優質囊胚形成時間對妊娠結局的影響

閆雪，徐興華(通信作者)

1 天津和睦家醫院生殖中心 (天津 300221)；2 山東第一醫科大學組胚教研室 (山東泰安 271000)

在一定的胚胎選擇標準下，單胚胎移植也可獲得穩定的臨床妊娠率和累計妊娠率，并且可明顯降低多胎妊娠的風險[1-2]。相較于卵裂期胚胎，囊胚移植具有更好的臨床結局[3]。近年來，越來越多的生殖中心采用單囊胚移植技術。在囊胚培養過程中，相同評分的囊胚可能形成時間不一致。囊胚形成時間的差異是否會影響解凍移植的妊娠結局目前尚存有爭議[4]。本研究旨在分析月經規律女性改良自然周期解凍移植單個優質D5或D6囊胚的妊娠結局，以期為解凍胚胎移植策略的制定提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2017年8月至2019年6月在天津和睦家醫院行凍融單囊胚移植的93名女性的臨床資料。93名女性在體外受精-胚胎移植(invitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)治療開始前均經過醫院倫理委員會批準通過，且簽署囊胚培養及冷凍知情同意書。納入標準：(1)取卵日女性年齡<38歲，基礎卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)值<10 IU/ ml且抗苗勒氏管激素(anti-Müllerian hormone，AMH)>1.1 ng/ml；(2)月經周期規律，排卵正常，月經不規律包括月經稀發、頻發、閉經、異常子宮出血等；(3)取卵周期采用標準長方案或拮抗劑方案超促排卵；(4)子宮內膜準備方案為人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)誘發排卵的自然周期方案，解凍移植周期HCG子宮內膜厚度≥7 mm；(5)解凍復蘇后囊胚擴張，且為單個優質囊胚移植周期。排除標準：(1)既往診斷為子宮畸形、宮頸機能不全、黏膜下子宮肌瘤及宮腔粘連等；(2)既往診斷為子宮腺肌病、子宮內膜異位癥；(3)夫妻任一方存在染色體核型異常，不包括染色體多態性；(4)存在未處理的輸卵管積水；(5)既往診斷為多囊卵巢綜合征；(6)既往有反復妊娠丟失史；(7)患有甲狀腺功能低下、糖尿病等內分泌疾病未糾正；(8)存在輔助生殖技術及妊娠禁忌證。

1.2 方法

1.2.1 分組

根據囊胚的冷凍時間分為2組，將移植胚胎為D5凍存的囊胚定義為D5組(70名)，將移植胚胎為D6凍存的囊胚定義為D6組(23名)。

1.2.2 囊胚培養與評分

在受精后第3天，將胚胎轉至囊胚培養液G2(vitrolife，瑞典)進行囊胚培養。D5和D6分別觀察囊胚形成情況。囊胚評分參考Gardner評分系統。根據囊腔的擴張程度劃分囊胚的分期，共分為1～6期。1期，囊腔體積未超過胚胎總體積50%；2期，囊腔體積大于胚胎總體積50%；3期，囊腔占滿整個胚胎體積；4期，囊胚擴張、透明帶變薄；5期，囊胚開始孵化；6期，囊胚完全孵出。對3～6期的囊胚行進一步的內細胞團(inner cell mass，ICM)評分，A：細胞數目多，排列緊密，碎片少；B：細胞數目較少，結合較松散；C：細胞數目極少，難以辨認。同時，行外滋養層(TE)評分，A：細胞數量>10，大小均勻；B：細胞數量為10，大小不均；C：細胞數量<10，大小不均，存在碎片。本中心冷凍囊胚標準為3期以上且內細胞團及外滋養層評級均在B級以上的囊胚。

1.2.3 囊胚冷凍及復蘇

將所有囊胚采用玻璃化冷凍技術進行冷凍。冷凍及復蘇操作均參考Vitrolife(瑞典)玻璃化冷凍、解凍試劑盒說明書進行。在解凍后，囊胚培養3～24 h進行移植，解凍后2 h依據囊胚腔是否重新擴張來判斷囊胚是否存活。若胚胎未存活，重新解凍1枚囊胚。

1.2.4 子宮內膜準備

采用改良自然周期，于患者月經第9或10天開始行B超監測，若卵泡直徑>14 mm時，隔日行B超監測，之后每日定時監測尿黃體生成素(luteinizing hormone，LH)；若卵泡直徑>16 mm時連續監測LH；當卵泡直徑≥17 mm、子宮內膜厚度≥7 mm時，皮下注射重組人絨毛膜促性腺激素250 μg，排卵后第5天行解凍移植。

1.2.5 囊胚移植及黃體支持

囑患者保持膀胱充盈，在腹部B超引導下移植1枚D5或D6冷凍的優質囊胚，若患者有多個胚胎凍存，優先移植D5胚胎，且優先移植胚胎評分最優的胚胎。

1.2.6 隨訪

新生兒在出生后1～2個月內由專人通過電話對患者進行隨訪。隨訪內容包括出生孕周、生產方式、出生體質量、出生身長、性別、有無畸形、母親是否患妊娠期合并癥等。

1.2.7 結局判斷及觀察指標

臨床妊娠的標準為移植30 d后經B超觀察到孕囊或流產病理證實有絨毛組織；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/移植囊胚周期數×100%。流產的標準為在孕28周之前，胎兒體質量低于1 000 g的妊娠終止；活產的標準為妊娠滿28周及以上的活胎分娩；早產的標準為妊娠滿28周但不足37周的活胎分娩。早期流產率=妊娠12周內流產的周期數/臨床妊娠周期數×100%。活產率=活產周期數/移植周期數×100%。早產率=早產周期數/活產周期數×100%。對于疑似異位妊娠的患者，需密切觀察，一經確診應盡早處理。

1.3 統計學處理

2 結果

D5凍融囊胚移植與D6凍融囊胚的生化妊娠率、臨床妊娠率、流產率、早產率、活產率、男女比例、剖宮產率比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。而D6囊胚移植出生的新生兒體質量及身長明顯高于D5囊胚，差異均有統計學意義(P<0.05)。兩組均無畸形兒出生，D5囊胚移植組有1名孕婦患妊娠期糖尿病，見表1～2。

表1 D5、D6凍融囊胚移植周期患者的基本資料比較

表2 兩組活產新生兒妊娠結局比較

(續表)

3 討論

本研究發現，D5與D6優質囊胚的生化妊娠率、臨床妊娠率、流產率、早產率、活產率、男女比例、剖宮產率比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。有多數研究的結果與上述結果一致。有研究指出，凍融周期單個優質囊胚移植在不同年齡段、不同發育時間(D5、D6)均可獲得較好的臨床妊娠結局[5]。有學者指出，35周歲以下女性在單個優質凍融囊胚移植周期中，D5囊胚的臨床妊娠率、種植率、早期流產率、繼續妊娠率與D6比較，差異無統計學意義；即使在移植2個優質凍融囊胚周期中，D5組的各項指標與D6組比較，差異均無統計學意義[4]。考慮可能的原因為在囊胚形成過程中，無論是D5還是D6囊胚均具有相同的整倍體率[6]；而非整倍體是導致胚胎凋亡、種植失敗或自然流產的主要因素。在凍融單囊胚移植時，若移植胚胎為優質囊胚，則囊胚形成時間對于妊娠結局(生化妊娠率、臨床妊娠率、早期流產率、活產率、早產率)無顯著影響；但當移植囊胚為低質量囊胚時，囊胚形成時間對妊娠結局有顯著影響，D5形成的囊胚移植后妊娠結局明顯優于D6囊胚[7]。

本研究結果發現，來源于D6的囊胚出生嬰兒的體質量及身長均較D5胚胎增加。既往有研究指出，無論是來源于D5還是D6的優質囊胚解凍移植周期中出生的活產兒各項指標如早產率、足月產率及低出生體質量等均無差異。有研究指出，D5與D6單囊胚解凍移植活產的新生兒出生體質量比較，D6的新生兒出生體質量有增加的趨勢，但與D5相比較差異無統計學意義[8]。在調整了孕婦年齡、BMI、產次、不孕年限、胚胎質量等偏倚因素后，仍發現D6囊胚出生的新生兒中巨大兒發生率明顯增高[9]。但最近發表的一篇Meta分析也得出了與本研究相同的結論[10]。考慮可能隨著胚胎培養時間的延長，在表觀遺傳學方面可能對胚胎產生了影響，從而導致出生嬰兒體質量及身長的增加。

綜上所述，在凍融單囊胚移植時，若移植胚胎為優胚，則囊胚形成時間對于臨床結局無顯著影響，但來源于D6囊胚的新生兒與D5相比身長及體質量有明顯增加。考慮到人工周期解凍移植較其他解凍方案會增加女性妊娠期高血壓的發生率[11]，故本研究只納入月經規律婦女，僅采用改良自然周期一種方案解凍移植，以盡可能地減少孕婦因素對妊娠結局的影響，較以往研究分類更加細致。但本研究為回顧性研究，具有一定的局限性，且樣本量較小，今后將進行大樣本的前瞻性研究驗證。