副豬嗜血桿菌環(huán)介導等溫擴增檢測方法的建立及應用

李璐璐，駱延波，張慶，趙效南，任金瑞，2，胡明，張印，齊靜，劉玉慶

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所／山東省畜禽疫病防控與繁育重點實驗室，山東濟南 250100；2.山東師范大學生命科學學院，山東 濟南 250014）

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，Hps）是存在于豬上呼吸道的一種共棲菌［1］，也是一種條件性致病菌，可以在豬抵抗力較弱或者病毒感染后易感，引起以漿液性或纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關節(jié)炎、腦膜炎等為特征的Gl?serser病，也稱為副豬嗜血桿菌病［2］。副豬嗜血桿菌病多發(fā)于保育仔豬和青年豬［3］，嚴重時死亡率可達50%以上［4］。

目前對于副豬嗜血桿菌的檢測主要采用PCR方法，包括普通 PCR［5］、實時 PCR［6］、熒光定量 PCR［7，8］、多重 PCR［9］等。PCR檢測的特異性和靈敏性毋庸置疑，但是需要昂貴的PCR擴增儀和凝膠成像系統(tǒng)。Notomi等［10］在2000年發(fā)明了一種環(huán)介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術，針對靶基因序列的6個區(qū)域，設計4條引物，利用Bst DNA聚合酶的鏈置換作用，在恒溫條件下進行高效特異的擴增反應。LAMP技術目前已經(jīng)用于多種臨床常見細菌的鑒定，如大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、腸球菌、銅綠假單胞菌等［11-13］，以及細菌耐藥基因和毒力基因的檢測［14，15］。本研究擬采用LAMP技術，建立一種針對Hps的快速檢測方法，并對該方法的特異性和靈敏度進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗菌株 大腸桿菌（ATCC 25922）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）、金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）、糞腸球菌（ATCC 29212）、豬鏈球菌（ATCC 43765），購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；30份帶有明顯呼吸道癥狀的豬肺樣品，用于LAMP方法的驗證。

1.1.2 試劑與儀器 胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB），OXOID公司產(chǎn)品；小牛血清，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司產(chǎn)品；輔酶Ⅰ（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD），Sigma公司產(chǎn)品；脫氧核糖核酸擴增試劑盒（環(huán)介導等溫擴增法）、LAMP濁度實時分析儀（LA-320C）、熒光目視檢測試劑盒（SLP221），榮研生物科技有限公司產(chǎn)品；細菌DNA提取試劑盒、2×Taq PCR MasterMix，天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；凝膠成像儀、分光光度計 Nanodrop 2000，美國Bio-rad產(chǎn)品；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 病原菌的分離與基因組DNA的提取

將30份豬肺樣品在無菌條件下使用接種環(huán)劃線接種于TSA培養(yǎng)基（5%小牛血清＋1%的2 μg／mL NAD），37℃恒溫培養(yǎng) 20～24 h。在 TSA培養(yǎng)基上挑取針尖大小、邊緣整齊、表面光滑濕潤、無色近似透明的菌落，再次劃線接種于TSA培養(yǎng)基，進行純培養(yǎng)后，挑取單個疑似菌落接種于TSB培養(yǎng)基（5%小牛血清 ＋1%的 2μg／mL NAD）中，37℃搖床振蕩培養(yǎng)18 h后，通過水煮法提取模板DNA。

將純化后的大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌分別劃線于TSA培養(yǎng)基，豬鏈球菌劃線于添加5%小牛血清的TSA培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)18～20 h后，挑取單個疑似菌落接種于TSB培養(yǎng)基或添加5%小牛血清的TSB培養(yǎng)基，37℃搖床振蕩培養(yǎng)18 h后，按照天根生化科技有限公司細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取相關菌株的基因組。

1.3 引物設計

根據(jù)GenBank中已發(fā)表的Hps 16S rRNA序列，采用Blast獲得高度保守區(qū)域。針對保守區(qū)域序列，根據(jù)LAMP引物設計原則，使用藍譜公司Primer Explorer V5軟件 （http：／／primerexplorer.jp／lampv5e／index.html）設計3組引物（分別標記為HP-1L、HP-2L和HP-3L），每組引物均包含一對外引物（F3和B3）和一對內(nèi)引物（FIP和BIP）。為提高擴增效率，對篩選出的最佳引物組設計一條或兩條環(huán)引物（LF和LB）。PCR引物序列參考之前的文獻報道［5］。

1.4 反應體系的建立

LAMP反應體系（25μL）：2×反應緩沖液（RM）12.5μL，Bst聚合酶 1μL，F(xiàn)IP和 BIP各0.4μL，F(xiàn)3和 B3各 0.1μL，模板 DNA 2.0μL，加ddH2O至25μL。

PCR反應體系（25μL）：2×Taq PCR反應液10μL，16SrRNA-F和16SrRNA-R各1μL，DNA模板2μL，加 ddH2O至25μL。反應程序：94℃ 5 min；94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，30個循環(huán)；72℃ 10 min。

1.5 反應條件的優(yōu)化

選擇Hps 16SrRNA呈陽性的H21菌株作為陽性對照株，進行LAMP反應最佳引物組和最佳反應溫度的篩選以及靈敏度、特異性試驗。

1.5.1 最佳引物組的篩選 將Hps的16S rRNA的3組引物按上述反應體系分別配置后，65℃恒溫反應 60 min后，80℃恒溫反應 5 min，根據(jù)LAMP濁度儀實時記錄的650 nm的濁度值繪制濁度曲線，以最先出現(xiàn)擴增反應并且擴增效率較高的引物組為最佳引物組。選擇特異性好的引物組，根據(jù)需要設計環(huán)引物，再進行特異性驗證，從而篩選出最佳引物組。

1.5.2 最佳反應溫度的篩選 使用篩選出的最佳引物組，分別于60～67℃擴增60 min，繪制濁度曲線，選擇擴增反應最早出現(xiàn)、擴增效率較高的溫度為最佳反應溫度。

1.6 LAMP靈敏度測試

使用Nanodrop 2000測定H21菌株基因組DNA濃度，然后用滅菌去離子水將模板濃度調(diào)至1 ng／μL進行靈敏度試驗。繼續(xù)對 1 ng／μL的DNA進行10倍連續(xù)稀釋，使用同樣的一組DNA模板進行LMAP反應和PCR擴增，比較兩種方法的靈敏度。

1.7 LAMP特異性測試

首先使用5株標準菌株和H21進行LAMP反應特異性試驗。之后選取30份臨床采集的豬肺樣品的DNA作為樣本，采用LAMP和PCR兩種方法進行檢測，比較兩種方法的符合程度。

1.8 試驗結果的判讀

1.8.1 LAMP結果判讀 包括兩種方式：（1）LA-320C儀器每6 s測定一次反應管中的濁度，可根據(jù)濁度繪制實時的濁度曲線圖［16］。按照實驗儀器的說明書，一般濁度＞0.1時，認為反應結果呈陽性。（2）在LAMP反應中，DNA延伸時脫氧核酸三磷酸基質(zhì)（dNTPs）中析出的焦磷酸離子與反應溶液中的鎂離子結合，生成一種焦磷酸鎂衍生物的白色沉淀物［17］，因此使用肉眼觀察是否有白色沉淀，即可判斷反應擴增與否。

1.8.2 PCR結果判讀 取 PCR產(chǎn)物5μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳，置于凝膠成像系統(tǒng)下觀察有無條帶。

2 結果與分析

2.1 最佳引物組的篩選

以H21基因組DNA為模板，分別以HP-1L、HP-2L和HP-3L為引物，濁度監(jiān)測60 min并繪制濁度曲線，見圖1。相同溫度和反應條件下，引物HP-1L和HP-3L出現(xiàn)明顯擴增，并且這兩組引物出現(xiàn)擴增反應的時間差不多，但HP-1L的擴增效率明顯高于HP-3L。對這兩組引物組設計環(huán)引物，HP-1L引物組可設計出一組環(huán)引物（LF和LB），而HP-3L引物組只有一個環(huán)引物LB。進行特異性試驗后，最終選擇HP-1L＋LF＋LB為試驗引物組，引物序列見表1。

圖1 不同擴增引物下的濁度曲線

表1 LAMP和PCR方法的引物序列

2.2 最佳溫度的篩選

以H21基因組DNA為模板，以表1中LAMP序列作為引物，分別在60～67℃進行反應，根據(jù)濁度儀實時監(jiān)測的濁度結果繪制濁度曲線（圖2）。當反應溫度為64、65、66℃時，最先發(fā)生擴增反應。由于64℃時的擴增效率比較高，因此設定64℃為最佳反應溫度。

圖2 不同溫度下的濁度曲線

2.3 LAMP方法的特異性檢測

以H21作為陽性對照菌株，ddH2O作為陰性對照，使用5株標準菌株驗證LAMP方法的特異性，結果（圖3）表明，本研究中建立的 Hps 16SrRNA的LAMP方法具有較高的特異性，可特異性檢測Hps。

圖3 LAMP特異性試驗

2.4 LAMP方法的靈敏度檢測

以1 ng／μL的模板DNA為基礎進行10倍稀釋后，選擇1～10-6ng／μL的7個濃度為模板，分別進行LAMP和PCR的擴增。由圖4可以看出，LAMP反應的最低檢測限為10-4ng／μL，PCR反應的最低檢測限也為10-4ng／μL，LAMP方法與PCR的靈敏度相當。由圖4 A可以看出，當DNA濃度分別為1 ng／μL和10-4ng／μL時，反應時間分別為22 min和39 min。考慮到樣品的復雜性，因此將LAMP方法的反應時間設置為45 min。

2.5 臨床樣品檢測結果

對采集的30份豬肺臨床樣品進行LAMP檢測，結果發(fā)現(xiàn)12份結果為陽性；利用常規(guī)PCR進行檢測，與LAMP結果吻合，證明LAMP方法可在臨床樣品中特異性檢測Hps。

圖4 LAMP和PCR反應靈敏度試驗

3 討論與結論

目前針對Hps的PCR鑒定主要使用3個靶基因，分別為16SrRNA基因、infB基因和OMP基因。16SrRNA基因在細菌各種屬之間具有高度保守性，被廣泛用于細菌之間的種屬鑒定。

國內(nèi)外對Hps快速檢測的LAMP方法已有研究。Zhang［18］、Chen［19］等均根據(jù) infB基因建立了Hps的 LAMP方法，兩者的檢測限分別為10 CFU／mL和 5拷貝／管。魏曉媛［20］根據(jù) OMP P2基因建立了LAMP方法，其檢測限為0.2 pg／μL。根據(jù)Hps的16S rRNA基因建立的LAMP方法，其檢測限為 0.3～0.68 pg［21，22］及 0.2～0.241 pg／μL［23，24］。本試驗建立的 LAMP方法靈敏度與PCR方法相當，但比上述方法靈敏。此外，上述LAMP方法的反應時間均在50～65 min，本研究建立的LAMP方法反應時間為39 min，比之前報道的LAMP方法更適用于Hps的快速檢測。

LAMP被認為是快速檢測核酸的一種方法，具有高特異性和高靈敏度，目前已經(jīng)廣泛應用于人類和動植物中。LAMP方法與PCR方法相比，成本低廉，不需要昂貴的儀器設備，即可使用Bst聚合酶達到快速反應的目的。與傳統(tǒng)的檢測方法相比，本研究建立的LAMP檢測方法具有耗時短、成本低廉、操作簡單等優(yōu)點，尤為適合基層的疫病檢測。

目前，全球養(yǎng)豬業(yè)受到了Hps的嚴重威脅，建立及時、準確的檢測方法是成功防治該病的關鍵。本研究建立的LAMP方法為快速鑒定Hps提供了依據(jù)。