鍶暴露對中華大蟾蜍蝌蚪生長發(fā)育的影響及其遺傳毒性

姚凱，牛曉娟，王徐，李彩云

貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025

鍶(Sr)與鈣同為堿土金屬元素，具有相似的物理化學(xué)性質(zhì)，在一些代謝過程中鍶能夠替代鈣的功能[1-3]。貴州省溫泉出水鍶含量為0.2～20.9 mg·L-1，呈正態(tài)分布，其中，約57%的溫泉出水鍶含量在1～5 mg·L-1的范圍內(nèi)，主要以氯化物的形式存在。貴州溫泉平均鍶含量是貴州地表水平均鍶含量的7.5倍，是世界淡水平均鍶含量的47倍[4]。近年貴州省溫泉業(yè)的興起對地方經(jīng)濟(jì)做出貢獻(xiàn)，但同時也對環(huán)境安全造成潛在的威脅。溫泉業(yè)除帶來大量生活污水外，溫泉水還把較高濃度的鍶元素搬運到地表并積累，對動植物都具有一定的影響。兩棲動物是聯(lián)系水生和陸生環(huán)境的特殊物種，其幼體鰓和皮膚薄且滲透性強(qiáng)，對水質(zhì)變化極為敏感[5]，是水體環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測的重要的指示生物[6]。中華大蟾蜍(B.gargarizans)是我國的廣布種，在不同海拔生境中均大量出現(xiàn)。研究表明，中華大蟾蜍的胚胎和幼體對水體中的銅、鋁、汞和鎘等金屬污染物比較敏感[7-9]，因此，可作為進(jìn)行生態(tài)毒理學(xué)研究及水體環(huán)境評價的理想物種。對中華大蟾蜍蝌蚪在不同濃度Sr2+處理下，其遺傳和生化相關(guān)指標(biāo)及生長發(fā)育的變化情況進(jìn)行了研究，旨在探討Sr2+對中華大蟾蜍蝌蚪的毒性效應(yīng)，為評估溫泉開發(fā)對水生動物影響及水體環(huán)境監(jiān)測提供參考依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

實驗用中華大蟾蜍蝌蚪于2019年4月下旬采集于貴陽市漁洞峽，根據(jù)Gosner[10]的蝌蚪發(fā)育分期標(biāo)準(zhǔn)，采集處于發(fā)展第36期的蝌蚪。選擇這個階段是因為36期是蝌蚪后肢外化的開始，而個體腳趾的出現(xiàn)發(fā)生在蝌蚪發(fā)育的第37期。因此，這個發(fā)育階段是蛙類從水生生物向陸生生物轉(zhuǎn)變的重要階段。采集的蝌蚪被置于約20 L的水箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)水體為曝氣自來水與河水的混合體，培養(yǎng)溫度為18 ℃，每3天更換一次水。使用雞蛋黃做為飼料進(jìn)行喂養(yǎng)。培養(yǎng)2 d后，選擇大小相近和活動力強(qiáng)者用于試驗。試驗設(shè)置對照組和3個處理組，即在培養(yǎng)水體中分別添加0、0.2、2和20 mmol·L-1的SrCl2，每組5個平行，每個平行中放置30只蝌蚪。處理30 d后，對蝌蚪的生長發(fā)育指標(biāo)、遺傳和生化指標(biāo)進(jìn)行測定。

1.2 生長發(fā)育指標(biāo)分析

根據(jù)Veronez等[11]的方法并略做修改進(jìn)行蝌蚪的形態(tài)學(xué)分析。用游標(biāo)卡尺測量蝌蚪的體長、尾長和總長度，并稱量蝌蚪的體重；記錄腿的發(fā)生和異常情況。最后，根據(jù)Gosner[10]提供的簡化表，對試驗中的蝌蚪發(fā)育階段進(jìn)行評估。

1.3 彗星試驗

形態(tài)試驗結(jié)束后，用1 ml·L-1的利多卡因麻醉蝌蚪。用肝素化的注射器穿刺尾靜脈采集血樣，用于彗星試驗。血液樣本在RPMI 1640培養(yǎng)基中稀釋至1∶120(V/V)，并立即使用。試驗根據(jù)Veronez等[11]的方法進(jìn)行，在100倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)分析每個重復(fù)中的100個細(xì)胞，以觀測彗星尾部的長度。根據(jù)DNA從細(xì)胞核遷移的程度，采用視覺分類法對100個細(xì)胞進(jìn)行分析。將處理后的細(xì)胞分為5個傷害等級：0為無損傷，1為低損傷(尾長小于核)，2為中等損傷(尾長在1倍到2倍核直徑之間)，3為嚴(yán)重?fù)p傷(尾長大于核直徑2倍)和4為細(xì)胞凋亡[12]。根據(jù)觀測結(jié)果計算蝌蚪的DNA損傷指數(shù)(DI)，即用每個損傷類別觀察到的細(xì)胞核數(shù)量乘以其各自損傷類別(0～4)的值之和，結(jié)果以每個實驗組的平均DNA損傷指數(shù)表示。

1.4 谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)、過氧化氫酶(CAT)活性和金屬硫蛋白(MT)含量測定

采集血液后，將蝌蚪殺死并取出肝臟進(jìn)行酶活性及蛋白含量分析。肝臟在磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)中冰浴研磨為勻漿后，在18 000 r·min-1下離心30 min，獲得的上清液用于酶活性和蛋白濃度分析。GST(EC 2.5.1.18)的活性使用含有1 mmol·L-1的1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)和1 mmol·L-1的谷胱甘肽(GSH)的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)作為反應(yīng)混合物測定，在412 nm下測定OD值以計算酶活性。CAT(EC1.11.1.6)活性通過測定H2O2濃度的下降來計算，在反應(yīng)緩沖液中含有10 mmol·L-1的H2O2、1 mmol·L-1Tris-HCl和5 mmol·L-1EDTA，在405 nm處測定OD值的變化以計算酶活性。MT含量測定采用鎘血紅蛋白飽和法[13]。按照每分子MT結(jié)合6個鎘(Cd)原子換算成MT的含量。MT含量計算公式為：MT(μmol·g-1)=Cd(μg·g-1)/112.4/6。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用Excel和SPSS 15.0(IBM, Chicago, USA)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析，數(shù)據(jù)以平均值±SD的形式表現(xiàn)，組間差異進(jìn)行顯著性t檢驗，以P<0.05作為顯著性依據(jù)。文中所有的插圖均用Origin 9.0 (OriginLab, Hampton, USA)繪制。

2 結(jié)果(Results)

2.1 Sr2+處理對中華大蟾蜍蝌蚪生長發(fā)育的影響

由表1可知，經(jīng)過30 d處理后，對照組有77.6%的蝌蚪發(fā)育到42～46階段。而在0.2 mmol·L-1Sr2+處理組，進(jìn)入42～46階段的蝌蚪占總數(shù)的88.7%，并且有41.6%的蝌蚪進(jìn)入到發(fā)育的46階段，后腿完全發(fā)育和尾部完全被吸收，即變態(tài)發(fā)育過程完全結(jié)束。2 mmol·L-1和20 mmol·L-1Sr2+處理組的蝌蚪，與對照組相比，表現(xiàn)出發(fā)育遲滯的現(xiàn)象，分別只有59.9%和48.5%的蝌蚪進(jìn)入到42～46階段。

表1 不同濃度Sr2+處理30 d后中華大蟾蜍蝌蚪的發(fā)育狀況(%)Table 1 Frequency of developmental stages in B. gargarizans tadpoles under different concentrations of Sr2+ treatments for 30 d (%)

經(jīng)過30 d處理后，每處理組5個平行各隨機(jī)選取5只蝌蚪測量生長指標(biāo)。結(jié)果表明(表2)，0.2 mmol·L-1Sr2+處理組和對照組蝌蚪長度和體重并沒有明顯的區(qū)別。但是，2 mmol·L-1和20 mmol·L-1Sr2+處理組的蝌蚪的生長受到了顯著的抑制，長度和體重都要低于對照組，且處理濃度越高，蝌蚪生長受抑制的現(xiàn)象越明顯。

表2 不同濃度Sr2+處理30 d后中華大蟾蜍蝌蚪的生長指標(biāo)Table 2 Biometrical data of B. gargarizans tadpoles under different concentrations of Sr2+ treatments for 30 d

2.2 Sr2+處理對中華大蟾蜍蝌蚪紅細(xì)胞DNA損傷的影響

經(jīng)過30 d處理后，每處理組5個平行各隨機(jī)選取7只蝌蚪進(jìn)行DNA損傷等級檢測。由表3可知，隨著Sr2+處理濃度的上升，處于高DNA損傷等級的紅細(xì)胞數(shù)目上升，在20 mmol·L-1Sr2+處理組的蝌蚪分別有4.8%的紅細(xì)胞DNA達(dá)到第3傷害等級，有2.1%的紅細(xì)胞DNA達(dá)到第4傷害等級，而在其他3個組幾乎沒有蝌蚪的紅細(xì)胞DNA達(dá)到第3和第4傷害等級。由圖1所示，0.2 mmol·L-1Sr2+處理組和對照組蝌蚪紅細(xì)胞的DNA損傷指數(shù)沒有顯著差異。但是，2 mmol·L-1和20 mmol·L-1Sr2+處理組的蝌蚪，與對照組相比DI指數(shù)顯著上升，且處理濃度越高，DI指數(shù)越高。

表3 不同濃度Sr2+處理30 d后中華大蟾蜍蝌蚪的紅細(xì)胞DNA損傷等級(%)Table 3 Classes of DNA damage in erythrocytes of B. gargarizans tadpoles under different concentrations of Sr2+ treatments for 30 d (%)

2.3 Sr2+處理對中華大蟾蜍蝌蚪GST、CAT活性和MT含量的影響

蝌蚪肝臟內(nèi)的GST和CAT活性在Sr2+處理下表現(xiàn)出相似的變化規(guī)律(圖2)，即0.2 mmol·L-1Sr2+處理組和對照組沒有顯著差異，但是在2 mmol·L-1和20 mmol·L-1Sr2+處理組的GST和CAT的活性均顯著上升。在0.2 mmol·L-1處理組，GST和CAT的活性分別是對照組的0.98倍和1.01倍；在2 mmol·L-1處理組，GST和CAT的活性分別是對照組的1.49倍和1.13倍；在20 mmol·L-1處理組，GST和CAT的活性分別是對照組的3.90倍和1.74倍。

如圖3所示，處理30 d后，對照組蝌蚪的MT含量為4.26 ng·g-1，0.2 mmol·L-1Sr2+處理組的MT含量為對照組的1.03倍，與對照組沒有顯著差異；2 mmol·L-1Sr2+處理組的MT含量為對照組的1.55倍，較對照組顯著上升；20 mmol·L-1Sr2+處理組的MT含量為對照組的0.74倍，較對照組顯著下降。

圖1 不同濃度Sr2+處理30 d后中華大蟾蜍蝌蚪的紅細(xì)胞DNA損傷指數(shù)Fig. 1 Index of DNA damage in erythrocytes of B. gargarizans tadpoles under different concentrations of Sr2+ treatments for 30 d

圖2 不同濃度Sr2+處理30 d后中華大蟾蜍蝌蚪肝臟的谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)和過氧化氫酶(CAT)活性Fig. 2 The glutathione S-transferase (GST) and catalase (CAT) activity in liver of B. gargarizans tadpoles under different concentrations of Sr2+ treatments for 30 d

圖3 不同濃度Sr2+處理30 d后中華大蟾蜍蝌蚪肝臟的金屬硫蛋白(MT)含量Fig. 3 The metallothionein (MT) content in liver of B. gargarizans tadpoles under different concentrations of Sr2+ treatments for 30 d

3 討論(Discussion)

兩棲動物是動物從水生向陸生的過渡類群，在脊椎動物演化過程中占據(jù)著特殊的地位。兩棲動物的胚胎和幼體發(fā)育都在水體中完成，水體中的污染物會對它們的發(fā)育和變態(tài)產(chǎn)生直接影響[7]。通過試驗發(fā)現(xiàn)，不同濃度的鍶暴露會對中華大蟾蜍蝌蚪的生長發(fā)育產(chǎn)生不同的效應(yīng)。較高濃度的鍶暴露會對蝌蚪肝臟產(chǎn)生毒性效應(yīng)，并抑制其發(fā)育和生長。其可能的作用過程如圖4所示。

圖4 外源Sr2+在蝌蚪體內(nèi)的作用途徑注：ROS表示活性氧。Fig. 4 The action pathway of exogenous Sr2+ in B. gargarizans tadpoleNote: ROS stands for reactive oxygen species.

肝臟是維持動物體內(nèi)重金屬穩(wěn)態(tài)的重要器官，在能量和蛋白代謝方面也有重要作用。而肝臟發(fā)生的代謝紊亂會導(dǎo)致兩棲動物變態(tài)過程的延遲[14]。低濃度的Sr2+暴露條件下，中華大蟾蜍肝臟內(nèi)的GST活性、MT含量和CAT活性較對照組并沒有顯著變化，這表明低濃度Sr2+暴露并沒有引起蝌蚪機(jī)體的毒性反應(yīng)。在此條件下，蝌蚪紅細(xì)胞DNA的損傷情況與對照組相比也沒有顯著差異。另一方面，蝌蚪的發(fā)育和生長指標(biāo)顯示，低濃度的Sr2+處理對蝌蚪的發(fā)育有一定的促進(jìn)作用，這可能是因為低濃度的Sr2+可以促進(jìn)動物細(xì)胞的生長和分裂所致。劉存岐等[15]研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的Sr2+促進(jìn)了中國對蝦(Fenneropenaeuschinensis)糠蝦的成活與變態(tài)。

中等濃度Sr2+暴露條件下，蝌蚪體內(nèi)GST活性和MT含量顯著上升，這表明2 mmol·L-1Sr2+暴露能夠引起蝌蚪機(jī)體明顯的毒性反應(yīng)。Van der Oost等[16]對魚類的研究和Veronez等[11]對牛蛙蝌蚪的研究也有類似的結(jié)果。在動物肝臟內(nèi)，GST能夠?qū)Ω鞣N外源毒害物質(zhì)起到解毒和中和作用，使其更容易溶于水分并排出體外，是動物體內(nèi)重要的防御物質(zhì)[17]。MT在動物受到金屬脅迫時在肝臟中合成，并且與金屬脅迫存在一定的時間、劑量-效應(yīng)關(guān)系。MT作為機(jī)體中毒后誘導(dǎo)產(chǎn)生的解毒蛋白，可以在細(xì)胞內(nèi)與金屬結(jié)合，降低毒害金屬與其他細(xì)胞組織的親和能力，從而起到解毒的作用。動物體的MT含量已被作為水環(huán)境監(jiān)測中重金屬脅迫的重要生態(tài)毒理學(xué)指標(biāo)[18-19]。此外，蝌蚪體內(nèi)CAT活性也有較為顯著的上升，這表明GST和MT的作用并不能完全消除中等濃度Sr2+暴露產(chǎn)生的毒害作用，中等濃度Sr2+暴露在動物體內(nèi)引起了氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生了過量的活性氧(ROS)。已有研究表明，金屬毒性與細(xì)胞的氧化脅迫密切相關(guān)，可導(dǎo)致有機(jī)體脂質(zhì)過氧化水平上升[20-22]。CAT是參與抗氧化防御系統(tǒng)的重要酶，其作用是去除脅迫過程中產(chǎn)生的H2O2，將其代謝為O2和H2O[23]。CAT等活性氧清除酶活性的增加，能保護(hù)動植物細(xì)胞在逆境中細(xì)胞膜和遺傳物質(zhì)不受ROS的破壞。不過彗星分析的結(jié)果表明，在中等濃度的Sr2+暴露條件下，蝌蚪紅細(xì)胞DNA的損傷程度并不嚴(yán)重。但是，蝌蚪的發(fā)育和生長還是受到了顯著的抑制，這可能與Sr2+能夠影響動物體內(nèi)多種生理過程有關(guān)。有研究表明，Sr2+能夠在動物體內(nèi)與Ca2+發(fā)生競爭作用，抑制鈣的吸收[3]和鈣依賴性酶的活性[24-25]，從而使蝌蚪的發(fā)育遲滯。外界條件對蝌蚪變態(tài)發(fā)育的影響會對蝌蚪種群的穩(wěn)定造成嚴(yán)重的后果，變態(tài)是無尾兩棲動物生活史的一個重要環(huán)節(jié)，變態(tài)率的高低直接影響著陸生成體蛙的數(shù)量[26]。環(huán)境中高濃度的鍶有可能導(dǎo)致兩棲動物變態(tài)發(fā)育過程的延長，使其體型減小且運動能力減弱，更容易受到捕食，從而可能成為導(dǎo)致種群數(shù)量下降的重要原因。

高濃度Sr2+暴露條件下，中華大蟾蜍肝臟中的GST活性顯著增加。在Sr2+處理下，CAT也表現(xiàn)出與GST相似的反應(yīng)規(guī)律。然而MT含量甚至要低于對照組，這是因為在較高濃度Sr2+長時間處理下，蝌蚪機(jī)體整體代謝機(jī)能下降，從而使MT合成能力減弱。GST、CAT和MT變化的差異，也表明動物體應(yīng)對金屬毒性時，酶活性調(diào)控和保護(hù)蛋白合成方面有著不同變化規(guī)律。從彗星試驗的結(jié)果看，高濃度的Sr2+暴露誘導(dǎo)中華大蟾蜍蝌蚪紅細(xì)胞DNA損傷的加劇。Zocche等[27]在煤礦區(qū)對史密斯樹蛙(Hypsiboasfaber)蝌蚪紅細(xì)胞DNA損傷的研究也有相似的結(jié)果。這表明，金屬對蝌蚪細(xì)胞DNA的損傷作用可能是一種普遍的現(xiàn)象。而且，隨著Sr2+處理濃度的升高，紅細(xì)胞DNA的損傷水平也上升，這說明，隨著有機(jī)體吸收和富集Sr2+的增加，對細(xì)胞DNA的危害也越大。這也說明，GST、CAT和MT等對金屬毒害的保護(hù)作用有一定的限度。在此條件下，中華大蟾蜍蝌蚪的生長和發(fā)育也受到了強(qiáng)烈的抑制。

綜上所述，低濃度的Sr2+能在一定程度上促進(jìn)中華大蟾蜍蝌蚪的發(fā)育，但是較高濃度的Sr2+暴露對中華大蟾蜍蝌蚪的生長發(fā)育產(chǎn)生遲滯作用、對細(xì)胞DNA產(chǎn)生損害作用，并對細(xì)胞產(chǎn)生氧化脅迫和生理毒害。所以，環(huán)境中大量的鍶元素有可能對水生動物和兩棲動物的生長發(fā)育產(chǎn)生危害，并進(jìn)一步影響其種群數(shù)量。研究結(jié)果可為評估溫泉開發(fā)對水生動物影響以及溫泉產(chǎn)業(yè)發(fā)展的生態(tài)風(fēng)險評價提供參考依據(jù)。

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