真菌致齲機制的研究進展

張璐瑾，商慶龍

在人類口腔中存在著由700多種微生物構成的復雜生態系統，這個生態系統包括大量細菌和少量真菌[1]，兒童和健康成年人口腔真菌分別有46種和101種[2-3]。目前認為齲齒發生與口腔微生物群落組成和相對豐度的變化有關[4]。細菌致齲的研究較多，包括生物膜、細菌間協同致齲等，而口腔真菌致齲的研究較少，真菌在齲病發生過程中的作用尚不清楚，本文就真菌致齲的相關研究進展作一綜述。

1 核心口腔真菌

由于部分真菌無法培養，不同真菌個體間存在巨大的差異，真菌數據庫不完善，近年來在真菌致齲研究中引入了“核心口腔真菌”的概念[5]。“核心口腔真菌”是指在超過20%的抽樣樣本中普遍存在的口腔真菌群的核心成分，目前包括了假絲酵母菌屬、枝孢屬、曲霉菌屬、鐮胞菌屬、鏈格孢菌屬、隱球菌屬和短梗霉菌屬等被公認的7種真菌[3,6-7]。其中，假絲酵母菌屬是目前主要的研究對象，但是假絲酵母菌屬與齲病的關系尚不清楚。核心真菌群在齲病中所發揮的作用也有待闡明。

2 經典的致齲機制研究

2.1 齲病

齲病是細菌等因素引起的慢性、進行性牙齒硬組織破壞的疾病[8]。在齲病發生過程中，糖類助長了相關病原體增殖，致使生物膜微環境酸化，使牙齒硬組織脫礦，并破壞有機質，導致齲齒[9]。在臨床上，齲病可進展至牙髓炎、牙周感染等。齲病的影響因素還包括宿主易感性、環境因素、教育和社會經濟狀況等[10-11]。齲病治療包括了致齲菌抑制、脫礦抑制與再礦化[12]。

2.2 細菌致齲的支持證據

在齲齒中分離到的多種口腔細菌被作為齲病潛在的病原體，其中，變異鏈球菌、糞腸球菌、遠緣鏈球菌和唾液鏈球菌等參與了生物膜形成[13]，粘附在牙體硬組織表面并使局部酸化[14]。齲病沒有特定的病原體，如變異鏈球菌是齲齒發生與發展的潛在參與者[15]，但變異鏈球菌不存在時，韋格斯卡多維亞菌也與幼兒齲病的發生發展有關[16]。

2.3 致齲研究中遇到的問題

首先，單獨抗細菌治療無法治愈齲病[17]。常規齲病的抗細菌治療使口腔齲病相關細菌數量減少，但病灶中卻殘留大量真菌如假絲酵母菌，輔以抗真菌藥物有助于齲病治療[18]。其次，部分乳桿菌有抑制齲齒作用。格氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和副干酪乳桿菌等乳桿菌屬細菌能夠抑制致齲病原體生存、生長和增殖[19]，通過聚集形成屏障，抑制病原菌的粘附作用[20]。乳酸菌屬產生的細菌素及生物表面活性劑和丁酸鈉等代謝物能抑制假絲酵母菌菌群，副干酪乳桿菌能通過調控關鍵基因TEC1和UME6顯著下調白假絲酵母菌菌絲形成[19-21]。隨著研究的深入，細菌之外的病原體作用也受到了關注。

3 真菌致齲的研究

3.1 真菌通過產酸致齲

3.1.1 部分真菌具有較高產酸性及耐酸性 白假絲酵母菌合并高糖飲食可引起齲病[2]。白假絲酵母菌能產生乳酸和其他有機酸[22]。假絲酵母菌通過溶解羥基磷灰石引起牙釉質脫礦[23]，這種溶解能力高于變異鏈球菌[2]。另一方面，細胞膜H+-ATPase使白假絲酵母菌具有極高抗酸性[24]，與對照組相比，患齲病例中分離的白假絲酵母菌菌株的基因型不同，抗酸性更強[25]。

3.1.2 真菌增加多物種混合生物膜酸性 高水平蔗糖增強了假絲酵母菌與齲病相關細菌之間的相互作用以及與牙體的物理粘附性，細胞外間質產量和微生物生物量，促進了生物膜形成。白假絲酵母菌的存在增加了白假絲酵母菌-變異鏈球菌混合生物膜的酸性[22,26]，也使白假絲酵母菌-粘性放線菌混合生物膜pH值明顯下降[22]。

3.2 真菌通過參與生物膜形成致齲

3.2.1 真菌參與生物膜結構 真菌在齲壞部位可以單獨存在，還可以與細菌形成混合小菌落，以生物膜形式參與致齲過程，生物膜內的假絲酵母屬對多種抗真菌藥物的敏感性比游離真菌低1 000倍[19]。白假絲酵母菌和都柏林假絲酵母菌是咬合面和牙根表面齲病病變部分生物膜的重要組分。結構分為兩種形式：一種是由假絲酵母菌菌絲網絡混合大量絲狀細菌、球菌和棒狀細菌組成了貫穿整個生物膜的區域，另一種是假絲酵母菌與鏈球菌在生物膜表層形成了玉米棒樣的構型，這些鏈球菌包括了格氏鏈球菌和口腔鏈球菌等小群體鏈球菌種(mitis group streptococci，MGS)[27]。

3.2.2 真菌增促進生物膜增長 ①粘附性增加，口腔真菌與細菌的混合感染主要通過增加細菌胞外多糖(extracellular polysaccharide，EPS)產量，以增強微生物之間、微生物與牙面之間的粘附性，促進體外生物膜形成。真菌產生EPS，受鏈球菌屬胞外酶—葡糖基轉移酶(glucosyltransferase，GTF)誘導分泌，受體為白假絲酵母菌表面甘露聚糖分子。白假絲酵母菌-變異鏈球菌混合生物膜中，EPS總量高于單物種生物膜，白假絲酵母菌細胞被EPS包被，粘附性增加[28]。白假絲酵母菌在人類唾液中粘附性大幅增加。其分子機制是口腔唾液中富含脯氨酸的蛋白質附著于細菌，為真菌粘附提供額外受體[28]。② 生物量增加，白假絲酵母菌與變異鏈球菌等齲病相關細菌的混合生物膜生物量高于任何單菌種生物膜[26]。分子水平上，白假絲酵母菌與變異鏈球菌共同感染時，變異鏈球菌抗原Ⅰ/Ⅱ與其對應的受體為凝集素樣序列基因(agglutinin-like sequence，ALS)編碼的粘附蛋白是細菌定植需要的。在蔗糖存在環境中，抗原Ⅰ/Ⅱ也促進白假絲酵母菌定植，并提高了其致病性[29]。格氏鏈球菌細胞壁蛋白SspB與白假絲酵母菌表面凝集素樣序列基因3(agglutinin-like sequence 3，ALS3)的N端結合能促進共感染，提高了混合生物膜的生物量[30]。③假絲酵母菌菌絲形成，白假絲酵母菌-口腔鏈球菌生物膜通過增強菌絲生長基因(enhanced filamentous growth 1，Efg1)成絲途徑促進白假絲酵母菌菌絲形成，Efg1調節的粘附素ALS1是這種混合生物膜的關鍵介質。Efg1的缺失不影響白假絲酵母菌-變異鏈球菌混合生物膜中真菌細胞的數量，可能因為葡糖基轉移酶B(glucosyltransferase B，GtfB)通過Bcr1獨立機制促進白假絲酵母菌-變異鏈球菌生物膜形成[26]。

3.3 真菌通過與細菌協同致齲

3.3.1 真菌-細菌協同作用間接影響齲病發生發展 在口腔，真菌與細菌以及宿主之間在物理、化學和代謝方面建立了緊密的生態關系[31]。口腔真菌促進了細菌粘附、增殖和侵襲，而細菌也影響了真菌的增殖、發展和侵襲[32]，兩者的協同作用間接地影響了齲病的發生發展。一方面，真菌和細菌的協同促進了對糖類的分解，代謝產物為真菌和細菌的生存與增殖提供能量，雙物種生物膜的密度增大，比單物種生物膜形成了更多的微生物菌落，EPS的產量和附著力也明顯提高[22]。細菌胞外多糖結合在真菌細胞表面，發揮了合成葡聚糖的功能[21]，使白假絲酵母菌成為物理支架拓展胞外多糖的粘附作用。另一方面，某些真菌與細菌互相提供新的粘附位點。假絲酵母菌通過與早期定植菌(如鏈球菌屬和放線菌屬)結合在牙齒定植[33]。

3.3.2 真菌-細菌協同致齲的分子機制 ①真菌-細菌的細胞壁表面蛋白質/受體相互作用：白假絲酵母菌與MGS有特定的細胞壁表面蛋白質/受體，其相互作用受白假絲酵母菌細胞壁ALS和HWP1粘附素介導，這些結合也可能涉及到SspA、SspB、ALS1、ALS3、ALS5、O-甘露糖基殘基、天冬氨酸蛋白酶Sap9等[26,28]。②真菌-細菌的QS系統相互作用：鏈球菌屬與白假絲酵母菌具有一種依賴于自動誘導、細胞密度分子依賴性的毒力特異性，稱為群體感應(quorum sensing，QS)[34]。鏈球菌屬的QS分子影響白假絲酵母菌的毒力：鏈球菌屬QS分子包括自體誘導信號分子-2(autoinducer-2，AI-2)、肽聚糖片段、外源酶和過氧化氫(H2O2)和法尼醇等[26]。與對照組相比，AI-2缺失的鏈球菌屬與白假絲酵母菌的混合生物膜中，白假絲酵母菌菌絲減少30%，AI-2以及其他信號分子能加強菌絲形成[28]。格氏鏈球菌的營養副產物以及H2O2刺激生物膜內白假絲酵母菌菌絲的發育，口腔鏈球菌激活真菌天冬蛋白酶的表達[26]。白假絲酵母菌激活變異鏈球菌QS系統：白假絲酵母菌通過法尼醇等QS分子，激活變異鏈球菌的毒力基因和GtfB的生產，并通過提供生長刺激因子和降低氧緊張促進鏈球菌增殖[28]。

4 真菌致齲研究中需要解決的問題

4.1 關注部分真菌具有抑齲作用

真菌產生的抑制因子能抑制細菌生物膜形成，為真菌提供了競爭優勢。出芽短梗霉菌產生的多元醇酯(liamocins)能殺滅或抑制變異鏈球菌和遠緣鏈球菌，抑制細菌粘附、生物膜形成及牙菌斑的發展，并隨著時間推移去除生物膜，從而抑制齲病，在這個過程中，不會破壞口腔正常的微生物[35]。這一類真菌的作用機制仍需深入研究，以用于預防和治療齲病。

4.2 推進真菌-細菌相互作用的研究

真菌-細菌之間的協同或抑制作用的機制仍需要深入研究，尤其在產酸、生物膜、生物學特性和致病機制等方面的研究。采用多學科合作研究的模式，推進真菌-細菌相關研究。采取活細胞成像技術，動態反映牙菌斑群落致齲過程；使用基于代謝組學的功能分析、群體感應分析和轉錄譜上調或下調基因的鑒定以進一步研究真菌-細菌相互作用。

4.3 需要加強口腔真菌菌群的研究

一方面，需要增加對致齲真菌群體的細分研究，區分致齲和抑齲類真菌。在齲病病程中，口腔微生物組成與結構發生了改變[36]，需要對患齲時口腔真菌菌群的作用進行深入研究。選取口腔真菌進行全基因組測序，建立齲齒相關的口腔真菌數據庫。另一方面，加強口腔核心真菌菌群的研究，按照菌群類型細分的原則，深入研究致病性真菌的生物學和致齲機制，并對細菌與真菌在致齲與抑齲中的協同與抑制機制深入研究，揭示真菌致齲的機制。

5 總 結

口腔真菌致齲作用有研究數據支持，但部分真菌和細菌具有抑制齲病的作用，且機制尚不清楚。因此，未來的研究需要區分出致齲真菌和抑齲真菌。口腔真菌與口腔細菌之間的協同或拮抗需要進一步研究。未來仍需要針對口腔真菌群進行深入研究，以探索真菌致齲機制，為齲病的防控尋找新線索。