氧化石墨烯納米銀復(fù)合物對(duì)變異鏈球菌抗菌作用的研究

諸曉丹，何劍亮，唐子圣，漆正楠，石雨婷，夏文君，沈妙蓮，鄒 巖，呂 敏

變異鏈球菌(Streptococcusmutans，S.mutans)是口腔內(nèi)主要的致齲菌，其強(qiáng)致齲性與其產(chǎn)酸、耐酸及其對(duì)牙面的選擇性粘附能力有關(guān)。在口腔環(huán)境內(nèi)，菌斑生物膜是細(xì)菌粘附于牙面，并在其上進(jìn)行復(fù)雜代謝從而導(dǎo)致口腔疾病的一個(gè)獨(dú)立的微生態(tài)系統(tǒng)。菌斑生物膜是造成齲病的始動(dòng)因子。因此，探尋一種能有效抗菌并抑制生物膜形成的抗菌劑是目前齲病防治中的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。

銀被用作抗菌劑已有悠久歷史，納米銀(silver nanoparticles，AgNPs)因其特殊的納米材料特性而具有更好的物理抗菌性[1-2]。然而，AgNPs不穩(wěn)定，易發(fā)生氧化和自身團(tuán)聚而影響其抗菌性能[3-4]。氧化石墨烯(graphene oxide，GO)是石墨烯的衍生物之一，其本身具有一定的抗菌性[5-7]并且能夠負(fù)載多種抗菌材料，如納米銀、納米銅和納米氧化鋅等形成各種納米復(fù)合物，這些復(fù)合物具備更強(qiáng)的抗菌性能[8-10]。已有研究發(fā)現(xiàn)，氧化石墨烯納米銀復(fù)合物(graphene oxide-silver nanocomposites，GO-Ag)對(duì)金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)等多種細(xì)菌均有良好的抗菌作用[11-13]，但其作用于口腔致齲菌的研究較少。

因此，本研究主要探討GO-Ag對(duì)變異鏈球菌的抗菌作用及其對(duì)生物膜形成的抑制作用，為其將來(lái)能應(yīng)用于口腔齲病防治提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

GO-Ag由中科院上海應(yīng)用物理研究所制備提供。使用改良Hummers法[14]制備GO。將3.6 mmol/L硝酸銀在不斷攪拌下加入到0.5 g/L的GO中混勻，將混合物與1 mL 1%的檸檬酸鈉在超聲下混勻，緩慢加入硼氫化鈉溶液(0.2 mol/L，60 mL)，用0.5 mol/L氫氧化鈉調(diào)整pH值為11后進(jìn)行離心，將沉淀物置于無(wú)菌去離子水中進(jìn)行超聲分散后得到所需的GO-Ag懸濁液。原液濃度為0.45 g/L。將GO-Ag原液置于紫外光中消毒，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 菌液配制

國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)菌株S.mutans(UA159)由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔微生物實(shí)驗(yàn)室提供。將凍存的菌株接種于胰蛋白大豆瓊脂(tryptic soy agar，TSA)培養(yǎng)基上，37 ℃厭氧(N280%，H210%，CO210%)培養(yǎng)24 h。取單菌落置于5 mL胰蛋白大豆肉湯(tryptic soy broth, TSB)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，繪制細(xì)菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液，配制初始濃度為1×107CFU/mL的菌液備用。

1.3 GO-Ag對(duì)浮游狀態(tài)變異鏈球菌的抗菌作用

1.3.1 菌落形成單位(colony forming unit，CFU)計(jì)數(shù)法 取制備的菌液250 μL，加入無(wú)菌生理鹽水及GO-Ag原液，配制形成500 μL含有GO-Ag終濃度分別5、10和20 mg/L的菌液，同時(shí)以無(wú)菌生理鹽水作為陰性對(duì)照組，每個(gè)濃度組重復(fù)3次，37 ℃厭氧培養(yǎng)2 h。取適量菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋后涂布于TSA培養(yǎng)基表面，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算抗菌率。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)活菌濃度 取制備的菌液250 μL，加入無(wú)菌生理鹽水及GO-Ag原液，配制形成500 μL含有GO-Ag終濃度分別5、10和20 mg/L的菌液，并以無(wú)菌生理鹽水作為陰性對(duì)照組，每個(gè)濃度組重復(fù)3次，37 ℃厭氧培養(yǎng)2 h。使用活菌/死菌熒光染色試劑盒(LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits)中的SYTO9和PI染色劑進(jìn)行熒光染色后，置于流式細(xì)胞儀中檢測(cè)。

1.3.3 活死菌熒光染色法 取制備的菌液250 μL，加入無(wú)菌生理鹽水及GO-Ag原液，形成500 μL含有GO-Ag終濃度為20 mg/L的菌液，同時(shí)以無(wú)菌生理鹽水作為陰性對(duì)照組，每組重復(fù)3次，37 ℃厭氧培養(yǎng)2 h。按照活菌/死菌熒光染色試劑盒說(shuō)明進(jìn)行染色后，置于激光共聚焦掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscope，CLSM)下觀(guān)察。

1.4 GO-Ag抗變異鏈球菌生物膜作用

1.4.1 體外變異鏈球菌生物膜的培養(yǎng) 將制備的含有1%蔗糖的菌液與GO-Ag混勻，形成含有GO-Ag終濃度分別5、10、20 mg/L的菌液，并以無(wú)菌生理鹽水作為陰性對(duì)照組，吸取100 μL加入96孔板中，每個(gè)濃度組重復(fù)3次，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h。

1.4.2 變異鏈球菌生物膜形成量的測(cè)定 將上述培養(yǎng)了24 h的變異鏈球菌生物膜棄去上清，使用無(wú)菌去離子水洗滌3次，每孔加入150 μL 0.1%的結(jié)晶紫溶液，室溫下染色15 min，吸去染液，加入無(wú)菌去離子水洗滌3次，自然干燥后每孔加入200 μL 95%的乙醇，振蕩溶解15 min，使用酶標(biāo)儀測(cè)定590 nm處的吸光度，計(jì)算生物膜形成量減少率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SAS 8.2統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)及Dunnett’st檢驗(yàn)比較各實(shí)驗(yàn)組分別與對(duì)照組間的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 GO-Ag對(duì)浮游狀態(tài)變異鏈球菌的抗菌作用

采用CFU計(jì)數(shù)法檢測(cè)GO-Ag對(duì)變異鏈球菌的抗菌作用，結(jié)果見(jiàn)圖1。當(dāng)GO-Ag濃度為5、10、20 mg/L時(shí)，其對(duì)變異鏈球菌的抗菌率分別為(51.82±6.21)%、(84.94±4.67)%、100%，與對(duì)照組間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并且抗菌作用隨著GO-Ag的濃度增大而增強(qiáng)。

*：P<0.05

采用FCM檢測(cè)經(jīng)過(guò)GO-Ag作用后變異鏈球菌的活菌濃度結(jié)果，見(jiàn)圖2。當(dāng)GO-Ag濃度為5、10、20 mg/L時(shí)，其活菌密度分別為(98.66±15.21)/mL、(61.35±4.83)/mL、(26.93±1.09)/mL，而對(duì)照組的活菌密度為(215.40±33.09)/mL,各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

*：P<0.05

采用活死菌熒光染色在CLSM下觀(guān)察GO-Ag作用下變異鏈球菌的生存狀態(tài)，見(jiàn)圖3，其中綠色熒光代表活菌，紅色熒光代表死菌。圖中可見(jiàn)經(jīng)過(guò)20 mg/L的GO-Ag處理2 h后的變異鏈球菌，紅色熒光比例與對(duì)照組相比明顯增加。

A：對(duì)照組；B：20 μg/mL GO-Ag處理組

2.2 GO-Ag對(duì)變異鏈球菌生物膜形成的抑制作用

采用結(jié)晶紫染色法測(cè)定變異鏈球菌24 h生物膜的形成量，結(jié)果見(jiàn)圖4。與對(duì)照組比較，經(jīng)過(guò)5、10、20 μg/L的GO-Ag處理后，變異鏈球菌生物膜形成量分別減少了(30.92±13.94)%、(58.39±6.73)%、(73.82±1.32)%，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

*：P<0.05

3 討 論

齲病是一種慢性細(xì)菌感染性疾病，是人類(lèi)兩大口腔疾病之一。變異鏈球菌與齲病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因此探尋有效抑制或殺滅變異鏈球菌的抗菌劑一直以來(lái)都是齲病防治領(lǐng)域的重要研究方向。近年來(lái)，面對(duì)傳統(tǒng)抗菌劑帶來(lái)的不良反應(yīng)和耐藥問(wèn)題，新型無(wú)機(jī)納米抗菌劑受到廣泛關(guān)注和研究。

過(guò)去已有許多研究都報(bào)道了GO-Ag具有顯著的抗菌性，如De Moraes等[15]研究發(fā)現(xiàn)15 μg/mL的GO-Ag分別作用于大腸桿菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)2 h和4 h就能完全殺死細(xì)菌；Jaworski等[16]同樣報(bào)道了GO-Ag作用于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌(Staphylococcusepdermidis,S.epdermidis)24 h后，其活性分別降低了88.6%，79.5%和76.5%。

此外，有研究報(bào)道了使用GO-Ag作為鈦表面涂層，對(duì)變異鏈球菌和牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis，P.gingivalis)具有有效的抗菌作用，為將來(lái)預(yù)防種植體周?chē)滋峁┝艘粋€(gè)新的方向[17]。另一方面，GO-Ag還可作為載藥系統(tǒng)，將其他抗菌藥物，如抗生素等負(fù)載于其上，發(fā)揮協(xié)同抗菌作用，進(jìn)一步提高抗菌效率[18]。

本研究結(jié)果顯示，當(dāng)GO-Ag濃度為5 mg/L時(shí)，其對(duì)變異鏈球菌即有明顯的抗菌作用，抗菌率為(51.82±6.21)%；而當(dāng)其濃度達(dá)到20 mg/L時(shí)，TSA培養(yǎng)基上未見(jiàn)菌落生長(zhǎng)，抗菌率達(dá)到100%。此外，F(xiàn)CM的結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)20 mg/L的GO-Ag作用2 h后，變異鏈球菌活菌密度為(26.93±1.09)/mL，相比于對(duì)照組的(215.40±33.09)/mL下降了(87.35±1.48)%。活死菌染色法的檢測(cè)結(jié)果則直觀(guān)地表明了經(jīng)過(guò)GO-Ag作用后，變異鏈球菌中的死菌比例明顯增多。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明GO-Ag對(duì)浮游狀態(tài)的變異鏈球菌具備良好的抗菌性。

以往研究報(bào)道GO-Ag的抗菌性強(qiáng)于GO與AgNPs[19-20]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)20 mg/L的GO對(duì)變異鏈球菌的抗菌率為(55.9±10.7)%，明顯小于GO-Ag[21]。Song等[22]研究認(rèn)為GO-Ag的抗菌性并不是GO與AgNPs抗菌作用的簡(jiǎn)單相加，而是二者發(fā)揮協(xié)同抗菌作用，主要是通過(guò)破壞細(xì)菌細(xì)胞膜和介導(dǎo)氧化應(yīng)激進(jìn)行抗菌。GO具有較大的比表面積和大量含氧官能團(tuán)，使AgNPs穩(wěn)定分散在其表面，大大增加了與細(xì)菌的接觸，進(jìn)一步增強(qiáng)了抗菌性。

細(xì)菌生物膜由細(xì)菌群體和胞外物質(zhì)組成，具有特殊三維立體結(jié)構(gòu)，其比浮游狀態(tài)的細(xì)菌抗藥性更強(qiáng)、危害更大。本研究采用結(jié)晶紫染色法測(cè)定GO-Ag對(duì)變異鏈球菌24 h生物膜形成量的影響。結(jié)果表明經(jīng)過(guò)5、10、20 mg/L的GO-Ag處理后，變異鏈球菌生物膜形成量分別比對(duì)照組減少(30.92±13.94)%、(58.39±6.73)%、(73.82±1.32)%，說(shuō)明GO-Ag能有效地抑制變異鏈球菌生物膜的形成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以往相關(guān)研究一致[23]。然而，目前對(duì)于GO-Ag對(duì)細(xì)菌生物膜的作用機(jī)制尚無(wú)定論。Liu等[24]認(rèn)為GO-Ag能夠通過(guò)調(diào)節(jié)銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，P.aeruginosa)生物膜的胞外基質(zhì)而有效抑制其生物膜形成。Kulshrestha等[23]則認(rèn)為GO-Ag是通過(guò)殺滅浮游的陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae，E.cloacae)而抑制其形成生物膜的；GO-Ag抑制變異鏈球菌形成生物膜則是通過(guò)調(diào)節(jié)與變異鏈球菌形成生物膜相關(guān)基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

綜上，本研究結(jié)果顯示GO-Ag對(duì)變異鏈球菌有明顯的抗菌作用，并能有效地抑制其形成生物膜。然而，GO-Ag的抗菌機(jī)制及其對(duì)細(xì)菌生物膜的作用還需更進(jìn)一步研究，為其將來(lái)能夠應(yīng)用于臨床提供更多依據(jù)。