蛋白質(zhì)組學在環(huán)境毒理學中的研究進展

耿檸波，任曉倩,2，張海軍,#，曹蓉，宋肖垚，羅云,2，張保琴，陳吉平,*

1. 中國科學院大連化學物理研究所，中國科學院分離分析化學重點實驗室，大連 116023 2. 中國科學院大學，北京 100049

環(huán)境毒理學是利用毒理學方法，研究環(huán)境污染物對人體健康的影響及其機理的學科，環(huán)境毒理學的主要任務是研究環(huán)境污染物對機體造成的損害和作用機理，探索環(huán)境污染物作用于機體后出現(xiàn)的生物學變化，尋找環(huán)境污染物對人體健康損害的早期觀察指標，定量評定有毒環(huán)境污染物對機體的影響?！?1世紀毒理學測試新方法”倡導用毒性通路的理念來闡述毒物的毒性作用[1]。基因組學、蛋白組學和代謝組學作為系統(tǒng)生物學的重要組成部分，其高通量篩選特征和靈敏的檢測能力使其在污染物的毒性通路和作用機制研究上具備很大的優(yōu)勢[2]，已成為環(huán)境毒理學研究必不可少的工具。組學的實驗結果能從細胞和個體乃至物種的整體水平來解釋生命現(xiàn)象的本質(zhì)和規(guī)律，比傳統(tǒng)毒理學研究更具有整體性和系統(tǒng)性。

人類基因組實現(xiàn)了約20 687個蛋白質(zhì)編碼基因的鑒定[3]。然而，僅僅獲取了人類基因組的全部序列依然不能充分全面地闡釋復雜多變的生物過程。蛋白質(zhì)作為基因的產(chǎn)物，是細胞內(nèi)的活性分子。雖然細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和基因之間并不是嚴格的線性關系，但是，蛋白質(zhì)組學作為基因組學的重要補充，可以幫助我們揭示生命活動的本質(zhì)，更好地理解疾病相關的藥物機制。因此，在20世紀90年代，致力于實現(xiàn)對生物體所有蛋白質(zhì)的定性和定量分析的蛋白質(zhì)組學應運而生[4]。蛋白質(zhì)組學是研究細胞或機體內(nèi)所有蛋白質(zhì)的組成及其變化規(guī)律的學科，其最為突出的特點是通過特定的蛋白質(zhì)分離手段并結合高通量分析鑒定技術，有效地研究特定情況下的蛋白質(zhì)表達情況。隨著生物質(zhì)譜技術的不斷發(fā)展，基于質(zhì)譜技術的分析策略已成為蛋白質(zhì)組學研究的核心技術[5]。近年來，基于生物質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學研究已經(jīng)在污染物低劑量暴露、生物標志物發(fā)現(xiàn)以及復合污染研究等領域發(fā)揮了獨特的優(yōu)勢。

1 蛋白質(zhì)組學的研究方法和研究策略(Research methods and strategies of proteomics)

1.1 蛋白質(zhì)組學概述

蛋白質(zhì)組學(proteomics)的定義最早起源于1995年，是Wilkins等[6]根據(jù)“蛋白質(zhì) (protein)”和“基因組學(genomics)”組合提出。蛋白質(zhì)組學以整體、動態(tài)和定量的原則來研究各種蛋白質(zhì)的功能，包含生物體內(nèi)全部蛋白質(zhì)的鑒定與定量，系統(tǒng)地分析生物體內(nèi)蛋白質(zhì)表達、細胞定位、蛋白-蛋白相互作用、翻譯后修飾以及不同時間、空間和細胞類型間的蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)等。與基因組學的研究結果相比，蛋白質(zhì)組學的實驗結果更能從細胞和個體乃至物種的整體水平來解釋生命現(xiàn)象的本質(zhì)和規(guī)律。因此，比基因組學的研究更具有廣度和挑戰(zhàn)性，已經(jīng)成為后基因組時代的重要學科。

1.2 蛋白質(zhì)組學研究方法

傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學研究主要是利用二維凝膠電泳(2D-DIGE)對細胞或組織中的蛋白質(zhì)進行分離[7]，該方法的優(yōu)點是在一次實驗中就能得到上千個蛋白質(zhì)的斑點，可以涵蓋分子量從10 000～300 000 Da的蛋白質(zhì)。但由于對分離得到的蛋白質(zhì)無法進行高靈敏并且快速的鑒定，限制了該技術的進一步發(fā)展；傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)測序主要基于蛋白質(zhì)N端的Edman化學降解實現(xiàn)蛋白質(zhì)和肽段序列的鑒定[8]，相較于基因組學中快速靈敏的自動測序技術，該方法實驗過程繁瑣而且通量很低，嚴重制約著蛋白質(zhì)組學的快速發(fā)展。20世紀80年代末，質(zhì)譜儀器發(fā)生了兩大技術突破，使得蛋白質(zhì)分析發(fā)生了革命性的改變。這2種技術就是軟電離技術：電噴霧離子化(ESI)技術[9]和基質(zhì)輔助激光解吸離子化(MALDI)技術[10]，這2種離子化技術解決了蛋白質(zhì)或者肽段等不易揮發(fā)的生物大分子難以實現(xiàn)高靈敏度離子化的難題，發(fā)明這2種技術的科學家美國的芬恩(John Fenn)和日本的田中耕一(Koichi Tanaka)，也因此被授予了2002年的諾貝爾化學獎，以表彰他們分別在發(fā)展ESI和MALDI技術方面做出的杰出貢獻。這2種軟電離技術與質(zhì)譜技術相結合，在蛋白質(zhì)和多肽分析中展現(xiàn)出了樣品用量少、通量高、操作簡單和鑒定準確等優(yōu)點，已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組學研究的核心技術之一。

質(zhì)譜儀主要包括離子源、質(zhì)量分析器和檢測器3個部分。軟電離技術的出現(xiàn)拓展了質(zhì)譜的應用空間，質(zhì)量分析器的改善推動了質(zhì)譜儀技術的發(fā)展。質(zhì)譜技術用于蛋白質(zhì)組學分析的基本原理是，蛋白質(zhì)和肽段分子離子化后形成分子離子峰，質(zhì)譜儀器準確地檢測其質(zhì)荷比(m/z)以及相應的價態(tài)，得到其分子量信息并進一步結合母離子豐富的多級碎片離子峰，確定蛋白質(zhì)或者肽段的氨基酸序列。目前，MALDI和ESI離子化技術是蛋白質(zhì)組學分析中廣泛使用的2種電離技術[11]。這2種離子化方式可以實現(xiàn)生物分子的高效離子化，而不會破壞其結構，故被稱為“軟”電離技術。MALDI離子化技術，是將待測樣品與基質(zhì)分子形成共結晶薄層，在激光的照射下，樣品分子吸收基質(zhì)的能量和質(zhì)子，快速形成氣態(tài)離子實現(xiàn)離子化。ESI離子化技術則采用高壓電場將分析物溶液形成高電荷密度的微小霧滴，隨著霧滴中溶劑分子的進一步揮發(fā)，實現(xiàn)樣品溶液的離子化，因此，ESI技術可以實現(xiàn)液相色譜儀與質(zhì)譜儀聯(lián)用，用于分析復雜的生物樣品。MALDI-MS技術通常用來分析相對簡單的肽段混合物。

質(zhì)量分析器是質(zhì)譜儀中的核心技術。目前，常用于蛋白質(zhì)組學研究的質(zhì)量分析器主要有4種：離子阱(IT)、飛行時間(TOF)、四極桿(Q)和傅立葉變換離子回旋共振(FT-ICR)[12]。它們的結構和性能各不相同，每一種都有自己的長處與不足[13]。它們可以單獨使用，也可以互相組合形成功能更強大的儀器。其中，離子阱質(zhì)譜靈敏度高，掃描速度快，性能穩(wěn)定，具備多級質(zhì)譜能力，因此，被廣泛應用于蛋白質(zhì)組學研究，其不足之處是質(zhì)量精度較低；FT-ICR也屬于阱類的質(zhì)量分析器，是目前世界上分辨率最高、質(zhì)量準確度最高的質(zhì)譜儀，其腔體內(nèi)部為高真空和高磁場環(huán)境，具有非常高的靈敏度以及動態(tài)檢測范圍，但它異常昂貴的造價與操作的復雜性限制了它在蛋白質(zhì)組學領域的廣泛應用；MALDI通常與TOF質(zhì)量分析器聯(lián)用分析肽段的精確質(zhì)量，而ESI常與離子阱或三級四極桿質(zhì)譜聯(lián)用，通過碰撞誘導解離(CID)獲取肽段的碎片信息。為了實現(xiàn)蛋白質(zhì)及相關多肽的高通量準確鑒定，商品化質(zhì)譜儀采用串聯(lián)或并聯(lián)的模式將多個或多種質(zhì)量分析器進行組合，例如三重四級桿(QQQ)、四級桿-飛行時間聯(lián)用(Q-TOF)、三重四級桿-飛行時間聯(lián)用(QQQ-TOF)和飛行時間聯(lián)用(TOF-TOF)等。一系列基于靜電場軌道阱(Orbitrap)的質(zhì)譜儀、線性離子阱-靜電場軌道離子阱聯(lián)用(LTQ-Orbitrap)和四級桿-靜電場軌道離子阱聯(lián)用(Q Exactive)等[14]，因質(zhì)量分辨率和準確度的大大改善，尤其是儀器尺寸上的減小，運行成本的降低等優(yōu)點，已經(jīng)成為了蛋白質(zhì)組學研究領域廣泛使用的質(zhì)譜儀。

1.3 蛋白質(zhì)組學的研究策略

基于生物質(zhì)譜技術的蛋白質(zhì)組學研究策略主要可以分為2種：自上而下(top-down)和自下而上策略(bottom-up)(圖1)[15]。自上而下的蛋白質(zhì)組學分析技術，不經(jīng)過蛋白質(zhì)酶解的過程，直接對完整蛋白質(zhì)進行質(zhì)譜鑒定。完整蛋白首先通過PAGE或免疫富集法從復雜的生物樣本中分離，然后直接用ESI或MALDI技術生成離子。生成的離子經(jīng)碰撞誘導解離(CID)、高能量碰撞誘導解離(HCD)、電子捕獲解離(ECD)或電子轉(zhuǎn)移解離(ETD)等方式碎裂，并在串聯(lián)質(zhì)譜中分析?！白陨隙隆毖芯坎呗阅芴峁┽槍ν暾鞍踪|(zhì)的更精準、更豐富的生物學信息，而且能夠保留多種翻譯后修飾之間的關聯(lián)信息，所鑒定到的蛋白質(zhì)更接近于其在生物體內(nèi)的真實狀態(tài)[16]，在蛋白鑒定、分析、序列解析及翻譯后修飾表征方面具有潛在的研究優(yōu)勢。但是，該策略還面臨著很多的技術挑戰(zhàn)，包括蛋白質(zhì)混合物的分離困難、離子化效率低、質(zhì)譜碎裂效果差、質(zhì)譜譜圖的數(shù)據(jù)處理困難以及對質(zhì)譜儀器的要求極高等。

圖1 蛋白質(zhì)組學研究的2個主要策略(“自上而下”和“自下而上”)[15]注：MS表示一級質(zhì)譜，MS/MS表示二級質(zhì)譜。Fig. 1 Two major strategies for the proteomics: The “top-down” and “bottom-up” [15]Note: MS stands for primary mass spectrum，MS/MS stands for secondary mass spectrometry.

“自下而上”的策略首先是從生物樣品中高效地提取蛋白質(zhì)，將蛋白質(zhì)進行酶解，然后利用質(zhì)譜進行鑒定分析，最后通過數(shù)據(jù)庫檢索的或者采用從頭測序法對質(zhì)譜譜圖進行解析，從而獲取完整蛋白質(zhì)的信息，是一種間接鑒定的策略。其中，質(zhì)譜對肽段的有效鑒定主要是通過獲得肽段的相對分子質(zhì)量和碎片離子信息來實現(xiàn)。首先，通過一級質(zhì)譜掃描，獲得肽段母離子的質(zhì)荷比，再通過串聯(lián)質(zhì)譜分析，獲得一系列肽段碎片離子信息。二級串聯(lián)質(zhì)譜得到的圖譜能夠為我們提供目標肽段的序列信息和翻譯后的修飾信息。“自下而上”的研究策略分為基于多維液相色譜分離技術平臺的“鳥槍法”蛋白質(zhì)組學(shotgun proteomics)和以特定目標物為分析對象的靶標蛋白質(zhì)組學(target proteomics)[17]。前者的實驗目的是鑒定的蛋白質(zhì)越多越好，而后者僅對一小部分目標肽段進行高質(zhì)量精度、高重復性以及高準確度的定性及定量研究，其中，“鳥槍法”蛋白質(zhì)組學的應用最為廣泛，又被稱為發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)組學(discovery proteomics)。

2 蛋白質(zhì)組學在環(huán)境毒理學研究中的應用(Application of proteomic in environmental toxicology)

環(huán)境毒理學是一門研究外源性環(huán)境污染物毒性作用的學科。其主要任務是描述環(huán)境污染物的毒性作用、闡明毒作用機制以及開展化學物質(zhì)危險度評價等。蛋白質(zhì)組學技術具有高通量的特點，能實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的高效快捷定量分析。將蛋白質(zhì)組學技術和環(huán)境毒理學相結合，可從蛋白水平上研究外源性化合物對機體的毒作用機制，并從中篩選出具有較高特異型和靈敏度的蛋白標志物，目前已廣泛應用于環(huán)境污染物的健康風險評價。

2.1 重金屬毒性機制研究

重金屬通常指對生物體生長發(fā)育有負面影響的有毒金屬，如鎘(Cd)、銅(Cu)、鉻(Cr)、鉛(Pb)、鎳(Ni)、錳(Mn)、鋅(Zn)以及危險金屬如砷(As)、汞(Hg)。重金屬污染已經(jīng)給生態(tài)環(huán)境和人體健康帶來了嚴重威脅，本節(jié)綜述了近年來基于蛋白質(zhì)組學對重金屬在水生生物、動物和植物毒性研究中的應用。短期Cd(100 μg·L-1)暴露對貽貝(Bathymodiolusazoricus)蛋白質(zhì)組的影響較小。采用2D-DIGE分離蛋白，進一步利用MALDI-TOF鑒定出12種差異蛋白，包括結構蛋白、代謝蛋白和應激反應蛋白[18]。而不同蛤(Ruditapesphilippinarum)對Cd暴露的生物學響應也不同，白蛤和斑馬蛤暴露于Cd(200 μg·L-1)后，對其蛋白質(zhì)組學的研究結果表明，白蛤中的差異表達蛋白(DEPs)多于斑馬蛤。Cd暴露共同誘導了2種蛤的一些關鍵生物學過程，包括免疫反應和代謝。白蛤的一些與細胞信號傳導、蛋白質(zhì)水解和能量產(chǎn)生有關的過程得到了增強。相比之下，斑馬蛤的蛋白質(zhì)水解和能量產(chǎn)生的某些過程耗竭，基因表達也出現(xiàn)了紊亂。此外，Cd暴露導致白蛤樣品中過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)活性增加，而斑馬蛤樣品中超氧化物歧化酶(SOD)和CAT活性降低[19]。采用蛋白質(zhì)組學研究了雄性牡蠣(Crassostreaangulata)和雌性牡蠣對鋅暴露的不同反應。在50 μg·L-1或500 μg·L-1Zn中暴露30 d后，雌性牡蠣性腺中的Zn累積量大于雄性牡蠣，雌性牡蠣性腺發(fā)育加快，但雄性牡蠣性腺發(fā)育不正常。雌牡蠣生殖腺中表達的半胱氨酸、組氨酸脫氫酶等具有鋅轉(zhuǎn)運和儲存功能的蛋白和多功能蛋白明顯高于雄牡蠣[20]。以水蚤(Daphniamagna)為模式生物研究了Pb2+和阿特拉津?qū)λ锏挠绊?。通過比較對照和脅迫條件下的蛋白圖譜，發(fā)現(xiàn)Pb2+和阿特拉津?qū)λ榈挠绊憥缀跸喾矗籔b2+抑制了大部分DEPs，而阿特拉津激活了大部分DEPs[21]。

大鼠連續(xù)5周暴露于Mn(200 mg·L-1)后，其總行走距離顯著降低，主要器官組織學結構清晰，無病理學改變。而基于iTRAQ(isobaric tag for relative and absolute quantitation)蛋白質(zhì)組學定量技術對3 012種腸道粘膜細胞Mn含量修飾蛋白進行了定性和定量分析，共發(fā)現(xiàn)175種腸粘膜蛋白在Mn暴露下差異表達。這些蛋白與胰腺分泌、蛋白質(zhì)消化吸收、脂肪消化吸收、氨基酸生物合成、甘油脂代謝、阿爾茨海默病、帕金森病和礦物質(zhì)吸收相關[22]。Hg (HgCl2；0.1、1和5 mg·kg-1·d-1Hg)暴露后，對SD大鼠腎臟組織的蛋白質(zhì)組學分析表明，硒結合蛋白1(SBP1)是Hg給藥后大鼠腎皮質(zhì)中上調(diào)最明顯的蛋白。另外，尿中SBP1的排泄量呈劑量依賴性顯著增加。采用HgCl2、CdCl2或順鉑處理正常腎近端小管細胞24 h，發(fā)現(xiàn)SBP1在化學誘導腎毒性的病理過程中發(fā)揮重要作用，尿中SBP1的排泄可作為早期腎損傷的生物標志物[23]。A549細胞在外源Cd中暴露后，對其蛋白質(zhì)組的研究結果表明，鑒定的53個差異蛋白根據(jù)其生物學過程進行分類，主要涉及代謝過程、細胞過程、發(fā)育過程和細胞成分。根據(jù)蛋白的分子功能進行分類，主要涉及催化活性和結合活性。同時，結果表明，Cd的毒性與必需金屬的替代、金屬貯存蛋白表達的抑制以及金屬主動外排系統(tǒng)的激活有關[24]。對Pb、As和甲基汞(MeHg)混合暴露在海馬細胞蛋白質(zhì)水平上的相互作用進行研究，蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的基因功能和通路分析證實了與線粒體功能障礙、氧化應激、m-RNA剪接和泛素系統(tǒng)功能障礙相關的神經(jīng)退行性改變發(fā)生[25]。重金屬對海馬細胞的影響順序為Pb

蛋白質(zhì)組學研究能夠反映植物應對重金屬污染的調(diào)控過程，展示主要參與細胞解毒和耐受機制的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡和代謝途徑。大豆(GlycinemaxL.)植株分別暴露于Pb(30 μg·L-1)和Hg(0.5 μg·L-1)后，葉片和結節(jié)的氧化應激水平均增加，抗壞血酸過氧化物酶(AsA-POD)、谷胱甘肽還原酶(GR)和CAT的活性也被調(diào)節(jié)。Pb和Hg分別對33種和43種蛋白質(zhì)有顯著影響。差異蛋白在功能上與多種細胞功能相關[29]。紫花苜蓿(Medicagosativa)長期暴露于Cd(10 mg·kg-1)后，179個細胞壁蛋白和30個可溶性部分蛋白的豐度發(fā)生了變化。這些蛋白參與細胞壁重構、防御反應、碳水化合物代謝和促進木質(zhì)化過程[30]。基于蛋白質(zhì)組學研究了菌株Q2-8誘導小麥植株Cd和As吸收減少的分子機制：菌株Q2-8通過提高Cd和As脅迫下根系能量代謝、防御和細胞壁生物合成的效率，減輕Cd和As對小麥幼苗的毒害，降低地上組織Cd和As的吸收。小麥根中差異表達的細胞壁生物合成相關蛋白僅存在于Cd脅迫下小麥植株中[31]。采用蛋白質(zhì)組對土壤中Ni、Cu和Zn對植物(OcimumbasilicumL.)的影響進行研究時發(fā)現(xiàn)，Cu可導致致敏蛋白濃度升高，嚴重的Cu脅迫還會導致與蒸騰和光合作用相關的特定蛋白質(zhì)的積累，并得出Cu對該植株的危害最大、產(chǎn)生的過敏原最多的結論[32]。水稻(OryzasativaL.)幼苗對六價鉻(Cr6+)脅迫的蛋白質(zhì)組學研究結果表明，水稻對Cr6+脅迫的響應具有劑量依賴性和組織特異性。鑒定出的64種蛋白質(zhì)參與一系列的細胞過程，包括細胞壁合成、能量生產(chǎn)、初級代謝、電子傳遞和解毒。細胞壁是水稻抵抗Cr6+脅迫的重要屏障，水稻植株應對Cr6+脅迫的策略包括將Cr離子固定在細胞壁中，減少其易位；激活抗氧化防御，減輕Cr6+誘導的氧化應激[33]。對鎘(Cd2+)、滲透脅迫及其復合脅迫下的短柄草(Brachypodiumdistachyon)幼苗葉片進行了蛋白質(zhì)組學分析，采用2D-DIGE檢測到117個差異蛋白，包括參與光合作用/呼吸、能量和碳代謝、壓力/防御/解毒、蛋白質(zhì)折疊和降解以及氨基酸代謝的蛋白。Cd2+和復合脅迫對葉片蛋白質(zhì)組的影響大于單獨的滲透脅迫[34]。

2.2 有機污染物毒性機制研究

有機污染物種類繁多，且毒性較大，本節(jié)綜述了基于蛋白質(zhì)組學對典型有機污染物的毒理學研究。多環(huán)芳烴(PAHs)是一種高致癌性的污染物，往往在環(huán)境中長期存在。為探討擬南芥(Arabidopsisthaliana)對多環(huán)芳烴中菲的氧化應激反應，采用蛋白質(zhì)組學技術鑒定出30種差異表達蛋白，其中，核苷二磷酸激酶3(NDPK-3)顯著上調(diào)，進一步研究了NDPK-3過表達、敲除和野生型植物中應激反應酶的水平。NDPK-3過表達體中抗壞血酸過氧化物酶(APX)、CAT、POD和SOD活性均高于野生型；在NDPK-3敲除序列中，這些酶的活性降低。這些數(shù)據(jù)證實NDPK-3是擬南芥對PAHs脅迫響應的正向調(diào)節(jié)因子[35]。采用2D-DIGE結合MALDI-TOF/TOF-MS對菲暴露的小麥(TriticumaestivumL.)根蛋白進行分析和鑒定。菲誘導上調(diào)的蛋白與植物的防御反應、抗氧化系統(tǒng)和糖酵解有關；下調(diào)的蛋白質(zhì)涉及高能量化合物的代謝和植物生長[36]。對小麥(TriticumaestivumL.)幼苗進行菲暴露后進行亞細胞觀察，結果表明，葉綠體發(fā)生逆轉(zhuǎn)，失去了結構的完整性。采用iTRAQ分析了葉綠體蛋白質(zhì)譜的變化，共鑒定出517種蛋白，其中，8個與類囊體相關的蛋白被下調(diào)，相關基因的表達通過RT-PCR驗證，證實了類囊體破壞是葉綠體變形的原因[37]。采用鳥槍蛋白質(zhì)組學方法對大西洋鱈魚(Gadusmorhua)的血漿樣品進行了分析，共鑒定了369種蛋白質(zhì)，在暴露于PAHs的魚類中，發(fā)現(xiàn)了12種蛋白水平的顯著變化，11種上調(diào)蛋白主要是免疫球蛋白，表明在暴露的魚體內(nèi)觸發(fā)了免疫反應[38]。綿羊長期飼養(yǎng)在污水污泥施肥的牧場上，檢測肝臟中的PAHs和多氯聯(lián)苯(PCBs)，同時采用二維差分凝膠電泳法對肝臟蛋白進行分離，采用液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法對差異表達的蛋白進行鑒定。發(fā)現(xiàn)環(huán)境化學品暴露影響了外源化合物脫毒反應過程以及雄性和雌性綿羊的肝蛋白組，包括主要的血漿分泌蛋白和代謝酶。通路分析預測了癌癥相關通路的失調(diào)和脂質(zhì)代謝的改變[39]。用5種PAHs(芴、蒽、菲、氟和芘)對蚯蚓(Eiseniafetida)進行暴露，并對<20 kDa的蛋白進行分析，鑒定出54個差異蛋白。其中，3個差異蛋白在暴露于蒽和芘的蚯蚓中表達；一個蛋白選擇性地表達于暴露于芴、菲和熒蒽的蚯蚓中[40]。

蛋白質(zhì)組學為全氟辛烷磺酸(PFOS)毒性效應的分子機制和生物標志物研究提供了方法。斑馬魚胚胎暴露于PFOS(0.5 mg·L-1) 192 h后，采用2D-DIGE進行蛋白質(zhì)組學分析，發(fā)現(xiàn)了69個差異蛋白，進一步采用MALDI-TOF-MS對目標蛋白進行鑒定。這些蛋白的功能包括解毒、能量代謝、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運/類固醇代謝過程、細胞結構、信號轉(zhuǎn)導和凋亡[41]。對歐洲杜父魚(Cottusgobio)進行短期PFOS(0.1 mg·L-1或1 mg·L-1，96 h)暴露，然后采用2D-DIGE和nano-LC-MS/MS相結合的方法，鑒定出的差異表達蛋白包含了應激反應、泛素-蛋白酶體系統(tǒng)、能量代謝和肌動蛋白細胞骨架等功能[42]。歐洲鰻魚(Anguillaanguilla)外周血單核細胞(PBMC)體外暴露于PFOS(10 μg·L-1和1 mg·L-1，48 h)，共鑒定出48個不同功能類群的差異蛋白，涉及細胞骨架、蛋白折疊、細胞信號、蛋白水解途徑、碳水化合物和能量代謝[43]。另一項體內(nèi)暴露研究通過對比利時河流中不同PFOS污染程度的鰻魚(AnguillaanguillaL.)進行蛋白質(zhì)組學分析，用2D-DIGE分離蛋白，進一步利用nano-LC-MS/MS鑒定出17種差異蛋白，且在體內(nèi)和體外實驗中，有3種相同的差異蛋白包括質(zhì)體-2、烯醇化酶和甘油醛3-磷酸脫氫酶，可作為PFOS污染預警的生物標志物[44]。采用胚胎干細胞試驗來評估PFOS發(fā)育毒性(0 μmol·L-1，10 d)，蛋白質(zhì)組學分析共鑒定出176個差異蛋白，大多數(shù)蛋白質(zhì)主要與催化活性、細胞核定位或細胞成分有關。通路分析顯示，32條信號通路受到影響，尤其是代謝相關的信號通路。結果表明，PFOS是一種弱的胚胎毒性化學物質(zhì)，然而，指示發(fā)育毒性的幾個標記蛋白(Brachyury、GATA4、MEF2C和α-actinin)在PFOS暴露組顯著下調(diào)，揭示了PFOS在發(fā)育性心血管系統(tǒng)中的潛在新靶點[45]。iTRAQ標記定量蛋白質(zhì)組技術也被應用于PFOS的毒理學研究。PFOS暴露(1.0、2.5和5.0 mg·kg-1·d-1)7 d后小鼠肝臟的差異蛋白主要參與脂質(zhì)代謝、轉(zhuǎn)運、生物合成過程以及對刺激的反應[46]。人類肝細胞LO2暴露于PFOS(25～50 mg·L-1) 72 h后，蛋白質(zhì)組學的結果表明，PFOS能夠通過抑制HNRNPC、HUWE1、UBQLN1以及誘導PAF1參與p53和原癌基因的信號通路激活從而觸發(fā)凋亡過程[47]。另一個人肝細胞株(HL-7702)暴露于PFOS(50 μmol·L-148 h和96 h)后[48]，差異表達蛋白質(zhì)與細胞增殖有關，包括肝癌衍生生長因子(Hdgf)和增殖標志物Mk167和Top2α。

多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)是一類溴代芳香族化合物，脂溶性較強，易在生物體和人體內(nèi)蓄積。采iTRAQ蛋白質(zhì)組學技術對有PBDEs暴露風險的電子垃圾回收處理廠附近孕婦臍帶組織進行分析，共鑒定出697個差異蛋白，主要參與機體抗氧化防御、細胞凋亡、細胞結構和代謝過程。其中，CAT和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)的表達下調(diào)，細胞色素C的表達下調(diào)，這些結果說明，PBDEs暴露導致的臍帶組織抗氧化失衡和細胞凋亡與新生兒不良出生結局有關[49]。在一項經(jīng)BDE-47暴露的大鼠的研究中，共鑒定出64個差異蛋白，其中，20個差異蛋白與細胞凋亡有關，15個差異蛋白位于線粒體內(nèi)。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，BDE-47誘導了GC1-spg細胞凋亡、線粒體損傷，并且降低了Bcl-2蛋白表達。這些結果說明，BDE-47可能通過損害線粒體功能而誘導細胞凋亡[50]。采用2D-DIGE結合MALDI-TOF-MS對經(jīng)BDE-209和/或BDE-47暴露的神經(jīng)干細胞進行蛋白質(zhì)組學研究，共鑒定出19個差異蛋白可以作為BDE-209和/或BDE-47暴露的潛在生物標志物[51]。采用iTRAQ技術結合MALDI-TOF/TOF-MS對經(jīng)BDE-47暴露的雌性和雄性海洋青鳉(Oryziasmelastigma)性腺蛋白進行研究，在睪丸和卵巢中分別鑒定出133個和144個差異蛋白，并呈現(xiàn)劑量-效應和性別依賴特征。其中，睪丸中鑒定到42個顯著下調(diào)的蛋白可能會破壞精子的產(chǎn)生，進而導致魚類不育；卵巢中鑒定到38種差異蛋白，卵黃蛋白原和載脂蛋白A-1的表達上調(diào)，這表明BDE-47是一種雌激素類似物，可導致魚類的生殖系統(tǒng)損傷[52]。Ji等[53]采用蛋白質(zhì)組學與代謝組學相結合的方法研究了BDE-47暴露對紫貽貝(Mytilusgalloprovincialis)的性別特異性反應，代謝應答響應結果表明，BDE-47主要擾亂雄性紫貽貝鰓的能量代謝；雌性紫貽貝的滲透調(diào)節(jié)和能量代謝均受到了不同程度的擾亂。蛋白質(zhì)組學分析結果表明，BDE-47誘導雌紫貽貝和雄紫貽貝的細胞凋亡和活性氧(ROS)生成減少；擾亂雄紫貽貝的蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，此外也擾亂了雌紫貽貝的蛋白質(zhì)水解。另外，該團隊基于代謝組學和蛋白質(zhì)組學聯(lián)用的方法開展了BDE-47暴露對蚯蚓(Eiseniafetida)毒性效應的研究，結果表明，BDE-47誘導蚯蚓細胞凋亡、氧化應激損傷，擾亂了蛋白質(zhì)的生物合成與能量代謝[54]。

六溴環(huán)十二烷(HBCD)是一種溴代脂環(huán)類化合物，易在生物脂肪組織中富集，并通過生物鏈逐級放大。在一項為期28 d的BALB/c雌性幼鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，HBCD會導致幼鼠肝臟、胸腺和子宮組織發(fā)生病變，降低血清17β雌二醇(17β-E2)含量，增加血清睪酮/雌二醇比例。腦部蛋白質(zhì)組學分析結果表明，HBCD誘導HSPA8、G6PD和SIRT2蛋白表達失調(diào)，這些結果為HBCD降低雌二醇(E2)含量提供了分子機制支持[55]。采用2D-DIGE結合MALDI-TOF/TOF技術分別對甲狀腺機能正常和機能減退的雌性大鼠進行研究，結果表明，HBCD暴露影響雌鼠肝臟功能和甲狀腺激素穩(wěn)態(tài)，同時影響了與糖異生/糖酵解、氨基酸代謝和脂質(zhì)代謝有關的蛋白質(zhì)含量，誘發(fā)了氧化應激反應[56]。在另外一項關于大鼠低劑量短期暴露于HBCD的研究中，采用2D-DIGE對肝臟組織蛋白質(zhì)組進行分析，發(fā)現(xiàn)HBCD暴露引起大鼠肝臟蛋白質(zhì)組的變化具有性別差異，HBCD僅引起雄性大鼠肝臟組織中少量蛋白模式的改變；性別依賴性影響還表現(xiàn)在脂類代謝的差異上，主要原因是HBCD易積累在白色脂肪組織中，而雄性老鼠的脂肪組織含量較雌性老鼠高[57]。Rasinger等[58]評估了膳食暴露于持久性有機污染物是否會影響成年小鼠大腦的基因和蛋白表達，幼年雌性小鼠分別飼喂添加有二惡英類(DL)化合物2,3,7,8-四氯二苯并-p-二惡英(TCDD)、非二惡英類(NDL)化合物HBCD、BDE-47和CB-153的魚食28 d，結果表明，所有暴露組均導致大腦神經(jīng)基因和蛋白表達譜的改變?；虮磉_數(shù)據(jù)相關的生物信息學分析強調(diào)芳香烴受體(AHR)機制在DL化合物毒性效應中的重要性，揭示了TCDD通過AHR靶向調(diào)控腦部鋅穩(wěn)態(tài)，而DL和NDL這2類物質(zhì)均會影響腦部鈣離子穩(wěn)態(tài)。蛋白質(zhì)組學分析數(shù)據(jù)沒有明確區(qū)分DL和NDL的影響差異，所有暴露組小鼠中與興奮毒性相關的蛋白含量都受到顯著影響。多組學綜合分析認為，飲食中的污染物暴露破壞了小鼠血腦屏障，并在小鼠腦部蓄積，從而嚴重擾亂鈣穩(wěn)態(tài)和鋅穩(wěn)態(tài)，誘發(fā)興奮毒性。

2.3 空氣污染的蛋白質(zhì)組學研究

近年來，空氣污染尤其是大氣顆粒物污染備受關注，對人類的生產(chǎn)生活和健康帶來了不利影響。采用蛋白質(zhì)組學對空氣污染的研究也取得了一定的成果。采用人肺癌細胞株A549對鋼鐵工業(yè)環(huán)境中含有高濃度PAHs和金屬的顆粒物暴露并進行了蛋白質(zhì)組學分析，共鑒定出1 576個蛋白，其中，196個蛋白發(fā)生了顯著變化。與氧化還原穩(wěn)態(tài)、代謝和細胞能量生成相關的蛋白受到抑制，而與DNA損傷和修復等脅迫相關的蛋白過度表達，腫瘤相關蛋白C1QBP、EWSR1、CAV1和CAPER的表達增加。推斷抑制細胞代謝和三磷酸腺苷(ATP)生成將損害細胞修復DNA損傷的能力。這可能是顆粒物誘發(fā)癌變的驅(qū)動力[59]。采用基于LC-MS/MS的代謝組學和脂質(zhì)組學以及iTRAQ蛋白質(zhì)組學技術研究PM2.5暴露對人肺癌細胞株A549的毒性效應，代謝組學分析發(fā)現(xiàn)，PM2.5處理后，篩選出56種差異代謝物(40種含量升高，16種含量降低)、22種差異脂類物質(zhì)(19種含量升高，3種含量降低)和81種差異表達蛋白(55種含量上調(diào)，26種含量下調(diào))。蛋白質(zhì)組學分析結果顯示，有16個蛋白與RNA剪接相關，主要是上調(diào)的絲氨酸/精氨酸富集剪接因子1/2(SRSF-1/2)、小核核糖核蛋白70 kDa(snRNP70)、小核核糖核蛋白多肽B/C/E(SNRP-B/C/E)和下調(diào)的異質(zhì)核糖核酸蛋白(hnRNP UL2)。在代謝水平上，PM2.5暴露顯著擾亂了A549細胞神經(jīng)酰胺、絲氨酸、鞘氨醇和鞘磷脂的代謝。神經(jīng)酰胺的累積和RNA剪接的改變可以視為PM2.5毒理學評價的潛在標志物[60]。在另一項研究中，采用2D-DIGE結合MALDI-TOF/TOF對經(jīng)PM2.5暴露的A549細胞的蛋白組進行分析，鑒定出22種差異蛋白。結果表明，氧化應激、代謝紊亂、信號轉(zhuǎn)導失調(diào)、蛋白質(zhì)合成與降解以及細胞骨架破壞是PM2.5誘發(fā)細胞毒性的主要因素[61]。

蛋白質(zhì)也常被篩選出來作為空氣污染的標志物，研究發(fā)現(xiàn)，胎盤組織的蛋白質(zhì)組學特征與孕婦孕期接觸有毒物質(zhì)有關[62]。與對照組相比，生活在城市空氣污染環(huán)境中的母親胎盤中多環(huán)芳烴羥化酶(AHH)活性顯著升高[63]，AHH是多環(huán)芳烴最重要的代謝產(chǎn)物。而另外2種細胞解毒指標GST和7-乙氧基香豆素-O-脫乙基酶(ECOD)與空氣污染水平的關系表現(xiàn)為：ECOD活性隨著環(huán)境空氣污染的增加而顯著增加，而相同條件下GST活性下降[64]。Sorkun等[65]的一項研究發(fā)現(xiàn)，在空氣污染水平較高的地區(qū)，胎盤金屬硫蛋白(MT)的數(shù)量顯著增加，MT是一種重要的金屬固定和轉(zhuǎn)運蛋白，在控制氧化應激過程中起著重要的作用。胎盤蛋白質(zhì)組學的另一個應用是作為篩查細胞能量代謝的指示物。丙酮酸激酶是糖酵解過程中的一種必需酶，在污染較嚴重地區(qū)的婦女胎盤組織中表現(xiàn)出顯著的活性增加[66]。子癇前期妊娠胎盤組織中這種蛋白水平也升高[67]，其特點是胎盤炎癥反應過度，這與產(chǎn)前暴露于空氣污染中的結果相似。由于糖酵解是胎盤能量產(chǎn)生的一個重要途徑，懷孕期間空氣污染對這一關鍵途徑的影響需要給予更多關注。另外，蛋白降解或修飾產(chǎn)物也常作為妊娠期間胎盤損傷的生物標志物。過氧亞硝酸鹽可將酪氨酸蛋白群修飾為3-硝基酪氨酸(3-NTp)，3-NTp是一種氧化應激或亞硝化應激的中間產(chǎn)物?；谌巳旱囊豁椦芯堪l(fā)現(xiàn)，胎盤3-NTp水平與PM2.5和黑炭暴露正相關[68]。這一結果也在動物實驗中得到驗證，大鼠暴露于柴油尾氣污染的空氣中胎盤3-NTp水平升高[69]。

3 總結與展望(Summary and prospects)

近年來，蛋白質(zhì)組學技術飛速發(fā)展，為環(huán)境毒理學研究提供了新的思路和強有力的技術支持。蛋白質(zhì)組學技術高通量、高靈敏度的分析特征在生物標志物發(fā)現(xiàn)、環(huán)境污染物低劑量暴露和復合污染研究等領域發(fā)揮了獨特的優(yōu)勢。近年來，蛋白質(zhì)組學高效樣品預處理技術，高準確度、高覆蓋的定性與定量技術和數(shù)據(jù)解析技術的發(fā)展拓寬了蛋白質(zhì)組分析的應用面，將這些新技術與新方法引入毒理學研究，將有助于全景式地揭示機體暴露于污染物的蛋白質(zhì)組調(diào)控規(guī)律。另外，目前，將蛋白質(zhì)組學應用于環(huán)境毒理學研究后，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些重要蛋白標志物，但是從標志物到作用機理還未發(fā)現(xiàn)確切的關聯(lián)。毒性作用通路是一個復雜的網(wǎng)絡，暴露于外源化學物是如何破壞這些路徑并最終導致了負的健康效應，基因、蛋白和小分子代謝物相結合才能為毒理學評估提供綜合視角，系統(tǒng)揭示污染物的毒性作用機制。因此，蛋白組學與基因組學和代謝組學相結合，將會成為毒理學發(fā)展的必然趨勢。

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