銅及氧化銅納米顆粒對(duì)浮萍、藻類的毒性效應(yīng)及機(jī)理研究進(jìn)展

何瑩，楚夢(mèng)瑋，劉洋,*，劉若晴，段文焱，仇浩

1. 昆明理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，云南省土壤固碳與污染控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650500 2. 上海交通大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200240

與微米級(jí)或塊狀的銅和氧化銅相比，銅納米顆粒(Cu NPs)及氧化銅納米顆粒(CuO NPs)具有更優(yōu)的磁性[1]、導(dǎo)電性[2]和光化學(xué)特性[3]，且其對(duì)太陽(yáng)能及紅外線具有較強(qiáng)的吸收能力[1]，因此，常被添加到納米磁性材料、導(dǎo)電膠、光伏電池、太陽(yáng)能接收器和多功能傳感器等產(chǎn)品中。這些產(chǎn)品的大量生產(chǎn)和使用，使得Cu NPs、CuO NPs的排放量也持續(xù)增多，最終可能通過(guò)大氣沉降、地表徑流和地下滲透等多種途徑進(jìn)入到天然水體中[4]，對(duì)水生生物產(chǎn)生潛在危害，如圖1所示。作為水生生態(tài)系統(tǒng)的主要初級(jí)生產(chǎn)者，水生植物(如藻類、浮萍、睡蓮和蘆葦?shù)?對(duì)食物鏈結(jié)構(gòu)及水生生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性有著重要作用[5-6]，其受污染或死亡將對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)造成嚴(yán)重?fù)p害。

圖1 銅納米顆粒(Cu NPs)和氧化銅納米顆粒(CuO NPs)在環(huán)境中的遷移、轉(zhuǎn)化及歸趨Fig. 1 Transport, transformation and fate of copper nanoparticles (Cu NPs), copper oxide nanoparticles (CuO NPs) in the environment

研究發(fā)現(xiàn)，水生植物對(duì)污染物具有較強(qiáng)的吸收和富集能力[7]，Cu NPs、CuO NPs及其釋放的Cu2+能夠快速進(jìn)入水生植物體內(nèi)，產(chǎn)生毒性效應(yīng)。李芳芳等[8]研究發(fā)現(xiàn)，水中Cu NPs釋放的Cu2+能為中肋骨條藻所吸收，抑制藻光合作用的進(jìn)行，進(jìn)而促使藻密度和葉綠素含量降低。同時(shí)，進(jìn)入水生植物體內(nèi)的Cu2+、Cu NPs或CuO NPs會(huì)在其根部、葉片中不斷積累[5]，通過(guò)食物鏈的富集，逐漸向高營(yíng)養(yǎng)級(jí)生物體內(nèi)蓄積，從而對(duì)環(huán)境中其他生物乃至人類健康產(chǎn)生威脅。

目前，對(duì)于Cu NPs和CuO NPs致毒機(jī)理的解釋仍存在爭(zhēng)議。比如，金屬基納米顆粒毒性主要源于納米顆粒本身還是其釋放的金屬離子？二者的毒性效應(yīng)及致毒機(jī)理是否存在差異？金屬基納米顆粒與其釋放的銅離子之間是否存在交互作用？這一系列的科學(xué)問(wèn)題尚待解決。有研究表明Cu NPs和CuO NPs的毒性主要來(lái)源于銅離子[9]，也有研究認(rèn)為納米顆粒本身才是毒性作用的主導(dǎo)因子[10]。而無(wú)論是離子還是納米顆粒，均能誘導(dǎo)生成活性氧(ROS)，產(chǎn)生氧化脅迫，造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器和DNA的損傷。因此，僅從脂質(zhì)過(guò)氧化這一表象無(wú)法判斷納米顆粒的毒性來(lái)源。此外，金屬基納米顆粒會(huì)向水相中持續(xù)釋放金屬離子，即使是被內(nèi)吞后位于細(xì)胞質(zhì)中[11]；釋放的金屬離子也能被還原為金屬單質(zhì)[12]。環(huán)境的pH值、溶解性有機(jī)質(zhì)(DOM)、離子強(qiáng)度、溫度及紫外線等因素均能影響二者間的這種轉(zhuǎn)化過(guò)程，從而改變Cu NPs和CuO NPs對(duì)水生植物的毒性效應(yīng)。故量化納米顆粒及其釋放的金屬離子對(duì)水生植物毒性效應(yīng)的貢獻(xiàn)是當(dāng)下相關(guān)研究中的重點(diǎn)及難點(diǎn)。

因此，本文選取浮萍和藻類為毒性指示生物，綜述Cu NPs、CuO NPs對(duì)這2種水生植物的毒性效應(yīng)及致毒機(jī)理的研究進(jìn)展，重點(diǎn)剖析Cu NPs和CuO NPs的粒徑、表面涂層以及pH值、DOM、溫度、紫外線等環(huán)境因子對(duì)水生植物毒性效應(yīng)的貢獻(xiàn)。提出當(dāng)前區(qū)分細(xì)胞內(nèi)外Cu2+、Cu NPs及CuO NPs毒性效應(yīng)方法存在的弊端，并對(duì)今后的研究方向進(jìn)行了展望，以期為含銅納米材料的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供理論依據(jù)。

1 Cu NPs、CuO NPs對(duì)不同水生植物毒性效應(yīng)(Toxic effects of Cu NPs and CuO NPs on different aquatic plants)

現(xiàn)有研究常采用毒性指標(biāo)(如半數(shù)致死劑量(LC50)、半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)、最大無(wú)作用濃度(NOEC))，結(jié)合生理生化指標(biāo)(如植物的葉綠素含量、酶含量)的方法來(lái)定量描述金屬基納米顆粒對(duì)水生植物的毒性效應(yīng)。其中，脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物——丙二醛(malonaldehyde, MDA)的含量高低常被用來(lái)反映脂質(zhì)過(guò)氧化程度及毒性強(qiáng)弱[13]。而超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)及過(guò)氧化物酶(POD)等愈傷組織分泌的抗氧化酶能夠降低胞內(nèi)ROS的濃度，在一定范圍內(nèi)保證細(xì)胞的正常代謝及生長(zhǎng)，如SOD能夠歧化O2-·、O2和H2O2，而CAT和POD能夠催化H2O2還原成H2O[13]。

1.1 浮萍

浮萍(duckweed)，又稱青萍、田萍和水浮萍，因其生長(zhǎng)迅速、繁殖能力強(qiáng)，常被用于水體修復(fù)和生態(tài)毒理學(xué)研究[14]。CuO NPs能夠抑制浮萍生長(zhǎng)，包括減少葉片數(shù)量、縮短根長(zhǎng)、降低光化學(xué)效率、減少葉綠素含量及干重等[15]。呂琨淼[5]發(fā)現(xiàn)CuO NPs(<50 nm)能夠使浮萍(LemnaminorL.)葉片數(shù)、總面積和干重分別減少70%、50%和56%，7 d-EC50為150 μg·L-1；利用透射電子顯微鏡(TEM)和X射線能譜分析儀(EDS)，還可觀測(cè)到CuO NPs在浮萍葉細(xì)胞的細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)、液泡和葉綠體上均有分布，且葉綠體發(fā)生皺縮，類囊體分層不明顯。Shi等[16]將浮萍(Landoltiapunctata)暴露于CuO NPs(10～15 nm)中僅4 d，其EC50為0.8 mg·L-1；而Lalau等[17]將同種浮萍暴露于70 nm的CuO NPs中7 d，發(fā)現(xiàn)即使在最高暴露濃度(10 g·L-1)時(shí)都未達(dá)到50%的抑制率。造成二者研究結(jié)果存在差異的原因可能是選用的CuO NPs粒徑不同，詳見(jiàn)2.1的討論。此外，Song等[18]研究了Cu NPs對(duì)不同種類浮萍的總?cè)~面積相對(duì)生長(zhǎng)率的影響，發(fā)現(xiàn)Cu NPs(25 nm)暴露對(duì)紫萍(S.polyrhiza)的168 h-EC50為(1.15 ± 0.09) mg·L-1、對(duì)L.minor的168 h-EC50為(0.84 ± 0.12) mg·L-1、對(duì)蕪萍(W.arrhiza)的168 h-EC50為(0.64 ± 0.05) mg·L-1，可見(jiàn)不同類型的浮萍對(duì)Cu NPs、CuO NPs毒性效應(yīng)的敏感度也存在差異。

1.2 藻類

藻類結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，沒(méi)有真正的根、莖、葉和維管束，因而具有敏感、生長(zhǎng)周期短、易于分離培養(yǎng)及觀測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，常被作為模式生物[19]用于水環(huán)境污染狀況監(jiān)測(cè)[20]中。Cu NPs、CuO NPs對(duì)藻類植物的毒性主要體現(xiàn)在降低其光合色素含量，破壞細(xì)胞膜通透性和抑制生長(zhǎng)等方面。同種納米顆粒對(duì)不同的藻類毒性效應(yīng)也存在差異。齊金秋[21]發(fā)現(xiàn)暴露在CuO NPs下96 h的萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii, FACHB-265)的單個(gè)藻細(xì)胞光合色素含量減少了7%～20%，EC50為306.54 mg·L-1。Wan等[22]將熱帶小球藻(Chlorellasp., CHSS26-2)暴露于CuO NPs下96 h，也發(fā)現(xiàn)藻細(xì)胞葉綠素a的含量下降了50%，EC50為104 mg·L-1。可見(jiàn)，相同暴露時(shí)間內(nèi)，CuO NPs對(duì)熱帶小球藻的毒性更強(qiáng)，是萊茵衣藻的2倍～3倍，不同藻類品種的耐受性差異及CuO NPs的粒徑差異均可能導(dǎo)致以上現(xiàn)象的產(chǎn)生。

1.3 Cu NPs、CuO NPs的致毒機(jī)理

Cu NPs、CuO NPs在水中會(huì)溶解釋放Cu2+，納米顆粒本身與釋放的Cu2+均會(huì)對(duì)水生植物產(chǎn)生毒性[23-24]。如圖2所示，二者進(jìn)入細(xì)胞的方式不同，故產(chǎn)生毒性的過(guò)程也有所差異。由于植物細(xì)胞壁的孔徑<5 nm[25]，小粒徑的納米顆粒(<5 nm)易穿過(guò)植物細(xì)胞壁到達(dá)細(xì)胞膜表面，再通過(guò)內(nèi)吞、膜表面載體蛋白的運(yùn)輸?shù)确绞竭M(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，與高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等不同細(xì)胞器結(jié)合[5]。這不僅干擾了亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的新陳代謝，還能誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS，導(dǎo)致脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等過(guò)氧化，引起細(xì)胞膜、細(xì)胞器和DNA的損傷；還會(huì)增加細(xì)胞膜的通透性，使細(xì)胞喪失正常功能甚至死亡。當(dāng)過(guò)多小粒徑(<5 nm)的納米顆粒附著于細(xì)胞膜表面時(shí)，還會(huì)阻塞離子通道，阻礙細(xì)胞內(nèi)外的離子交換，破壞細(xì)胞的胞吐過(guò)程而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[26]。大粒徑的納米顆粒則直接被阻擋在植物細(xì)胞壁外，通過(guò)靜電作用附著于細(xì)胞壁表面[27]，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生遮蔽效應(yīng)，阻礙光合作用的進(jìn)行，從而抑制植物光合色素的合成[21]。對(duì)于Cu2+而言，其離子半徑較小(0.073 nm)，小于水生植物細(xì)胞壁孔徑，更易通過(guò)細(xì)胞壁微孔及離子通道進(jìn)入植物細(xì)胞體內(nèi)。Cu2+可能的致毒機(jī)理主要包括以下2個(gè)方面：(1)進(jìn)入水生植物體內(nèi)破壞了原本的離子平衡，干擾了細(xì)胞質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)、酶的代謝及細(xì)胞內(nèi)部的電子傳遞等過(guò)程，阻礙了正常離子的吸收、運(yùn)輸、滲透和調(diào)節(jié)等功能[28]；(2)在細(xì)胞內(nèi)的累積，誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS，導(dǎo)致氧化還原失衡，從而抑制植物生長(zhǎng)[29]。對(duì)比以上致毒機(jī)理發(fā)現(xiàn)，Cu NPs、CuO NPs和Cu2+均能誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS，引起氧化脅迫，造成細(xì)胞膜、核膜、細(xì)胞器和DNA等的氧化損傷。而納米顆粒與Cu2+誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生的機(jī)制是否一致？二者作用的細(xì)胞器是否存在差異？未溶解完全的納米顆粒是否可以通過(guò)代謝排出體外？這一系列問(wèn)題還有待深入研究。

圖2 Cu NPs、CuO NPs對(duì)水生植物(浮萍、藻類)細(xì)胞的制毒機(jī)理圖[30]注：ROS表示活性氧。Fig. 2 Toxicity mechanisms of Cu NPs and CuO NPs to aquatic plants (duckweed and algae) cells[30]Note: ROS stands for reactive oxygen species.

目前，關(guān)于如何區(qū)分Cu2+和納米顆粒本身的毒性貢獻(xiàn)仍存在較大爭(zhēng)議。有學(xué)者認(rèn)為，Cu NPs、CuO NPs對(duì)水生植物的毒性主要來(lái)源于Cu2+。Lalau等[17]發(fā)現(xiàn)在CuO NPs的脅迫下，浮萍的線粒體及葉綠體膜均有損傷，但在電鏡下并沒(méi)有觀測(cè)到細(xì)胞內(nèi)存在納米顆粒，因此，推測(cè)是CuO NPs釋放的Cu2+所致。但也有人認(rèn)為納米顆粒才是毒性的主要來(lái)源。高嫄[10]通過(guò)對(duì)比試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CuO NPs對(duì)青萍葉狀體相對(duì)生長(zhǎng)率、根伸長(zhǎng)、鮮重和葉綠素含量的抑制程度都大于Cu2+(Cu2+濃度相當(dāng)于CuO NPs離子釋放量的2倍)。但上述方法在區(qū)分水生植物的毒性效應(yīng)來(lái)源上仍不夠嚴(yán)謹(jǐn)。Cu NPs、CuO NPs與Cu2+間的轉(zhuǎn)化是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，由于細(xì)胞內(nèi)存在液相環(huán)境，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的納米顆粒也可能繼續(xù)釋放Cu2+，進(jìn)入細(xì)胞的金屬離子在DOM存在的情況下也可能會(huì)被重新還原為金屬單質(zhì)[31]，如圖2所示。因此，Cu NPs、CuO NPs在水環(huán)境及水生植物體內(nèi)的遷移轉(zhuǎn)化過(guò)程非常復(fù)雜，如何量化銅離子和納米顆粒對(duì)水生植物的毒性貢獻(xiàn)仍是目前區(qū)分毒性效應(yīng)來(lái)源的關(guān)鍵。Song等[32]運(yùn)用響應(yīng)加成模型(response addition model)[33]對(duì)釋放的銅離子及納米顆粒對(duì)水蚤的毒性進(jìn)行了區(qū)分，在今后水生植物毒性的相關(guān)研究中可進(jìn)一步驗(yàn)證該模型的適用性。

2 Cu NPs、CuO NPs的濃度及特性對(duì)水生植物毒性效應(yīng)的影響(Effects of concentration and properties of Cu NPs and CuO NP on their toxicity to aquatic plants)

2.1 顆粒粒徑

通常認(rèn)為Cu NPs、CuO NPs的粒徑越小，毒性越大。一方面，納米顆粒的粒徑越小，比表面積越大，與溶液接觸越多，越易溶解釋放Cu2+，增加Cu的生物可利用度。Rippner等[34]就發(fā)現(xiàn)22 nm的CuO NPs的溶解率(約45%)>50 nm的CuO NPs(約30%)。另一方面，納米顆粒粒徑越小，越易通過(guò)細(xì)胞壁滲透到細(xì)胞內(nèi)部，促使Cu的積累。崔靜等[35]研究發(fā)現(xiàn)，CuO NPs對(duì)金魚(yú)藻葉綠素合成的抑制作用顯著大于微米氧化銅，且CuO NPs在金魚(yú)藻內(nèi)的積累量是微米氧化銅的6倍～12倍。小粒徑的納米顆粒能夠直接通過(guò)細(xì)胞膜、核膜孔徑以及離子通道等直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[36]；而大粒徑納米顆粒則可能通過(guò)主動(dòng)運(yùn)輸、吞噬作用或直接破壞細(xì)胞膜完整性進(jìn)入植物體內(nèi)[37]。Wang等[30]發(fā)現(xiàn)，粒徑<5 nm的CuO NPs可直接穿過(guò)細(xì)胞壁和細(xì)胞膜被原核藻類銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)所吸收。因此，粒徑越小的Cu NPs、CuO NPs對(duì)水生生物的潛在風(fēng)險(xiǎn)越大。

2.2 Cu NPs、CuO NPs的濃度對(duì)毒性強(qiáng)弱的影響

Cu NPs、CuO NPs對(duì)水生植物的毒性也存在劑量效應(yīng)關(guān)系[23]。有研究表示，低濃度的CuO NPs反而會(huì)促進(jìn)藻類的生長(zhǎng)，即毒物興奮效應(yīng)[35]。這可能是由于低劑量的Cu NPs能夠促使浮萍細(xì)胞分泌SOD、CAT和POD，該類抗氧化酶能夠清除植物體內(nèi)過(guò)量的ROS，從而調(diào)動(dòng)植物的生理生化代謝和繁殖的積極性[38]，對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用，使其免受ROS的危害[10]。而當(dāng)Cu NPs、CuO NPs濃度不斷升高，顆粒易發(fā)生團(tuán)聚，遮光效應(yīng)加劇，水生植物光合作用速率下降[21]；植物細(xì)胞內(nèi)的ROS濃度也隨之升高，細(xì)胞膜通透性改變，造成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的損傷。高嫄[10]研究發(fā)現(xiàn)，增加CuO NPs濃度，其釋放的Cu2+含量也會(huì)增加，對(duì)青萍的生長(zhǎng)抑制作用也隨之增加。當(dāng)CuO NPs濃度為200 mg·L-1時(shí)，青萍的相對(duì)生長(zhǎng)率、根長(zhǎng)和鮮重增加量只有空白對(duì)照的40%、23.3%和49.1%。同時(shí)，SOD、CAT、POD酶及MDA的含量也隨CuO NPs濃度的增加而逐漸升高，這說(shuō)明，CuO NPs濃度的升高也可能會(huì)誘導(dǎo)青萍細(xì)胞產(chǎn)生更多的ROS，造成青萍過(guò)氧化程度加劇。Zhang等[39]也觀測(cè)到當(dāng)CuO NPs的濃度從10 mg·L-1增大至30 mg·L-1時(shí)，蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)的數(shù)量下降了28%。但以上研究中并未對(duì)不同CuO NPs濃度下Cu2+的吸收量及細(xì)胞內(nèi)的積累量進(jìn)行定量分析。為更好地反映Cu NPs、CuO NPs與水生植物毒性間的劑量關(guān)系，在今后相關(guān)研究中應(yīng)該重點(diǎn)關(guān)注植物細(xì)胞對(duì)納米顆粒及Cu2+的吸收量和累積量。

2.3 納米顆粒的表面覆蓋層

為了增強(qiáng)納米顆粒的分散性或防止納米顆粒被腐蝕，人們常在納米顆粒表面覆蓋涂層(如丙烯酸和苯乙烯單體的聚合物[40])，但這些涂層可能也會(huì)對(duì)水生生物的生長(zhǎng)和發(fā)育產(chǎn)生影響。王朝暉等[41]發(fā)現(xiàn)，丙烯酸對(duì)棕囊藻具有致死作用(96 h-LC50為50.73～72.41 mg·L-1)。Perreault等[40]發(fā)現(xiàn)將萊茵衣藻(C.reinhardtii)暴露在4 mg·L-1聚合物涂層包裹的CuO NPs(CS-CuO NPs)下6 h，其所產(chǎn)生的ROS是暴露在40 mg·L-1裸露CuO NPs下的3倍～4倍。且CS-CuO NPs處理下藻的光合系統(tǒng)活性(13%)要顯著小于裸露CuO NPs(78%)處理組，藻細(xì)胞內(nèi)Cu的累積量也是裸露CuO NPs的6.5倍。這可能是由于CS-CuO NPs比CuO NPs具有更好的分散性，顆粒尺寸小，更易被細(xì)胞吸收進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生ROS；也有可能是聚合物涂層和細(xì)胞表面之間的一些相互作用促進(jìn)了CS-CuO NPs在藻類細(xì)胞內(nèi)的滲透，導(dǎo)致其毒性更強(qiáng)。納米涂層材料與納米顆粒間是否存在相互作用，相互作用是否會(huì)影響其與細(xì)胞的作用，還需深入研究，這將有助于準(zhǔn)確評(píng)估涂層納米顆粒的潛在毒性風(fēng)險(xiǎn)。

3 不同環(huán)境因子對(duì)Cu NPs、CuO NPs毒性效應(yīng)的影響(Effects of different environmental factors on the toxicity of Cu NPs and CuO NPs)

Cu NPs、CuO NPs在水相中的環(huán)境行為和生物效應(yīng)不僅取決于納米顆粒的濃度、粒徑及其表面涂層材料等特性，還受各種環(huán)境因子的影響，如pH值、DOM、溫度及紫外線等。在評(píng)價(jià)Cu NPs、CuO NPs對(duì)水生植物的毒性效應(yīng)時(shí)，這些環(huán)境因子的改變會(huì)影響納米顆粒的表面電荷、離子釋放和沉降速率等，從而影響Cu NPs、CuO NPs的水生植物的毒性。

3.1 水體pH值

(1)

(2)

(3)

式中：s為固體，l為液體，aq為溶液。

另外，溶液pH值與Cu NPs、CuO NPs的等電點(diǎn)(pHzpc)之間的關(guān)系決定了納米顆粒的表面電荷性質(zhì)，影響納米顆粒與水生植物的靜電作用，從而影響Cu NPs、CuO NPs的生物可利用度及毒性。Miao等[46]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH值由5升至10時(shí)，CuO NPs(pHzpc= 8.6)在水生生物膜上的吸附量由62.1 mg·g-1減少至16.3 mg·g-1。這是因?yàn)楫?dāng)水相的pH>pHzpc時(shí)，CuO NPs表面帶負(fù)電，其與帶負(fù)電荷的水生植物之間會(huì)靜電排斥，因此納米顆粒的吸附量減少[46]，CuO NPs的生物可利用度降低，其對(duì)水生植物的毒性被削弱。因此，水體的pH值不但控制著納米顆粒金屬離子的析出，也影響著Cu NPs、CuO NPs與水生植物的結(jié)合。量化不同pH值條件下不同形態(tài)銅(如固態(tài)銅、游離銅、有機(jī)結(jié)合態(tài)銅和無(wú)機(jī)結(jié)合態(tài)銅)的濃度，將有助于分析Cu NPs、CuO NPs的生物可利用度大小及毒性強(qiáng)弱。

3.2 暴露時(shí)間

Cu NPs、CuO NPs的水生植物毒性效應(yīng)還與暴露時(shí)間有關(guān)。如Melegari等[47]發(fā)現(xiàn)，在0.1 mg·L-1CuO NPs的作用下，暴露24 h和48 h的萊茵衣藻(暴露72 h，EC50= (150.45 ± 1.17) mg·L-1，NOEC<100 mg·L-1)的細(xì)胞數(shù)量和類胡蘿卜素含量無(wú)明顯變化，而72 h后萊茵衣藻的細(xì)胞密度顯著降低，葉綠素和類胡蘿卜素含量均有降低。通過(guò)測(cè)定MDA含量發(fā)現(xiàn)，暴露(CuO NPs = 1 mg·L-1)72 h后，藻細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化水平比24 h的高約40%，比48 h的高約20%。這說(shuō)明，試驗(yàn)初期藻細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化水平較低，隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，脂質(zhì)過(guò)氧化水平逐漸升高，從而抑制了藻細(xì)胞的生長(zhǎng)和光合色素的合成。齊金秋[21]還發(fā)現(xiàn)在CuO NPs脅迫初期(0～24 h)，萊茵衣藻細(xì)胞內(nèi)核苷酸的釋放量較少，細(xì)胞膜通透性較低；隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng)(24～96 h)，藻細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)遭到破壞，細(xì)胞膜通透性增加促使更多的核苷酸釋放。此外，Cu2+的釋放量與時(shí)間成正比[16]，短時(shí)間內(nèi)CuO NPs只析出少量的Cu2+，不足以對(duì)藻類生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯抑制；但隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，Cu2+的析出量不斷增加，抑制作用明顯增強(qiáng)。

3.3 溶解性有機(jī)質(zhì)

水體中富含大量DOM，其與Cu NPs、CuO NPs間的相互作用是影響納米顆粒水生植物毒性的又一重要因素[43]。DOM的存在可能增強(qiáng)納米顆粒的水生生物毒性。一方面，高濃度的DOM可能對(duì)水生植物產(chǎn)生一定的負(fù)面作用。張琛琛[48]發(fā)現(xiàn)>20 mg·L-1的富里酸(FA)會(huì)抑制蛋白核小球藻細(xì)胞的生長(zhǎng)。另一方面，由于DOM表面含有酚羥基和羧基等官能團(tuán)，DOM可與納米顆粒釋放的金屬離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)[49]，促進(jìn)顆粒溶解[50]，提高納米顆粒的遷移性與生物可利用度。李靜[51]發(fā)現(xiàn)，無(wú)FA環(huán)境下CuO NPs的EC50為1.42 mg·L-1，而加入20 mg·L-1的FA能夠顯著降低CuO NPs的EC50(0.48 mg·L-1)，導(dǎo)致CuO NPs對(duì)銅綠微囊藻(Microcystisaeruginos)的生長(zhǎng)抑制率增加。FA也可提高CuO NPs在水中的分散性，增加CuO NPs與藻細(xì)胞的接觸機(jī)會(huì)及吸收利用率，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS的累積及DNA損傷[52]。此外，由于DOM具有較強(qiáng)的電子得失能力(即氧化還原性質(zhì))[53]，DOM也可能將CuO還原為Cu2O。而Cu2O比CuO具有更強(qiáng)的溶解性，更易被氧化生成Cu2+，從而增強(qiáng)其對(duì)水生生物的毒性效應(yīng)[30]。

另一些研究則報(bào)道DOM可以削弱Cu NPs、CuO NPs的毒性。如Zhao等[54]發(fā)現(xiàn)，5 mg·L-1和40mg·L-1的FA會(huì)通過(guò)表面吸附的包裹作用和靜電排斥阻礙CuO NPs與細(xì)胞膜間的接觸，從而降低CuO NPs對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)量的抑制作用。而對(duì)于水生生物而言也可能存在同樣的機(jī)理。Rippner等[34]也發(fā)現(xiàn)加入FA、胡敏酸(HA)后CuO NPs對(duì)浮萍的相對(duì)葉面積抑制率大大降低，且運(yùn)用Visual Minteq 3.1軟件分析發(fā)現(xiàn)FA、HA能夠降低Cu2+的含量、增加溶液中銅的有機(jī)絡(luò)合量。但目前對(duì)水相中Cu NPs、CuO NPs不同存在形態(tài)(如游離銅、絡(luò)合銅及固態(tài)銅)的生物可利用度判定仍存在爭(zhēng)議，尤其是絡(luò)合態(tài)銅的生物可利用性仍是研究中的難點(diǎn)。探究金屬不同形態(tài)的生物可利用度對(duì)評(píng)估DOM存在下金屬基納米顆粒的生物毒性有著重要意義。

3.4 溫度及紫外線

除以上因素，Cu NPs、CuO NPs對(duì)水生植物的毒性還受溫度和紫外線等因素的影響。

溫度主要從2個(gè)方面影響Cu NPs、CuO NPs對(duì)水生植物的毒性。(1)溫度影響著水生植物的生長(zhǎng)代謝及其對(duì)環(huán)境的抵抗力，不同藻類在溫度波動(dòng)下表現(xiàn)出較大的適應(yīng)性差異。覃寶利等[55]發(fā)現(xiàn)短期溫度波動(dòng)會(huì)顯著增加銅綠微囊藻的游離多糖含量，降低固著多糖和總多糖含量，但對(duì)蛋白核小球藻的多糖含量并無(wú)顯著影響。(2)溫度會(huì)影響Cu NPs、CuO NPs在水體中的動(dòng)態(tài)溶解過(guò)程，影響納米顆粒的生物可利用度。由于溶解是一個(gè)吸熱過(guò)程，當(dāng)水體溫度上升時(shí)，溶解平衡向促進(jìn)溶解方向進(jìn)行。金屬的溶解度增大，析出離子增多，對(duì)水生植物生長(zhǎng)的抑制效果增強(qiáng)[56]；反之，金屬溶解度降低，析出離子減少。

紫外線的增強(qiáng)也會(huì)加劇Cu NPs、CuO NPs對(duì)水生植物的毒性作用。研究表明，紫外線本身會(huì)阻礙水生植物的光合作用[57]，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)造成植物的細(xì)胞損傷[58]。李宏文和張緯[59]發(fā)現(xiàn)，在148.8 lx的紫外線條件下照射8 h，浮萍的CAT活性(活性峰值=1.52)與對(duì)照組相比有所升高(活性峰值=1.00)，且植物體葉片出現(xiàn)褪綠變黃的現(xiàn)象。而在Cu NPs、CuO NPs存在下，紫外線可能會(huì)加劇脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加，促進(jìn)Cu在細(xì)胞內(nèi)的累積。Regier等[60]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)CuO NPs處理的伊樂(lè)藻在增加紫外照射時(shí)其體內(nèi)的SOD、POD等酶的活性均有增加，ROS的生成增多，細(xì)胞膜通透性增加，使得藻細(xì)胞內(nèi)Cu的累積量增加了3.6倍。

4 問(wèn)題與展望(Problems and prospects)

綜上所述，在Cu NPs、CuO NPs對(duì)水生植物毒性研究中存在的主要問(wèn)題包括以下3點(diǎn)：

(1)致毒機(jī)理仍存爭(zhēng)議，其主要原因有：由于液相介質(zhì)中Cu NPs、CuO NPs會(huì)緩慢釋放Cu2+，這一動(dòng)態(tài)過(guò)程導(dǎo)致難以對(duì)細(xì)胞內(nèi)外納米顆粒及釋放的Cu2+進(jìn)行準(zhǔn)確定量，因此，難以區(qū)分納米顆粒本身和Cu2+的毒性貢獻(xiàn)及毒性強(qiáng)弱。此外，銅形態(tài)在植物細(xì)胞內(nèi)外的轉(zhuǎn)化過(guò)程復(fù)雜(Cu NPs、CuO NPs、Cu2O NPs和Cu2+)，如何對(duì)不同形態(tài)銅進(jìn)行定量分析是今后研究中應(yīng)該關(guān)注的重點(diǎn)。

(2)在對(duì)于涂層納米顆粒的毒性研究中，還不能確認(rèn)毒性的主導(dǎo)因子是納米顆粒本身還是涂層材料。現(xiàn)有的大多數(shù)研究只考慮到納米顆粒與涂層的聯(lián)合作用，并沒(méi)有單獨(dú)對(duì)涂層的毒性進(jìn)行定量評(píng)估，涂層厚度或含量是否會(huì)影響納米顆粒的毒性也是需要攻克的難點(diǎn)。

(3)另外，Cu NPs、CuO NPs的環(huán)境行為及對(duì)水生植物的毒性效應(yīng)還受pH值、DOM、溫度及紫外線等環(huán)境因子的影響。以上因子不僅影響著銅的形態(tài)轉(zhuǎn)化，還會(huì)改變水生植物的生長(zhǎng)代謝。考慮多重環(huán)境因子的綜合作用將有利于準(zhǔn)確評(píng)估Cu NPs、CuO NPs對(duì)水生植物的毒性效應(yīng)。

致謝：非常感謝劉佳齊同學(xué)在文獻(xiàn)搜集上給予的幫助。

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