磷酸酸蝕和不同磷酸酯單體預處理牙釉質表面的微觀形態學觀察和粗糙度評價

韓 菲，陳 晨，楊家雪，石 煒，景雙林，謝海峰

磷酸酸蝕是牙釉質粘接前的表面處理經典程序[1-3]。然而酸蝕-沖洗技術存在操作費時，處理后易重新污染等缺點[4]。在此背景下，自酸蝕粘接劑被開始應用于牙釉質的粘接，其中包含了酸性單體實現牙釉質的脫礦和調節，而無需進行磷酸酸蝕預處理，因此能縮短工作時間和降低技術敏感性[5-6]。由于自酸蝕粘結劑的酸性比磷酸低，被質疑是否能提供足夠的牙釉質脫礦能力[7]。目前關于酸蝕-沖洗和自酸蝕粘結系統對牙釉質與樹脂間粘接強度的影響已有研究，但關于不同酸蝕時間和不同表面處理的牙釉質表面粗糙度和表面形貌的研究較少。本實驗的目的即探討磷酸酸蝕不同時間以及不同磷酸酯單體預處理牙釉質表面粗糙度和微觀形態的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

經南京醫科大學倫理委員會批準，征得個人知情同意后從南京醫科大學附屬口腔醫院收集7顆新鮮拔除的無齲人類第三磨牙，保存在4 ℃ Hanks平衡鹽溶液中，并在1個月內使用。使用低速切割機(Buehler公司，美國)在流水狀態下將牙齒沿釉牙骨質界分開，去除所有牙根。將牙冠在牙體長軸方向沿近遠中向切開，制備成19個相同規格(3 mm×3 mm×2 mm)的牙釉質樣本，使用鎢鋼車針(FG7664，美國)進行表面高度拋光。選取7個牙釉質樣本分別接受以下表面處理：對照組：不進行進一步處理(Ctr)；酸蝕組：分別使用35%磷酸(格魯瑪，德國)酸蝕3 s(Etch3組)、15 s(Etch15組)、30 s(Etch30組)、60 s(Etch60組)；磷酸酯單體調節組：按照廠家推薦，分別涂抹含甘油磷酸二甲基丙烯酸酯(glycerol phosphate dimethacrylate，GPDM)的Optibond Versa (OV， Kerr，美國)的預處理劑(OV組)和含10- 甲基丙烯酰氧癸二氫磷酸酯(10-Methacryloyloxydecyl dihydrogen phosphate，10-MDP)的Tetric N Bond Universal (TNBU，義獲嘉，列支敦士登)(TNBU組)各20 s，吹勻，自然揮發20 s。

在沒有光固化的情況下，OV和TNBU組用丙酮和去離子水交替清洗，去除殘留單體。所有樣本在乙醇水溶液中逐級脫水。干燥后備用。

1.2 掃描電鏡表面形貌觀察

將各組經過表面處理的牙釉質樣本進行濺射鍍金，使用掃描電子顯微鏡(TESCAN， MAIA3，捷克)在真空狀態下，工作電壓為5 kV，工作距離為8 mm下進行微觀形態學觀察，放大倍數分別在2 000和 10 000倍。

1.3 表面粗糙度測定

剩余12個牙釉質樣本，分為4組(n=3)，分別進行鎢鋼車針拋光、35%磷酸酸蝕15 s、OV預處理劑和TNBU表面處理，使用表面輪廓儀(Contour GT-X 3D optical microscope，Bruker公司，美國)進行表面粗糙度(Ra)的測定。

1.4 統計學方法

記錄各組的粗糙度值，通過正態分布和方差齊性檢驗后，采用單因素方差分析比較不同表面處理因素對牙釉質表面粗糙度的影響。LSD檢驗進行組間比較。統計軟件為SPSS 22.0(IBM SPSS Inc，美國)，顯著性為0.05。

2 結 果

2.1 表面形貌

根據掃描電鏡觀察(圖1～3)，經過鎢鋼車針拋光的牙釉質表面可見車針打磨的清晰劃痕。低倍視野下，用磷酸酸蝕3 s的牙釉質表面可見較明顯的魚鱗狀排列的釉柱，高倍視野下可以觀察到釉柱結構輕度溶解，釉柱間質輕微暴露。磷酸酸蝕15 s的牙釉質表面在低倍視野下觀察到由于釉柱溶解而顯示出明顯的蜂窩狀圖案，高倍視野下表現出類似于觸須樣的結構。磷酸酸蝕30 s的釉柱結構在低倍視野下表現出比酸蝕15 s相對平坦、聚合的圖案，高倍視野下可觀察到釉柱結構輕微塌陷，釉柱間隙較酸蝕15 s增大。磷酸酸蝕60 s的牙釉質表面在低倍視野下觀察到的釉柱排列方式發生了變化，部分釉柱結構不再立體，高倍視野下可觀察到釉柱結構明顯塌陷,釉柱間隙較酸蝕30 s明顯增大且大小不一。OV預處理劑處理過的牙釉質表面在低倍視野下劃痕明顯消失，高倍視野下可以觀察到明顯的釉柱邊界。TNBU未見明顯的釉柱蝕刻表現，劃痕明顯。

A： ×2 000；B: ×10 000

2.2 表面粗糙度

不同處理方式后牙釉質平均表面粗糙度(Ra)及標準差如表1所示。統計分析顯示：Etch15組的Ra值最高，TNBU組的Ra值最低，用磷酸處理牙釉質產生的表面粗糙度顯著大于Ctr組、OV組和TNBU組(P<0.001)，OV組明顯高于TNBU組(P=0.032)，OV組和TNBU組都顯著高于對照組(P<0.001)。圖4～7為經過鎢鋼車針拋光(Ctr)、35%磷酸酸蝕15 s(Etch15)、OV預處理劑、TNBU處理過的牙釉質表面的典型三維圖像。

A、a: 酸蝕3 s；B、b：酸蝕15 s；C、c: 酸蝕30 s;D、d: 酸蝕60 s。A、B、C、D： ×2000； a、b、c、d: ×10 000

A、a: Optibond Versa預處理劑；B、b: Tetric N Bond Universal, A、B: ×2 000； a、b: ×10 000

表1 牙釉質表面粗糙度

圖4 鎢鋼拋光處理后牙釉質表面三維形貌圖

圖5 35%磷酸酸蝕15 s后牙釉質表面三維形貌圖

3 討 論

牙釉質是人體內最堅硬的組織，由92%～96%的無機物以及4%的有機物組成。無機物質的主要成分是羥基磷灰石晶體[8-9]。牙釉質微觀結構由排列成棱柱或棒狀，大致垂直于釉牙本質界的釉柱組成[10]。1955年，Buonocore引入了對牙釉質進行磷酸蝕刻以將丙烯酸類樹脂粘接到酸蝕表面的概念，認為適當的牙釉質表面粗糙結構對于在粘接劑和牙釉質之間建立持久的粘結非常重要[11-12]。

圖6 Optibond Versa預處理劑處理后牙釉質表面三維形貌圖

圖7 Tetric N Bond Universal處理后牙釉質表面三維形貌圖

酸蝕-沖洗模式是牙釉質-樹脂粘結的傳統方式，也是當前應用最廣泛的方式。磷酸蝕刻會溶解牙釉質羥基磷灰石晶體，并在表面形成多孔的固位結構，從而增加表面粗糙度和表面自由能。酸蝕-沖洗模式獲得粘接力的來源即依賴于酸蝕的釉柱和羥基磷灰石晶體結構與滲入、包裹的粘接樹脂聚合后形成的微樹脂突[2]。酸蝕技術最初應用于牙釉質時，標準的酸蝕時間為60 s，但后來的研究發現，15 s的磷酸酸蝕已能為牙釉質表面提供足夠的微機械固位力，進一步酸蝕或許可使牙釉質表面粗糙度(Ra)有統計學意義的增加，但形態特征和表面積并沒有明顯變化[11，13]。牙釉質-樹脂的粘結耐久性并不與磷酸酸蝕時間存在相關性[14]，過度延長的磷酸酸蝕時間并不能提高牙釉質-樹脂的剪切粘結強度[3]。因此，本研究中只測量了酸蝕15 s這一推薦的磷酸酸蝕時間，因其已能夠代表磷酸酸蝕實現牙釉質表面粗糙度的較好狀態，并將此作為對照，評價磷酸酯單體包含的粘接產品調節牙釉質時獲得表面粗糙度的優劣。

本研究中的不同磷酸酸蝕時間的牙釉質表面形貌觀察結果顯示，酸蝕牙釉質3 s即可見釉柱結構輕度溶解，釉柱間質輕微暴露，酸蝕15 s的牙釉質表面則表現出由于釉柱溶解而明顯的蜂窩狀圖案。這些現象與以往的研究[15]是一致的。酸蝕30 s的釉柱結構則出現輕微塌陷，釉柱間隙較酸蝕15 s者增大。酸蝕60 s的釉柱結構表現出明顯的塌陷,釉柱間隙也較酸蝕30 s時明顯增大。這可能是因為酸蝕時間過長而破壞了蜂窩狀的有利于微機械嵌合的釉柱結構，這種結構顯然不利于牙釉質-樹脂的粘結強度和耐久性。

由于自酸蝕粘接系統產生的牙釉質表面與用磷酸處理的牙釉質表面明顯不同[16-17]，磷酸酸蝕被認為使粘結樹脂能夠比未酸蝕和自酸蝕粘結劑處理的牙釉質表面滲透得更深入[18]，所以自酸蝕粘結劑與牙釉質產生的粘結力被質疑可能不如酸蝕-沖洗系統持久[19]。使用磷酸酸蝕可以明顯改變牙釉質表面特性，與磷酸酸蝕相比，自酸蝕粘結劑對牙釉質的蝕刻能力則主要取決于所含的酸性功能單體的性質。有研究證實，10-MDP對牙釉質的脫礦能力相對于磷酸酸蝕較差，導致晶體間粘結樹脂浸潤較淺，微樹脂突形成較少[20]。本研究中使用兩種粘結劑Optibond Versa 和Tetric N Bond Universal分別代表兩種功能單體GPDM和10-MDP對牙釉質的蝕刻能力，兩者成分的主要差別是TNBU含有D3MA(decandiol dimethacrylate)和MCAP(methacrylated carboxylic acid polymer)。到目前為止，沒有證據顯示10-MDP與羥基磷灰石的脫礦及結合能力會受TNBU中D3MA和MCAP成分的影響。本研究中，高倍視野下的掃描電鏡觀察顯示，與經典的磷酸酸蝕15 s在牙釉質表面暴露出的典型蝕刻圖案相比，OV預處理劑處理20 s的牙釉質表面雖然沒有顯示出跟前者一樣典型的蜂窩狀結構，但是仍然暴露出一些釉柱結構，證實了鎢鋼車針制備的牙釉質表面劃痕大部分被溶解，釉柱輪廓輕微暴露，部分被單體鈣鹽沉積所遮擋，最接近于磷酸酸蝕3 s時的效果。而TNBU與牙釉質相互作用時，在高倍鏡下仍可觀察到明顯劃痕，說明其蝕刻效果低于OV。這一現象主要是歸因于OV預處理劑中的酸性單體GPDM(pH=1.6)對釉柱的蝕刻能力雖然低于酸蝕組(pH<0.5)，但是仍然產生了實現微機械嵌合力所需要的表面微觀形態。TNBU所含的10-MDP(pH介于2.5～3.0)對牙釉質的蝕刻能力低于OV，所以推測提供的微機械固位力也低于OV。以往研究認為，含GPDM的自酸蝕粘結劑比含10-MDP的呈現出更多更深的蝕刻凹坑狀結構，這些結構都被粘結樹脂滲透，緊密包圍著暴露的羥基磷灰石晶體，在牙釉質釉柱之間形成了豐富的微觀和宏觀樹脂突[20]。這與本研究的結果是一致的。在本研究中，表面粗糙度分析結果也支持掃描電鏡的觀察結果。酸蝕15 s獲得了最高的牙釉質表面粗糙度，其次是OV和TNBU，均高于對照組，因此，磷酸酸蝕在獲得足夠的牙釉質脫礦深度上仍是具有更大優勢的。同時，OV預處理所表現出的脫礦深度明顯大于TNBU，說明了磷酸酯單體的pH值對牙釉質表面的脫礦能力有關鍵作用。

通過當前的研究結果可以推論：牙釉質粘結推薦酸蝕-沖洗模式，磷酸酸蝕牙釉質時間以15 s為宜。經過磷酸酸蝕和應用磷酸酯單體包含的預處理劑調節均可以改變牙釉質表面特性，增加表面粗糙度，但磷酸酯單體GPDM對牙釉質的蝕刻能力和脫礦深度均高于10-MDP，提示相應的自酸蝕粘結劑可能更利于牙釉質-樹脂的粘結效果。