肉桂醛對口腔鱗狀細胞癌細胞CAL27增殖和遷移的影響

許嘉琪，單秋生，王曉峰

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)(簡稱鱗癌)是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤[1]，其復發(fā)和轉(zhuǎn)移對患者構(gòu)成很大的威脅。OSCC盡管在系統(tǒng)化和個性化的治療方面已經(jīng)取得非常大的進展，但腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移及放化療的痛苦仍然給其治療帶來很大挑戰(zhàn)[2]。因此，尋找高效低毒副作用的藥物來提高OSCC患者的生存質(zhì)量，研究OSCC的增殖、遷移和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，成為目前臨床基礎(chǔ)研究的重要課題。

肉桂醛(cinnamaldehyde, CA)是一種醛類有機化合物，淡黃色液體，可從桂皮油中分離而得。研究發(fā)現(xiàn)，肉桂醛具有防腐保鮮、抗?jié)儭⒓訌娢改c道運動、抗病毒、擴張血管及降壓、分解脂肪等多種作用[3-5]。國內(nèi)外大量研究現(xiàn)狀表明，肉桂醛可通過不同途徑對黑素瘤、肺癌、宮頸癌等產(chǎn)生抑制作用[6-8]。肉桂醛在臨床抗腫瘤方面具有較大研究潛力[9]，而肉桂醛對口腔癌的抑制作用鮮有報道。本文旨在探討不同濃度肉桂醛在體外二維條件下對口腔鱗癌細胞CAL27的增殖、遷移、侵襲、凋亡和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，為肉桂醛在抗口腔鱗狀細胞癌方面提供相關(guān)的研究和進展。

1 材料與方法

1.1 材料

人舌鱗癌細胞CAL27細胞系(BNCC細胞菌種庫)；肉桂醛(生工生物工程上海股份有限公司，純度為1.05 g/mL)；CCK8試劑盒(Cell Counting Kit-8，BBI Life Sciences 公司)；兔抗人Vimentin單克隆抗體(abcam 公司)；兔抗人E-cadherin單克隆抗體(Proteintech 公司)；兔抗人β-actin單克隆抗體、兔抗人Snail單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記抗兔IgG(Cell Signaling Technology 公司)。

1.2 肉桂醛溶液的配置

取500 μL肉桂醛原液，溶于9.5 mL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)中，配置成0.05 g/mL的母液，-20 ℃避光保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 人舌鱗癌細胞CAL27細胞系購自BNCC細胞菌種庫。用含10%滅活胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、1%青霉素(100 U/mL)和1%鏈霉素(100 μg/mL)的DMEM培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)，放入37 ℃、5%CO2的細胞恒溫培養(yǎng)箱中進行孵育。

1.3.2 CCK8法檢測肉桂醛對CAL27細胞增殖的毒性作用 將處于對數(shù)生長期的CAL27細胞接種于96孔板內(nèi)，2×104個細胞/孔，100 μL培養(yǎng)基/孔。放入37 ℃、5% CO2的細胞恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h。將其分為實驗組和對照組，分別用含4 mg/L、12 mg/L、20 mg/L和28 mg/L肉桂醛的培養(yǎng)基處理實驗組細胞，用含0.08%DMSO的培養(yǎng)基處理對照組細胞，每組濃度設(shè)置5個復孔。放入37 ℃、5% CO2的細胞恒溫培養(yǎng)箱中分別孵育0、24、48、72 h。每孔加入10 μL CCK8 solution，孵箱內(nèi)避光孵育40 min，用酶標儀測定450 nm處的吸光度。實驗重復3遍。

1.3.3 細胞劃痕實驗 將處于對數(shù)生長期的CAL27細胞接種于6孔板內(nèi)，5×105個細胞/孔，2 mL培養(yǎng)基/孔。放入37 ℃、5% CO2的細胞恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h。細胞鋪滿底壁，用20 μL移液槍的槍頭在培養(yǎng)皿底部均勻劃線，PBS洗細胞3遍，分別用含4、12、20、28 mg/L肉桂醛的無血清培養(yǎng)基處理實驗組細胞，用含0.08%DMSO的無血清培養(yǎng)基處理對照組細胞。用倒置顯微鏡，按0、6、12、24 h時間點取樣，在放大100倍下進行拍照，劃痕位置居中且垂直。實驗重復3遍。

1.3.4 Transwell小室侵襲實驗 用含4 mg/L、12 mg/L、20 mg/L和28 mg/L肉桂醛的無血清培養(yǎng)液重懸實驗組CAL27細胞，用含0.08%DMSO的無血清培養(yǎng)液重懸對照組CAL27細胞，進行細胞計數(shù)。每個transwell上室(8.0 μm孔徑)內(nèi)接種200 μL含5×104個細胞的培養(yǎng)液，每個24孔板下室加入500 μL含10%FBS的培養(yǎng)基。加藥處理24 h后，用無菌小棉簽輕柔擦掉上室內(nèi)未穿膜的細胞，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min。用倒置顯微鏡，隨機選取5個視野，觀察細胞并計數(shù)。實驗重復3遍。

1.3.5 流式細胞術(shù) CAL27細胞系經(jīng)細胞培養(yǎng)、傳代后，將其分為實驗組和對照組，分別用含4 mg/L、12 mg/L、20 mg/L和28 mg/L肉桂醛的培養(yǎng)基處理實驗組細胞，用含0.08% DMSO的培養(yǎng)基處理對照組細胞。加藥處理48 h后，用不含乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)的胰酶進行消化，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，收集細胞，用PBS重懸細胞并進行細胞計數(shù)，每個流式管取5×105個重懸的細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，每管加入100 μL Binding Buffer、10 μL PI、5 μL Annexin Ⅴ-FITC室溫下避光孵育15 mim，每個流式管內(nèi)加入400 μL Binding Buffer，混勻后上機檢測。實驗重復3遍。

1.3.6 Western blot CAL27細胞系經(jīng)細胞培養(yǎng)、傳代后，將其分為實驗組和對照組，分別用含4 mg/L、12 mg/L、20 mg/L和28 mg/L肉桂醛的培養(yǎng)基處理實驗組細胞，用含0.08% DMSO的培養(yǎng)基處理對照組細胞。加藥處理48 h后，進行蛋白提取與蛋白濃度測定，樣本蛋白裂解液與5×蛋白上樣緩沖液混勻，100 ℃沸水浴10 min。制備SDS-PAGE凝膠，點樣后進行電泳分離并電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)上，用含5%脫脂奶粉的Tris-HCL緩沖液(Tris buffered saline Tween, TBST)室溫下?lián)u床封閉1 h，TBST漂洗3次，5min/次。用一抗稀釋液稀釋相應的一抗(1∶1 000)，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4 ℃搖床過夜。室溫下?lián)u床TBST洗膜6次，5 min/次。用TBST稀釋經(jīng)過HRP標記的二抗(1∶5 000)，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，室溫下?lián)u床孵育2 h。室溫下?lián)u床TBST洗膜6次，5 min/次。通過掃膜儀進行顯色曝光。實驗重復3遍。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 肉桂醛在體外條件下對CAL27細胞增殖的抑制作用

通過CCK8實驗檢測肉桂醛對口腔鱗癌細胞CAL27增殖性的抑制作用。實驗組藥物濃度梯度采用4 mg/L、12 mg/L、20 mg/L和28 mg/L，實驗結(jié)果如圖1，結(jié)果顯示，與對照組相比，肉桂素處理組在0、24、48、72 h都能夠呈劑量依賴性抑制細胞活性。經(jīng)肉桂醛處理的實驗組呈作用時間和藥物濃度依賴性抑制CAL27細胞的增殖。

圖1 CCK8檢測口腔鱗癌細胞CAL27增殖

2.2 肉桂醛在體外條件下對CAL27細胞遷移能力的抑制作用

通過劃痕實驗檢測肉桂醛對CAL27細胞的遷移能力是否具有抑制作用。結(jié)果顯示，在劃痕6 h的CAL27細胞中，各組間遷移距離無明顯差異。在劃痕12 h的CAL27細胞中，與對照組相比，肉桂醛處理組隨藥物濃度升高抑制細胞遷移距離。在劃痕24 h的CAL27細胞中，與對照組相比，肉桂醛處理組呈劑量依賴性抑制細胞遷移能力，其差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)果如圖2。

圖2 劃痕實驗檢測CAL27遷移( ×100)

2.3 肉桂醛在體外條件下對CAL27細胞侵襲能力的抑制作用

根據(jù)CCK8實驗結(jié)果，transwell小室侵襲實驗實驗組藥物濃度梯度采用4、12、20、28 mg/L，實驗結(jié)果如圖3，在CAL27細胞中，藥物作用24 h后，單個視野中，對照組細胞穿膜數(shù)目為(137.0±1.7)個，實驗組細胞穿膜數(shù)目依次為(90.0±2.6)、(75.0±3.1)、(35.0±2.3)、(7.0±1.1)個。與對照組相比，肉桂醛處理能夠呈劑量依賴性抑制細胞侵襲能力，其差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

A～E:藥物濃度梯度0、4、12、20、28 mg/L

2.4 肉桂醛在體外條件下對CAL27細胞凋亡的促進作用

為探討肉桂醛對口腔鱗癌細胞CAL27的凋亡是否具有促進作用，測定CAL27細胞凋亡率。流式細胞術(shù)實驗組藥物濃度梯度采用4、12、20、28 mg/L，實驗結(jié)果如圖4，藥物作用48 h后，對照組細胞凋亡率為(14.59±0.79)%，實驗組細胞凋亡率依次為(20.69±1.12)%、(26.38±0.83)%、(35.53±1.21)%、(66.48±0.83)%。與對照組相比，肉桂醛處理能夠呈劑量依賴性促進細胞凋亡，其差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖4 流式細胞術(shù)檢測CAL27細胞凋亡

2.5 肉桂醛在體外條件下對CAL27細胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

通過Western blot實驗檢測肉桂醛對CAL27的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是否產(chǎn)生影響。實驗結(jié)果如圖5，藥物作用48 h后，與對照組相比，肉桂醛處理能夠呈劑量依賴性抑制蛋白Vimentin，Snail表達，其差異具有統(tǒng)計學意義(*：P<0.05;***：P<0.001)；肉桂醛處理能夠呈劑量依賴性促進蛋白E-cadherin表達，其差異具有統(tǒng)計學意義(***：P<0.001)。

圖5 Western blot 檢測CAL27上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

3 討 論

OSCC作為最常見的口腔頜面部惡性腫瘤，根據(jù)組織來源好發(fā)于舌部，舌體組織具有靈敏的活動度，血液循環(huán)豐富，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率也比較高[10-11]。故本實驗選取人舌鱗癌細胞CAL27細胞系(該細胞系源自一位男性，56歲，白種人，舌中部病變部位，角蛋白呈強陽性)。化療作為晚期舌部鱗狀細胞癌患者綜合序列治療的重要輔助手段，存在難以避免的不良反應及并發(fā)癥，這將嚴重影響到患者的生存質(zhì)量[12-13]。因此，尋求不良反應小、低毒副作用、并發(fā)癥少的治療藥物，成為目前臨床基礎(chǔ)研究的重要課題之一。

中西醫(yī)結(jié)合作為目前綜合治療腫瘤的手段之一，可以在一定程度上減輕手術(shù)結(jié)合放化療帶來的不良反應。越來越多的中草藥已經(jīng)用于增強化療藥物的抗腫瘤效果并降低其毒副作用[14-15]。肉桂醛及其衍生物是研發(fā)口腔鱗狀細胞癌新型抗腫瘤藥物的候選藥物[16]。目前國內(nèi)外研究表明，肉桂醛能夠在體外抑制黑素瘤A375細胞的侵襲能力及NF-kB的活化[17]；肉桂醛通過上調(diào)蛋白P21表達和下調(diào)CDK4表達，促進人宮頸癌HeLa細胞凋亡[18]；人肝癌細胞HepG2的研究表明肉桂醛通過增加蛋白P21表達和降低CDK4表達，抑制HepG2細胞增殖[19]；肉桂醛通過下調(diào) Bcl 2和 Mcl 1抗凋亡蛋白表達、上調(diào)促凋亡蛋白Bax,引起下游凋亡蛋白酶Caspase3和Caspase9活化，干擾細胞周期進程，誘導食管癌Eca109細胞凋亡[20]。本實驗Western blot研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)不同濃度肉桂醛(4、12、20、28 mg/L)處理48 h后的CAL27細胞，呈劑量依賴性抑制蛋白Vimentin、Snail表達，促進蛋白E-cadherin表達。EMT在腫瘤細胞的遷移中發(fā)揮了重要作用[21-23]。Vimentin作為中間絲中的一種蛋白質(zhì)，用于維持細胞骨架的完整性。鈣黏著蛋白E-cadherin介導鈣依賴性細胞的胞間粘附，并在正常組織發(fā)育中發(fā)揮重要作用，是上皮癌浸潤生長的活性抑制蛋白[24]。在上皮腫瘤細胞系中，Snail和E-cadherin的mRNA水平呈負相關(guān)，Snail可抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄[25-26]。然而肉桂醛通過影響EMT從而對細胞CAL27遷移產(chǎn)生抑制作用的相關(guān)機制還需進一步研究和探討。

本實驗旨在研究不同濃度肉桂醛在體外二維條件下對口腔鱗癌細胞CAL27的增殖、遷移、侵襲、凋亡和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。CCK8顯示，肉桂醛呈作用時間和藥物濃度依賴性抑制CAL27細胞的增殖。劃痕實驗和transwell小室侵襲實驗結(jié)果表明，肉桂醛呈劑量依賴性抑制CAL27細胞的遷移和侵襲能力。流式細胞術(shù)顯示，肉桂醛呈劑量依賴性促進CAL27細胞凋亡。Western blot表明，肉桂醛通過EMT過程對CAL27的遷移產(chǎn)生抑制作用。腫瘤細胞增殖和遷移的過程十分復雜，肉桂醛對口腔鱗癌細胞CAL27抑制作用的相關(guān)調(diào)控機制尚不清楚，以上結(jié)論還需其它實驗進一步驗證。