小。

2.6 MBP-MET 和MBP-proMET 的最低抑菌濃度

微量稀釋法判斷不同質量濃度MBP-MET 和MBP-proMET 的純化后蛋白質對E. coli JM109 的抑菌效果，對照組有細菌生長，將肉眼觀察到沒有細菌生長的培養孔中的藥物質量濃度定為MIC，判斷生長抑制標準為肉眼觀察未發現培養液混濁或沉淀現象出現。 從表 2 可知，MBP-MET 對 E. coli JM109 的 MIC 為 100 μg/mL，MBP-proMET 對 E. coli JM109 的 MIC 為 140 μg/mL。

圖 6 融合蛋白質 MBP-MET、MBP-proMET 對 E. coli JM109 的抑菌效果Fig. 6 Antibacterial activity of fusion protein MBP-MET and MBP-proMET on E. coli JM109

表2 微量稀釋法測定MBP-MET、MBP-proMET 對大腸桿菌的MICTable 2 Determination of the MIC of MBP-MET and MBP-proMET against E. coli by microdilution method

3 結 語

蜂毒肽作為一種具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、溶血等多種生理活性的活性肽，已受到廣泛關注。 但由于蜂毒肽對細胞具有一定的致死性，蜂毒肽在原核生物和真核生物中難以表達。

人們曾通過重組蜂毒肽與其它功能性基因融合表達。文良柱等[22]將蜂毒肽5~12 位氨基酸與死亡素4~21 位氨基酸基因克隆在載體pET32-a 上，在E.coli BL21（DE3）中融合表達成雜合肽MT，但目標肽的產率沒有明確。 張宏剛等[23]將蜂毒肽（3~14）與貽貝素B（13~27）雜合，在巴斯德畢赤酵母（Pichia pasioris）中通過甲醇誘導表達獲得Mel - MytB 雜合肽，直接進行表達產物的抑菌分析，結果得到表達產物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、雞沙門氏菌等具有抑菌活性，但該實驗并未對表達產物進行純化得到單純雜合肽，且誘導時間長達24~72 h，培養時間較長。 楊光勇[24]通過SOE-PCR 技術連接抗白細胞介素 4 受體 （IL-4R） 單鏈抗體 scFv 與蜂毒肽（MLT）基因，構建抗IL-4R 單鏈抗體連接蜂毒肽的重組質粒 pET-32a-scFv-MLT， 轉入 E.coli BL21（DE3）內誘導表達，scFv-MLT 融合蛋白質主要以包涵體形式表達。

在重組蜂毒肽的文獻報道中，標簽蛋白質谷胱甘肽轉移酶 （GST） 在與蜂毒肽重組表達中應用最多，但GST 在增加蜂毒肽的可溶性表達上存在一定局限。 胡宗利等[25]將蜂毒肽（melittin）基因序列定向克隆到表達載體pESP-2 中， 構建GST-melittin 融合蛋白質，在裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）中進行異源表達，1 L 培養液收集到約5 g 鮮活酵母菌，純化得到400 μg 融合蛋白質，存在誘導時間較長，目標肽產率相對較低等局限。朱文赫等[26]將人工合成整合了腸激酶作用位點的蜂毒肽 （MEL）基因， 插入到載體pGEX-2T， 構建融合表達載體pGEX-MEL， 通過 E. coli BL21 （DE3） 成功表達GST-MEL 融合蛋白質，但可溶性表達產物較少，每毫克融合蛋白質經腸激酶切割后得到78.8 μg 蜂毒肽。 Buhrman 和 Jason S[27]構建了含有 GST-6×Hismelittin 的質粒 pJB-HTS-melittin 并在 E. coli Rosetta 2 細胞里表達，并用不斷增加濃度的輕度非離子去污劑從不溶部分重復萃取， 富集了GST-6×His-melittin 融合蛋白質，每升菌液能得到0.5~1 mg蜂毒肽融合蛋白。

作者采用融合表達的方案，首次應用麥芽糖結合蛋白質作為融合伴侶，通過增加溶解性增加了蜂毒肽的表達量，同時構建了含信號肽和前導肽的前蜂毒肽重組菌株， 克服了蜂毒肽對細胞的毒性，實現了蜂毒肽的可溶性表達。 通過Ni 柱和Dextrin Sepharose HP 兩步親和純化， 得到了高純度的融合蛋白質MBP-MET 和MBP-proMET。 牛津杯抑菌實驗鑒定了兩種融合蛋白質的抑菌活性， 且MBP-proMET 對大腸桿菌的最低抑菌濃度高于MBPMET，猜測可能是由于引入的前導肽和信號肽結構域中帶有高度負電荷增加了分子整體所帶負電荷，因而比蜂毒肽成熟肽單獨表達具有更大的溶解度，因而降低了對細胞膜的損傷能力。 最低抑菌濃度高于 Tony Picoli 等[28]報道的 42.5 μg/mL，說明麥芽糖融合蛋白質在增加蜂毒肽的溶解性的同時，其大分子結構對抑菌效果有一定的影響。 在試驗探究過程中， 曾設計采用TEV 蛋白酶切割大分子融合標簽，發現MBP 標簽蛋白質不完全影響蜂毒肽的功能，但對TEV 酶的切割有較大影響，究其原因可能是標簽蛋白質部分包裹了蛋白酶切位點。 也嘗試將蜂毒肽基因構建在pGEX-6p-1 上進行原核表達， 但目標蛋白質GST-MET 主要以包涵體形式表達， 說明不同的融合伴侶蛋白質對蜂毒肽的異源表達有較大的影響。蜂毒肽的蛋白質結構已經獲得解析[13]，整體結構為一個完整的α 螺旋，在后續研究中，我們將嘗試GST-MET 包涵體變復性實驗以及純化，并采用圓二色譜對MET 的二級結構進行復性監控，進一步為“純凈”蜂毒肽的制備奠定較堅實的研究基礎。