黃河三角洲蘆葦根際氨氧化微生物的空間分布

宋延靜，馬蘭，李萌，付嬈，聶文靖，李俊林，王向譽，郭洪恩

（山東省蠶業研究所，山東煙臺 264002）

黃河三角洲由于瀕臨渤海土壤鹽漬化嚴重，存在土壤結構性差、肥力低等問題，但開發利用潛力巨大。鹽生植物是唯一能夠在此環境下正常生長的植物，蘆葦是常見的鹽生植物之一。在對黃河三角洲開發利用過程中，氮素的施入不可避免。氨氧化過程是硝化作用的第一個反應步驟，也是限速步驟，是全球氮循環的中心環節。氨氧化過程由氨氧化古菌（AOA）和氨氧化細菌（AOB）兩類微生物共同完成［1］，二者應對各種環境變化的響應不同，因此也被認作環境變化的潛在指示。結合全球變化背景，揭示微生物驅動的氮循環過程尤其是植物根際微生物，對評價與預測河口濕地生態系統服務功能變化、管理決策等至關重要。

根際是土壤、植物、微生物三者相互作用、相互制約的界面和物質轉化的活躍區域［2］。滕澤棟等［3］對野鴨湖濕地蘆葦根際微生物多樣性進行調查發現了磷素轉化相關的微生物，但國內外有關蘆葦根際微生物的研究主要集中于16S基礎之上的研究［4，5］，而對根際功能微生物研究較少，尤其是氮循環相關功能微生物［6］。隨著微生物生物地理學的發展，距離-衰減關系被發現也廣泛適用于微生物群落，空間距離越遠的兩個樣點，其生物群落組成相似度也越低［7-9］。目前有關黃河三角洲地區不同空間尺度下的植物根際微生物研究也不多見。

本研究首次結合熒光定量PCR技術與高通量測序技術對黃河三角洲不同區域（濱州、東營、昌邑、壽光）蘆葦根際氨氧化微生物（包括AOA和AOB）的豐度、多樣性和群落結構進行比較，研究結果將對濕地生態環境的合理開發利用及保護提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 研究區域概況

黃河三角洲是黃河入海口處形成的沖積平原，屬于溫帶季風型大陸性氣候，全年平均氣溫12.3℃，降水量 542.3～842.0 mm，其中約75.5%的降水集中于 6—9月，年蒸發量 1 885.0 mm。該地區土壤以濱海鹽土為主，土壤含鹽量高［10］。土壤鹽分主要為海水氯化物和硫酸鹽類。大部分面積的土壤屬于鹽漬化土壤的范疇，且鹽漬化程度高，此外，土壤養分匱乏，有機質含量很低，土壤黏重板結［11，12］。

1.2 樣品采集

選擇黃河三角洲的昌邑、壽光、濱州、東營4個采樣點進行蘆葦資源的調查及根際和根周土的收集（抖根法）。采集后的土壤樣品存于冰盒（4℃）并立即轉移到實驗室，用于提取DNA的樣品立即放置到-80℃冷凍，用于測定環境因子的樣品于-20℃冷凍保存。

1.3 土壤理化性質測定

土壤樣品利用0.01 mol／L氯化鈣溶液浸提后進行pH值和含鹽量測定。土樣經冷凍干燥后，取 2.5 g，加入 2 mol／L的 KCl 25 mL，振蕩 1 h，過濾備用，采用連續流動分析儀（AutoAnalyzerⅢ）測定銨態氮、硝態氮、亞硝態氮含量。利用元素分析儀（vario MICRO CUBE）進行土壤總氮含量的測定。利用原子吸收分光光度計測定土壤中Na＋、K＋含量。

1.4 土壤DNA的提取和高通量測序

按照Fast DNA?SPIN Kit for Soil試劑盒說明步驟提取DNA，用分光光度計（NanoDrop 2000c）測定DNA的濃度及純度。利用AOB-amoA特異性引物 amoA1F／amoA2R［13］和 AOA-amoA特異性引物 arch-amoA-for／arch-amoA-rev［14］分別進行PCR擴增，然后利用Illumina PE250測序平臺進行測序（上海凌恩生物有限公司）。

1.5 熒光定量 PCR

AOA和AOB的絕對豐度采用TB Green熒光定量PCR法獲得，在BioRad CFX96平臺上進行。稀釋相應質粒至10-1到10-8，并繪制標準曲線。每個樣品設3次重復，并設不加模板的反應管為陰性對照。

1.6 高通量數據分析

高通量數據分析基于Linux平臺的QIIME 1.9.0流程，參考數據庫為 FGR（version 7.3）。具體流程如下：過濾read尾部質量值20以下的堿基和質控后50 bp以下的read；篩除錯配比率大于0.2的拼接序列；用USEARCH軟件和GOLD數據庫，采用denovo和reference結合的方式去除嵌合體，并選取97%的序列相似度作為閾值（cut off）劃分OTU；采用 RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析。

1.7 數據處理

利用SPSS 20統計軟件中的單因素方差分析（ANOVA）檢驗不同采樣點蘆葦根際土中amoA基因和arch-amoA基因拷貝數的差異顯著性；利用mothur計算不同地域蘆葦根際氨氧化微生物類群的α多樣性指數；利用R語言的vegan包進行基于Weighted UniFrac距離矩陣的聚類樹分析。

2 結果與分析

2.1 土壤環境因子分析

由表1可見，4個采樣點的土壤 pH值為7.18～7.58，濱州和東營兩點的 pH值顯著高于壽光和昌邑。東營和濱州兩點土壤質地為黏土，含鹽量較高，均在5‰以上，尤其東營采樣點達到11.22‰；昌邑和壽光采樣點的土壤為砂質土，含鹽量低，不足 1‰。黃河三角洲土壤總氮在0.018%～0.050%之間，東營和濱州采樣點的總氮、總碳含量以及含水量均顯著高于壽光、昌邑。蘆葦覆蓋下的土壤氮以硝態氮為主，含量在2.44～8.13 mg／kg之間；東營采樣點的銨態氮含量也較高。壽光、東營、濱州土樣的Na＋含量高于K＋，尤其東營、濱州兩點的Na＋含量明顯高于壽光、昌邑。

表1 土壤環境因子

2.2 基于amoA基因熒光定量PCR的AOA和AOB豐度比較

定量PCR結果（圖1）顯示，來源于黃河三角洲4點的蘆葦根部土壤中氨氧化微生物均以AOA占主導，AOA的拷貝數比AOB要高出1～2個數量級。

對于AOA，蘆葦根際土中arch-amoA基因拷貝數以東營最高，平均值為1.61×108copies／g；其次為濱州，平均值為 1.06×108copies／g；昌邑較低，為7.56×107copies／g；壽光最低，僅為5.77×106copies／g。蘆葦根周土中的arch-amoA豐度要顯著低于根際土，仍以東營的arch-amoA拷貝數最高，為1.14×107copies／g，昌邑、壽光、濱州 3點的蘆葦根周土中arch-amoA拷貝數差異不顯著，以昌邑的最低。

對于AOB，除昌邑外，壽光、東營、濱州三點的蘆葦根周土中amoA拷貝數都高于根際土，東營的蘆葦根周土中amoA拷貝數最高，為6.70×107copies／g；濱州的蘆葦根際土中amoA拷貝數最低，僅 9.11×104copies／g。

圖1 黃河三角洲不同地區間蘆葦根際AOA和AOB amoA基因豐度的比較

2.3 黃河三角洲不同地區蘆葦根際 AOA和AOB的α多樣性

對于AOA，通過質控共獲得170 812條高質量的arch-amoA基因序列，劃分為342個OTU，每個采樣點蘆葦根際AOA的OTU數量平均在100～150之間。從表2的Chao1數據可知，各樣本的AOA豐富度排序為東營（DY）＞濱州（BZ）＞昌邑（CY）＞壽光（SG）；從Shannon指數和Simpson指數來看，各站點AOA多樣性從高到低依次是壽光（SG）＞濱州（BZ）＞東營（DY）＞昌邑（CY）。

對于AOB，通過質控共獲得172 001條高質量的amoA基因序列，劃分為443個OTU，每個采樣點蘆葦根際AOB的OTU數量平均在23～171之間。從表2的Chao1數據得知，AOB的豐富度昌邑最高；從Shannon指數和Simpson指數來看，AOB的多樣性總體表現為昌邑（CY）＞濱州（BZ）＞壽光（SG）＞東營（DY）。

表2 不同采樣點蘆葦根際氨氧化微生物（AOA和AOB）α多樣性指數

2.4 黃河三角洲蘆葦根際AOA和AOB群落組成分析

從圖2可以看出，從屬的水平來看，奇古菌門（Thaumarchaeota）的亞硝化球菌（Nitrososphaera）是昌邑和壽光兩地蘆葦根際土中參與氨氧化過程的主要AOA類群（＞99%）；對于濱州和東營，蘆葦根際中的AOA類群主要為Nitrosopumilus，其次為Nitrosoarchaeum古菌類群。

昌邑和壽光兩地蘆葦根際土中參與氨氧化過程的主要 AOB類群為亞硝化弧菌屬（Nitrosovibrio）和亞硝化螺菌屬（Nitrosospira）；東營蘆葦根際中的AOB類群較為單一，幾乎全為亞硝化螺菌屬（Nitrosospira）；濱州蘆葦根際中除亞硝化螺菌屬（Nitrosospira，86.0%）外，亞硝化單胞菌（Nitrosomonas）也占了12.7%，該菌在其它三地蘆葦根際含量較低。

圖2 黃河三角洲不同地區蘆葦根際固氮菌群落結構（屬級別）

2.5 黃河三角洲蘆葦根際AOA和AOB的Beta多樣性分析

基于Weighted UniFrac距離矩陣計算黃河三角洲不同地區蘆葦根際AOA和AOB的Beta多樣性，結果（圖3）表明，不論是AOA還是AOB，東營和濱州蘆葦根際氨氧化群落組成以及結構差異較小，壽光和昌邑蘆葦根際氨氧化群落結構較小。

圖3 基于UniFrac距離矩陣的蘆葦根際AOA和AOB聚類樹分析

3 討論與結論

黃河三角洲屬于典型的河口濕地生態系統，生態環境脆弱，生物多樣性低。蘆葦是黃河三角洲地區鹽生植被的主要建群物種，占土壤面積的5.38%［15］，主要生長在河口濕洼地和濱海沼澤地等地勢低洼的地區，群落生境一般有積水，土壤含鹽量變化較大［16，17］。

3.1 黃河三角洲蘆葦根際AOA和AOB的豐度特征

本研究發現黃河三角洲濕地昌邑、壽光、東營、濱州四地的蘆葦根用土氨氧化微生物均以AOA為主，這與國內外大多數河口環境的研究結果相一致［18，19］。有限的氮底物則可能是氨氧化微生物生長的限制因素，AOA在肥力低的環境中貢獻較大，主要是因為AOA對底物氨的親和力遠高于AOB［20］，因此在低肥力土壤中更具競爭優勢。當然，也有例外，在Douro河口和Cochin河口，AOB的豐度顯著高于 AOA［21，22］，同樣我們在昌邑采樣點得到的蘆葦根周土氨氧化微生物群落中也是AOB豐度較高，分析造成這種特殊現象的原因可能與鹽度有關。鹽度是解釋AOA群落結構模式的主要因素，中等鹽濃度更適宜AOA的生長。一般鹽漬化土壤偏堿性，養分含量低，不利于土壤微生物的生長和繁殖［23-25］。本研究還發現，黃河三角洲4個采樣點中的AOA和AOB屬東營蘆葦根際最豐富，分析可能與東營較高的總碳、氮含量有關，因為有研究表明總氮是影響土壤中AOA和 AOB群落結構的潛在環境因素［26］。

3.2 蘆葦根際AOA和AOB在黃河三角洲不同地區的空間分布特征

本研究發現黃河三角洲4個不同地區蘆葦根際的AOA幾乎全部來源于奇古菌門（Thaumarchaeota），只是不同地區的所屬種類不同，濱州、東營兩地的AOA要比壽光、昌邑的多樣性要高。其中昌邑和壽光兩地蘆葦根際AOA優勢類群為亞硝化球菌（Nitrososphaera），濱州和東營的蘆葦根際AOA優勢類群為 Nitrosopumilus、Nitrosoarchaeum、Candidatus Nitrosotenuis。前人研究已證明Nitrosopumilus是海洋 AOA的主要優勢種群，Nitrososphaera是土壤AOA的主要優勢種群［27-29］，我們分析是東營和濱州高鹽度的生長環境選擇了蘆葦根際Nitrosopumilus這一微生物類群。

東營和濱州兩地蘆葦根際AOB的優勢類群是亞硝化螺菌屬（Nitrosospira）。Nitrosospira屬于β變形菌門的一類化能自養氨氧化微生物，更容易出現在低銨的環境中，即貧瘠的土壤環境可能適宜 Nitrosospira的生長［31，32］。Kowalchuk等也發現Nitrosospira是弱堿性土壤中發揮氨氧化作用的最主要微生物。亞硝化弧菌屬（Nitrosovibrio）和亞硝化螺菌屬（Nitrosospira）是昌邑和壽光蘆葦根際AOB的優勢類群，Nitrosovibrio也是一種嚴格好氧的化能自養氨氧化微生物。戴九蘭和苗永君在對黃河三角洲不同鹽堿農田生態系統氮循環功能菌群研究中也發現，在小麥-玉米輪作和大豆種植體系土壤中，AOB中Nitrosospira和Nitrosovibrio主導著氨氧化過程［33］。

本研究還發現距離較近的壽光、昌邑兩地的蘆葦根際AOA和AOB群落結構類似，濱州和東營兩地的AOA和AOB群落結構類似。這在一定程度上驗證了微生物的距離-衰減關系［7］，具體和哪種環境因子相關還需要進行更深入的分析探討。