十棗湯對肺纖維化大鼠肺組織Ⅲ型膠原和基質金屬蛋白酶抑制因子1表達的影響※

趙曉婷 王燕青 牛 曉 逄淑婷 宋潤祺

(山東中醫藥大學第一臨床醫學院2018級碩士研究生，山東 濟南 250355)

特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一種局限于肺部的慢性進行性加重的纖維化性間質性肺炎，發病原因不明, 組織學和(或)影像學表現為尋常型間質性肺炎(UIP)，即明顯的纖維化和肺組織結構的破壞[1]。低倍鏡下可見分布不均的纖維化病灶，肺間質內出現炎性反應，伴肺結構重塑、蜂窩形成[2]。目前，IPF尚無有效治療手段，病情兇險，預后差，死亡率高，遠高于部分癌癥[3]，確診后生存時間3～5年[4]。為改善IPF患者生活質量，延長壽命，我們在臨床中常使用十棗湯治療IPF，具有良好效果，可見患者癥狀明顯減輕，起到一定的抗肺纖維化作用，但具體作用機制尚不明確。相關研究顯示，基質金屬蛋白酶抑制因子1(TIMP-1)和Ⅲ型膠原(COL3)與IPF密切相關。為探討十棗湯抗纖維化的機制，我們應用十棗湯干預博來霉素誘導的大鼠肺纖維化模型，在低倍鏡下觀察大鼠肺組織的病理形態學變化，觀察對大鼠肺組織COL3和TIMP-1表達的影響，以探討十棗湯對治療IPF的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SPF級SD大鼠96只，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，8周齡，體質量(200±20)g。在相對空氣濕度20%、室溫18～22 ℃的環境中飼養，自由進食、飲水，常規適應性喂養1周后開始實驗。

1.2 藥品及試劑

1.2.1 十棗湯 將大戟、甘遂、芫花研末過篩，按照1∶1∶1的比例混合均勻備用。按十棗湯原方記載，用10枚大棗(約30 g)煎煮后調制成300 mL，制備成濃度分別為18、90、180 mg/mL的十棗湯溶液。

1.2.2 藥品及制備 注射用鹽酸博來霉素(日本化藥株式會社，進口藥口注冊證號H20090885)，加0.9%氯化鈉注射液配置成5 mg/mL溶液；羧甲基纖維素鈉(上海麥克林生化科技有限公司)，加蒸餾水配制成1%羧甲基纖維素鈉溶液；吡非尼酮膠囊(北京康蒂尼藥業有限公司，國藥準字H20133376)，將50粒吡非尼酮(100 mg/粒)溶于1 000 mL 1%羧甲基纖維素鈉溶液，配制成5 mg/mL的吡非尼酮溶液。

1.2.3 試劑 蘇木素—伊紅(HE)染色試劑盒、PBS緩沖液干粉(北京索萊寶科技有限公司)；大鼠COL3酶聯免疫吸附測定試劑盒、TIMP-1酶聯免疫吸附測定試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)。

1.3 實驗儀器 電熱恒溫培養箱(山東省濰坊市精鷹醫療器械有限公司)；CX21光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；DW-HW50超低溫冷凍儲存箱(中科美菱低溫科技有限責任公司)；組織勻漿機(上海醫療器械廠有限公司)；HWS24型恒溫水浴箱(天津泰新特儀器有限公司)；微量移液器(賽默飛世爾科技公司)；AE100電子稱量儀(瑞士METTLER公司)；550型全自動酶標儀(美國BIO-RAD公司)；J2-21高速離心機(美國BECKMAN公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 分組及造模 將96只大鼠按照隨機數字表法分為6組，分別為空白組、模型組、吡非尼酮組、十棗湯低劑量組、十棗湯中劑量組、十棗湯高劑量組，每組16只。全部大鼠予10%水合氯醛溶液3 mL/100 g腹腔注射，用手術鉗提夾大鼠大腿部肌肉，若大鼠無反應，則證明麻醉成功。模型組、吡非尼酮組及十棗湯低、中、高劑量組通過氣管插管向大鼠氣管注入鹽酸博來霉素建立大鼠肺纖維化模型。將大鼠用細繩綁在大鼠固定器上，腹部向前，用細繩拴住大鼠門牙向上提系固定，使大鼠暴露口腔。將輸液用泵前軟管頭部剪成楔形用作氣管插管儀器，在管內注入適量0.9%氯化鈉注射液以便觀察。術前用棉棒清理大鼠口腔并將大鼠舌頭挑出到一側，用泵前軟管行氣管插管，若泵前軟管內液柱出現上下移動，則證明已插入氣管內，在大鼠吸氣時將0.2 mL博來霉素溶液注入氣管內，并注入1 mL左右空氣，然后拔出泵前軟管。將大鼠從固定器上取下并使其直立，左右旋轉大鼠并輕揉胸部數次，使博來霉素溶液均勻的流向雙肺。空白組大鼠通過氣管插管予0.9%氯化鈉注射液0.2 mL處理(方法同上)。

1.4.2 灌胃方法 各組造模后第2 d起進行灌胃。根據藥理實驗中動物與人體間的等效劑量換算[5]，十棗湯低、中、高劑量組灌胃給藥劑量分別為0.18、0.9、1.8 g/kg，吡非尼酮組給藥劑量為50 mg/kg,隔日1次，每周3次，其余4 d予0.9%氯化鈉注射液。模型組和空白組大鼠予0.9%氯化鈉注射液灌胃。灌胃均每日1次，灌胃容積為2 mL。

1.5 觀察指標

1.5.1 大鼠一般情況觀察 觀察各組大鼠的一般情況，包括大鼠的外形、體質量、活動狀態、進食進水情況及死亡情況等方面。

1.5.2 肺組織觀察 每組大鼠于造模后第14 d以注射麻醉的方式隨機處死8只大鼠(模型組、十棗湯低劑量組處死7只)，各組第28 d處死剩余大鼠(每組8只)。摘取雙肺組織，肉眼觀察肺組織形態、顏色、質地等。將右肺用0.9%氯化鈉注射液洗凈，放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h以上，制成病理切片，做HE染色，在10倍普通光學顯微鏡下觀察肺組織病理變化情況。

1.5.3 肺組織COL3、TIMP-1濃度 取左肺，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗干凈，將肺組織切割成合適大小放入EP管中，存入-80 ℃冰箱，采用酶聯免疫吸附法檢測標本中COL3、TIMP-1的濃度，嚴格按試劑盒說明書進行操作。

2 結 果

2.1 大鼠一般情況 大鼠死亡情況：造模第2 d，模型組死亡1只，十棗湯低劑量組死亡1只，其余組大鼠均未死亡。空白組大鼠毛色光澤，目光靈活，活動靈敏，呼吸均勻，精力充沛，爪甲紅潤，進食、飲水及排便正常，體質量增長迅速。模型組大鼠毛色晦黯枯槁，反應遲鈍，目光呆滯，少動，普遍喘憋較重，可聞及喘鳴，部分大鼠呈直立呼吸，爪甲紫紺，進食明顯減少，體質量增長緩慢。十棗湯低、中、高劑量組及吡非尼酮組大鼠皮毛較光滑但欠光澤，目光較靈活，反應較靈敏，呼吸欠均勻，精神可，活動較好，爪甲欠紅潤，進食飲水正常，排稀軟樣便，體質量逐漸增長。

2.2 肺形態觀察 空白組大鼠肺組織形態飽滿，呈淡紅色，表面光滑，彈性好。第14 d處死的模型組、吡非尼酮組及十棗湯低、中、高劑量組大鼠肺組織顏色呈黯紅，彈性差，表面不光澤，其中模型組部分大鼠肺組織可見有肺大泡。第28 d處死的模型組大鼠肺組織明顯偏小，多數呈蒼白色，表面凹凸不平，可見有淤血和肺大泡，吡非尼酮及十棗湯低、中、高劑量組大鼠肺組織較第14 d無顯著變化。

2.3 肺組織病理學觀察 空白組大鼠肺組織肺泡結構完整，肺泡壁未見增厚或塌陷，無炎性滲出。模型組大鼠第14 d肺組織可見肺泡壁增厚，肺泡內充斥大量滲出的炎性細胞，第28 d肺組織較第14 d肺組織炎性細胞滲出減少，肺泡結構破壞，破壞處可見成纖維細胞，肺間質內明顯可見膠原纖維。吡非尼酮組及十棗湯低、中劑量組大鼠肺組織與模型組大鼠相比，肺泡結構破壞程度輕，肺間質中膠原纖維含量較少；第28 d肺泡炎癥較第14 d減輕，膠原纖維減少。十棗湯高劑量組大鼠肺間質內膠原纖維含量最少，肺泡結構破壞程度最輕，第28 d肺泡結構破壞程度較第14 d減輕，纖維化減輕。見封3，圖1。

2.4 各組大鼠肺組織COL3、TIMP-1濃度比較

2.4.1 各組第14 d處死大鼠肺組織COL3、TIMP-1濃度比較 見表1。

表1 各組第14 d處死大鼠肺組織COL3、TIMP-1濃度比較

由表1可見，造模后第14 d，與空白組比較，模型組、吡非尼酮組及十棗湯低、中、高劑量組肺組織COL3、TIMP-1濃度升高(P<0.05)；與模型組比較，吡非尼酮組及十棗湯低、中、高劑量組肺組織COL3、TIMP-1濃度降低(P<0.05)；與吡非尼酮組比較，十棗湯低劑量組肺組織TIMP-1濃度升高(P<0.05)，十棗湯高劑量組肺組織COL3、TIMP-1濃度降低(P<0.05)；與十棗湯低劑量組比較，十棗湯高劑量組肺組織COL3濃度降低(P<0.05)，十棗湯中、高劑量組肺組織TIMP-1濃度降低(P<0.05)；與十棗湯中劑量組比較，十棗湯高劑量組肺組織COL3、TIMP-1濃度降低(P<0.05)。

2.4.2 各組第28 d處死大鼠肺組織COL3、TIMP-1濃度比較 見表2。

表2 各組第28 d處死大鼠肺組織COL3、TIMP-1濃度比較

由表2可見，造模后第28 d，與空白組比較，模型組、吡非尼酮組及十棗湯低、中、高劑量組肺組織COL3、TIMP-1濃度升高(P<0.05)；與模型組比較，吡非尼酮組及十棗湯低、中、高劑量組肺組織COL3、TIMP-1濃度降低(P<0.05)；與吡非尼酮組及十棗湯低、中劑量組比較，十棗湯高劑量組肺組織COL3、TIMP-1濃度降低(P<0.05)。

3 討 論

IPF屬現代醫學間質性肺疾病范疇，具有慢性、漸進性、致死性等特征,表現為呼吸困難和肺功能的進行性惡化。病理過程為肺泡持續性炎性反應，肺組織損傷，成纖維細胞增殖及細胞外基質(ECM)大量沉積，導致肺組織反復損傷、修復，最終造成肺組織中大量膠原沉積[6]，肺泡結構紊亂，其中以成纖維細胞增殖和ECM大量沉積為主要特征[7]。

研究顯示，ECM過度沉積主要由于ECM的合成與降解失衡。基質金屬蛋白酶(MMPs)及其抑制劑(TIMPs)是調節ECM降解的重要體系[8]，其中TIMP-1幾乎能抑制所有MMPs的活性[9]，在生理狀態下能夠維持ECM的降解、沉積平衡。TIMP-1本質是一種分泌性蛋白，由巨噬細胞和結締組織細胞產生[10]，在體液中廣泛存在,在肺間質纖維化過程中發揮重要作用。研究表明，IPF患者肺泡灌洗液及血清中TIMP-1含量明顯升高，且隨疾病的進展，TIMP-1表達逐漸增強[11]。高水平TIMP-1可減弱MMPs降解ECM的能力，使ECM降解減少，不斷沉積；還能改變肺泡毛細血管膜的功能，抑制肺組織的正常修復和膠原降解，導致肺間質纖維化的蜂窩狀改變[12]。

成纖維細胞增殖和產生膠原是IPF的重要環節[13]，COL3來源于肺組織成纖維細胞，是ECM中膠原的主要成分[14]，占間質膠原的30%～40%，主要見于肺間質內，包括肺泡壁、小葉間隔，在肺間質內構成復雜交織的網絡結構，使肺內組織保持良好的彈性[15]。研究顯示，在IPF早期，成纖維細胞異常增殖，致使COL3大量合成和分泌；晚期膠原代謝失調，膠原纖維大量沉積，導致肺組織被增厚的纖維囊壁分隔成多房囊狀結構，肺間質結構紊亂，即蜂窩肺[16]。IPF肺活檢組織中COL3的沉積含量明顯高于正常肺組織[17]，故在本研究肺纖維化過程中觀察其表達的變化。

IPF屬中醫學“肺痹”“肺痿”范疇[18-19]，痰飲瘀血為其主要病理產物。肺主通調水道，為水之上源，肺失宣降，津液輸布失調，生成痰飲；肺朝百脈，主治節，血液正常運行依賴于肺主氣的調節和輸布，肺氣失和，氣血運行不暢而出現血瘀。痰瘀深伏凝結，肺絡痹阻為其病機關鍵[20]。張仲景在《金匱要略·肺痿肺癰咳嗽上氣病脈并治》中提到肺痿的定義：“寸口脈數，其人咳，口中反有濁唾涎沫者何？師曰：為肺痿之病。”總結了肺痿的癥狀為咳嗽，咯濁唾涎沫。《雜病源流犀燭·痰飲源流》中指出痰飲的特點：“其為物則流動不測……五臟六腑俱有。”痰飲隨氣機升降無處不到，“肺為貯痰之器”，肺臟中分布無數肺絡，絡體細小且分支眾多，脈絡易出現瘀滯，凝結成形，易入難出。痰飲瘀血為患，侵襲肺臟，肺氣壅實，故出現呼吸困難、咳吐濁唾涎沫等主要癥狀。痰飲瘀血，深伏膠結于肺絡，故出現少痰、痰深難以咯出的癥狀，病情頑固，非一般化痰藥可解。西醫治療IPF的藥物局限于抗纖維化、抗炎、抗氧化等種類，此外還有肺移植手術、氧療等方式，但尚無肯定的顯著療效，僅推薦酌情使用，且不良反應較多[21]。近年來中醫治療IPF的臨床報道頗多，有一定的療效優勢，常見的有益氣活血、補肺養陰等治療方法。我們認為，頑痰深伏于里，膠著難解，故治療時選用十棗湯峻瀉肺中水飲痰邪。十棗湯源于張仲景《傷寒論》，方中甘遂逐經隧水飲，擅除中焦之水；大戟瀉臟腑之水濕，擅除下焦之水；芫花破水飲窠囊，擅除上焦之水，且三藥皆入肺經；大棗緩和峻藥烈性，固護胃氣。四藥合用，峻瀉肺中之頑痰水飲[22]，痰飲去后，肺氣得宣，推動血液的運行輸布，氣血運行通暢，瘀血隨之而去。在臨床中運用十棗湯治療IPF，能明顯改善患者呼吸困難、咳嗽、咯痰癥狀，顯著提高患者的生活質量。

本研究以博來霉素誘導的肺纖維化大鼠為模型進行實驗，光鏡下觀察病理切片可以看出，模型組第14 d可見明顯的肺泡炎癥和滲出，出現成纖維細胞，第28 d肺泡炎癥減輕，肺間質內膠原纖維明顯，與現代研究顯示的肺纖維化病理特點一致，證明本實驗造模成功。給藥治療后，各組肺組織中膠原纖維含量較模型組減少，其中十棗湯高劑量組膠原纖維含量最少，肺泡結構破壞程度最輕。檢測各實驗組肺組織COL3、TIMP-1濃度顯示，模型組COL3、TIMP-1濃度最高，給藥后各實驗組肺組織中COL3、TIMP-1濃度均較模型組降低(P<0.05)，證明各實驗組藥物均能抑制COL3、TIMP-1的表達，其中十棗湯高劑量組濃度最低(P<0.05)，低于吡非尼酮組(P<0.05)。由此表明，十棗湯抗纖維化的作用機制與抑制COL3、TIMP-1的表達，減少ECM的沉積，拮抗肺組織的異常修復有關，從而減輕肺組織的纖維化和結構破壞程度，但其中的具體機制還需進一步研究。

綜上所述，應用十棗湯干預博來霉素誘導大鼠肺纖維化模型后，高劑量的十棗湯能減輕肺組織的結構破壞和纖維化程度，降低肺組織中COL3和TIMP-1的表達。由此可見，十棗湯通過抑制COL3和TIMP-1的表達，從而發揮抗纖維化作用，為臨床應用峻下逐水法治療IPF提供了依據，發揮了中醫藥在治療IPF方面的優勢。