糞大腸菌群多管發(fā)酵法測定中復(fù)發(fā)酵試驗的分析

溫靜梅

(山西省太原生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心，山西 太原 030002)

引 言

糞大腸菌群是總大腸菌群中的一部分，主要來自糞便。在44.5 ℃溫度下能生長并發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的大腸菌群稱為糞大腸菌群。通過研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)適當(dāng)提高培養(yǎng)溫度時，在自然環(huán)境中可以生長的大腸菌群將不再生長，培養(yǎng)出的菌群主要是來自糞便中的大腸菌群，這樣可以更為準(zhǔn)確地反映出水質(zhì)受糞便污染的情況[1]。多管發(fā)酵法作為目前環(huán)境監(jiān)測實驗中測定水質(zhì)糞大腸菌群的一種常見方法，受到人們廣泛探討和研究。張少峰等[2]歸納了檢測糞大腸菌群發(fā)酵法、濾膜法、酶底物法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)、熒光原位雜交技術(shù)、自動化檢測方法等的優(yōu)缺點及研究進(jìn)展。呂琦等[3]按照多管發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)法稀釋接種水樣，不經(jīng)過初發(fā)酵，直接接種在EC培養(yǎng)基中，在44.5 ℃水浴中培養(yǎng)24 h，然后與多管發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)法得到的結(jié)果對比，結(jié)果極為一致，得出直接用EC培養(yǎng)基培養(yǎng)法測定地表水中糞大腸菌群數(shù)可行，有很好的實用性。王朝霞[4]概述了多管發(fā)酵法的檢測意義、發(fā)展歷程，由不確定度引出的質(zhì)量控制探討，以及濾膜法、紙片法、酶底物法等檢測方法的優(yōu)缺點，說明多管發(fā)酵法是檢測糞大腸菌群的經(jīng)典方法。王曉雯等[5]對地表水、海水水樣中多管發(fā)酵法測定糞大腸菌群過程中不確定度進(jìn)行分量計算，建立簡單的多管發(fā)酵法不確定度評定方法，得出人員操作中重復(fù)檢測和隨機(jī)性是不確定度的主要來源。張貴剛等[6]主要從培養(yǎng)基稱量配置過程中、取樣稀釋過程中、培養(yǎng)基發(fā)酵陽性管比例中引入的不確定度評定糞大腸菌群多管發(fā)酵法。

本文根據(jù)《水質(zhì)糞大腸菌群的測定多管發(fā)酵法》(HJ 347.2-2018)測定地表水中糞大腸菌群，歸納總結(jié)針對初發(fā)酵后的不同實驗現(xiàn)象進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗及分析。首先根據(jù)《水質(zhì)糞大腸菌群的測定多管發(fā)酵法》(HJ 347.2-2018)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行樣品接種、初發(fā)酵，在此基礎(chǔ)上總結(jié)初發(fā)酵后的不同實驗現(xiàn)象，并進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗，最后主要介紹實驗結(jié)論。

1 實驗部分

1.1 主要儀器和試劑

采樣瓶；立式壓力蒸汽滅菌器：115 ℃、121 ℃可調(diào)；數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱：允許溫度偏差37(±0.5) ℃；電熱恒溫培養(yǎng)箱：允許溫度偏差44(±0.5)℃；pH計：準(zhǔn)確到0.1；接種環(huán)：直徑3 mm；試管：20 mL、10 mL；乳糖蛋白胨培養(yǎng)液：準(zhǔn)確稱取乳糖蛋白胨試劑23 g，溶解于1 000 mL蒸餾水中，充分混勻，分裝于含有倒置小玻璃管的試管中，115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，儲存于冷暗處備用；三倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)液：準(zhǔn)確稱取乳糖蛋白胨試劑69 g，溶解于1 000 mL蒸餾水中，充分混勻，分裝于含有倒置小玻璃管的試管中，115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，儲存于冷暗處備用；EC培養(yǎng)液：準(zhǔn)確稱取EC試劑23 g，溶解于1 000 mL蒸餾水中，充分混勻，分裝于含有倒置小玻璃管的試管中，115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，儲存于冷暗處備用；無菌水：去離子水經(jīng)121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，備用。

1.2 樣品前期處理

1.2.1 樣品接種

準(zhǔn)備5支已滅菌、裝有5 mL三倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)液和10支已滅菌、裝有10 mL單倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管，在無菌環(huán)境下，混勻樣品，分別向5支裝有5 mL三倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管中加入10 mL水樣，向5支裝有10 mL單倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管分別加入1 mL水樣，向5支裝有5 mL單倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管中加入0.1 mL水樣。

1.2.2 初發(fā)酵

將接種好的15支試管放入37(±0.5)℃的數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24(±2)h。

1.3 復(fù)發(fā)酵試驗

1.3.1 不同實驗現(xiàn)象總結(jié)

在利用多管發(fā)酵法測定地表水糞大腸菌群實驗過程中發(fā)現(xiàn)，水樣在37(±0.5) ℃的數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱中初次發(fā)酵培養(yǎng)24(±2) h后，會出現(xiàn)不同的實驗現(xiàn)象，具體情況如下：

1) 初發(fā)酵試管顏色未發(fā)生變化，仍為淺紫色。

2) 初發(fā)酵試管上半管仍為淺紫色，下半管變成黃色；小玻璃倒管中氣泡不明顯，輕拍試管，無小氣泡升起。

3) 初發(fā)酵試管上半管仍為淺紫色，下半管變成黃色；小玻璃倒管中有明顯氣泡。

4) 初發(fā)酵試管顏色由淺紫色變?yōu)辄S色，說明產(chǎn)酸；小玻璃倒管中氣泡不明顯，輕拍試管，無小氣泡升起。

5) 初發(fā)酵試管顏色由淺紫色變?yōu)辄S色，說明產(chǎn)酸；小玻璃倒管中氣泡不明顯，輕拍試管，有小氣泡升起。

6) 初發(fā)酵試管顏色由淺紫色變?yōu)辄S色，說明產(chǎn)酸；小玻璃倒管中有明顯氣泡，則表明為陽性。

不同實驗現(xiàn)象統(tǒng)計見表1。

表1 不同實驗現(xiàn)象統(tǒng)計

針對以上6種不同的實驗現(xiàn)象，均進(jìn)行了復(fù)發(fā)酵試驗，具體試驗設(shè)計如表2。6種不同的實驗現(xiàn)象，均進(jìn)行了2個空白試驗，2個同等條件下的EC培養(yǎng)基接種。其中，在正常情況下，出現(xiàn)現(xiàn)象1) 則不需要進(jìn)行復(fù)發(fā)酵，本實驗對其也進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗，目的是將其與空白對照結(jié)合，共同質(zhì)量控制。復(fù)發(fā)酵試驗的主要過程是，輕微振蕩試管，用經(jīng)火焰灼燒并冷卻后的接種環(huán)在試管中獲取培養(yǎng)物，并將其接種在裝有已滅菌的EC培養(yǎng)基試管中，放入44.5(±0.5)℃的電熱恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24(±2)h，培養(yǎng)后，若EC培養(yǎng)基小倒管未產(chǎn)氣，則說明糞大腸菌群為陰性，若小倒管產(chǎn)氣，則說明糞大腸菌群為陽性。針對現(xiàn)象1～現(xiàn)象6進(jìn)行的試驗，以下分別稱之為實驗1～實驗6。

表2 不同實驗現(xiàn)象的復(fù)發(fā)酵試驗設(shè)計

1.3.2 試驗結(jié)果

試驗1中，2個空白對照、2個平行的EC培養(yǎng)基小倒管均未產(chǎn)氣，為陰性；試驗2中，2個空白對照、2個平行的EC培養(yǎng)基小倒管也均未產(chǎn)氣，為陰性；試驗3～實驗5中，復(fù)發(fā)酵結(jié)果分兩種情況：有的情況是2個空白對照、2個平行的EC培養(yǎng)基小倒管均未產(chǎn)氣，為陰性；有的情況是2個空白對照試驗未產(chǎn)氣，而2個平行的EC培養(yǎng)基小倒管均產(chǎn)氣，為陽性；試驗6中，2個空白對照試驗未產(chǎn)氣，2個平行的EC培養(yǎng)基小倒管均產(chǎn)氣，為陽性。

2 結(jié)果分析

當(dāng)初發(fā)酵未產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則為陰性，無需進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗；當(dāng)初發(fā)酵試管呈上半管為淺紫色，下半管變成黃色，則需要重點觀察是有否有氣泡產(chǎn)生，一般無氣泡的為陰性，有氣泡則需進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗進(jìn)一步確定，因為有時候小倒管里不是初發(fā)酵產(chǎn)生的氣泡，是自身空氣未排空；初發(fā)酵試管顏色由淺紫色變?yōu)辄S色，小玻璃倒管中氣泡不明顯，為疑似陽性，需要進(jìn)一步進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗，試驗結(jié)果有可能是陽性，也有可能是陰性；初發(fā)酵試管顏色由淺紫色變?yōu)辄S色，小玻璃倒管中氣泡不明顯，輕拍試管，有小氣泡升起，也需進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗進(jìn)一步確定；初發(fā)酵試管顏色由淺紫色變?yōu)辄S色，小玻璃倒管中有明顯氣泡，則表明為陽性，但也需要進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗驗證。總之，初發(fā)酵出現(xiàn)現(xiàn)象3～現(xiàn)象6時，仍需進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗，進(jìn)一步確定糞大腸菌群是否為陽性。

3 結(jié)語

多管發(fā)酵法測定地表水中糞大腸菌群時，初發(fā)酵后在產(chǎn)酸產(chǎn)氣方面會出現(xiàn)不同的實驗現(xiàn)象，針對不同的實驗現(xiàn)象需分情況處理，有的可以直接確定糞大腸菌群為陰性，有的則需進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗，從而進(jìn)一步確定糞大腸菌群是否為陽性，這樣才能更好、更準(zhǔn)確地得出實驗結(jié)果。