抗生素的脅迫與抗生素抗性基因產生與傳播關系的研究

盧文強，孫昊宇，王雅娟，林志芬，張飲江,*

1. 上海海洋大學海洋生態與環境學院，上海 201306 2. 同濟大學環境科學與工程學院，污染控制與資源化研究國家重點實驗室，上海 200092

抗生素作為一類可抑制微生物生長和繁殖，甚至殺死微生物的自然產生、部分合成或全合成的化合物，現已廣泛應用在醫療衛生與畜牧養殖業中，用于治療或預防細菌感染以及促進畜牧業的增長等[1]。然而，抗生素的過度使用，導致水體[2-3]、土壤[4]和空氣[5]中殘留的抗生素不斷累積，不僅對生物體有潛在的毒性作用，更嚴重的是導致環境中抗生素抗性基因(antibiotics resistance genes, ARGs)的增加[6]。ARGs能夠降低抗生素對細菌感染的治療潛力，致使細菌感染的人和動物的死亡率上升[7-8]。目前，ARGs已被公認為新興和持久的環境污染物，如果ARGs持續累積得不到有效控制，到2050年每年可能導致1千萬人死于ARGs污染[9]。因此，研究ARGs污染來源，深入探究ARGs污染機理，對采取更為有效的防治措施至關重要。

目前，有研究表明，抗生素是ARGs污染的主要驅動力[10]。例如，Zhao等[11]發現在活性污泥反應器中抗生素與相應的ARGs豐度相關。Zhang等[12]研究發現，我國溫榆河及其支流耐藥大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)的數量與殘留抗生素水平呈正相關關系。Rodriguez-Mozaz等[13]調查了醫院和城市廢水中殘留抗生素和ARGs的發生情況，發現檢測到的殘留抗生素與ARGs呈顯著正相關。然而，與此相反，還有一些研究表明，環境中殘留的抗生素與ARGs的污染無關。例如，在美國東北部一個未經處理的混合糞肥坑中，研究者發現，四環素抗性基因(tetO)的濃度與四環素濃度無關[14]。此外，Jia等[15]研究了巴河中殘留抗生素與ARGs的相關性，研究表明，殘留的抗生素與它們相應的ARGs無明顯相關性。因此，ARGs污染與抗生素關系究竟如何，還需要進一步探究。

眾所周知，ARGs污染源于ARGs的產生和傳播。ARGs的產生主要來源于抗生素誘導的細菌基因突變，在細菌增殖過程中，親代細胞中的ARGs可遺傳給子代細胞[16]。而ARGs在細菌之間的傳播主要由水平基因轉移引起。水平基因轉移是遺傳物質通過可移動的遺傳因子(質粒、轉座子和整合子等)在種內或種間的轉移，包括接合，轉化和轉導[17]。然而，轉化和轉導這2種轉移方式因發生的條件較為苛刻，發生轉化的條件是細菌需建立感受態，在自然環境中不是所用的細菌都能建立感受態，并且，細菌建立感受態的條件較為苛刻，所以轉化在自然環境中發生頻率較少，例如，E.coli被認為在自然條件下無法建立感受態，然而，在低溫下，用鈣離子處理時可以建立感受態[18-19]；轉導是病毒介導的細胞間進行遺傳轉移，噬菌體轉導不需要裸露的DNA，而是噬菌體介導了兩宿主之間的DNA重組，所以，轉導發生頻率低[18,20]；接合在環境中較容易發生，既可以在細菌之間發生，也可以在細菌與介質之間發生，其也就成為環境中細菌水平基因轉移主要方式[21]。因此，研究抗生素對ARGs突變和接合轉移的影響可能是探討ARGs污染與抗生素關系的重要途徑。

磺胺類藥物(SAs)作為一種人工抗生素已被廣泛應用于藥物治療和飼料添加[22]。近10年來，我國主要河流和海域的水和沉積物中檢出的近百種抗生素中，磺胺類抗生素是檢出率最高的抗生素之一[9]。在本研究中，選擇了SAs作為代表性的測試化合物，探討了在實驗室條件下ARG的產生與傳播與抗生素脅迫之間的關系，并且用SAs對E.coli生長的毒性作用表征SAs對E.coli的脅迫，用ARGs的突變和接合轉移表征ARGs的產生和傳播。探討ARGs的產生和傳播與抗生素脅迫之間的關系，并分析影響抗生素脅迫與ARGs產生和傳播關系的環境因素等，為研究ARGs污染與抗生素的關系提供新的思路，對ARGs污染防治措施提供一定的理論支撐和依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 化學品與受試生物

實驗用的E.coliMG1655購自北京譜如汀生物技術有限公司。在質粒接合轉移實驗中，含有RP4質粒(能夠編碼bla、aphA、tetA和tetR基因)的E.coli(RP4)被設定為供體菌(耐卡那霉素、氨芐青霉素和四環素)，而能夠耐萘啶酮酸的E.coli(Nal)被設定為受體菌。

實驗用的磺胺類化合物購于Sigma-Aldrich化學制品有限公司(上海)，純度均≥99%，試劑信息如表1所示。用二甲基亞砜(DMSO)改善SAs在樣品中的溶解度，并且DMSO在樣品中的濃度<0.1%。

表1 實驗用化合物性質Table 1 Characteristics of the test chemicals

1.2 培養基

LB培養基：取10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物和10 g NaCl于燒杯中，加入一定量的蒸餾水進行水浴加熱，至成分完全溶解后冷卻，用蒸餾水定容至1 L，最后將培養基的pH調整至7.1±0.1。之后將培養基分裝、滅菌，于4 ℃下保存備用。

MH培養基：取2 g牛肉浸粉、17.5 g酸水解酪蛋白和1.5 g水溶性淀粉于燒杯中，加入一定量的蒸餾水進行水浴加熱，至成分完全溶解后冷卻，用蒸餾水定容至1 L，最后將培養基的pH調整至7.2～7.4。之后將培養基分裝、滅菌，于4 ℃下保存備用。

1.3 毒性實驗

首先，在透明96孔板中加入80 μL的SAs(作為實驗組)或質量分數為1%的NaCl溶液(作為對照組)，80 μL的0.4倍MH培養基(0.4倍為總體積的最終倍數)和40 μL準備好的細菌(約為1×104cells·mL-1)，在37 ℃、180 r·min-1培養22 h，所有毒性試驗均為一式3份。在酶標儀(Multiskan GO，美國賽默飛世爾科技公司)上測定實驗組和對照組的OD600值，毒性結果計算如式(1)所示：

(1)

式中：Inhibition表示SAs對細菌生長的抑制率(%)；ODt和ODc分別表示實驗組和對照組的OD600值。使用Weibull函數(Origin8.6)擬合數據。

1.4 突變實驗

突變實驗的培養條件與毒性試驗相同。在37 ℃培養22 h后，收集平行孔中的菌液，將收集的菌液一部分稀釋106倍，剩余的部分濃縮3倍。稀釋后的菌液在不含有任何抗生素的LB培養基平板上進行培養，對照組和實驗組皆為5組平行。計算總菌數(CFU·mL-1)，濃縮的菌液充分混勻后在含有25 mg·L-1利福平的LB培養基平板上進行利福平抗性突變體的篩選，計算突變體個數(CFU·mL-1)。

突變次數使用MM法(MSS maximum likelihood)計算[23]。根據式(2)和(3)計算突變頻率和變頻率促進率：

(2)

(3)

式中：M為暴露于SAs的細菌突變頻率；m為突變體個數(CFU·mL-1)；Nt表示培養物中活細胞的總數(CFU·mL-1)；Promotion1表示突變頻率促進率(%)；Mt和Mc分別代表實驗組和對照組的突變頻率。最后，利用Hormesis模型(Origin8.6)對突變數據進行擬合。

1.5 接合轉移實驗

將E.coli(RP4)菌液和E.coli(Nal)菌液按1∶2的比例混合20 min。接合轉移體系的總體積是200 μL，包括40 μL SAs溶液(實驗組)或質量分數為1%的NaCl溶液(對照組)，60 μL混合菌液和100 μL 2倍LB培養基，充分搖勻在37 ℃下培養8 h，對照組和實驗組皆有3組平行。然后用質量分數為1%的NaCl溶液適當稀釋混合菌液并搖勻，分別在受體菌篩選平板(含有40 mg·L-1萘啶酮酸)和接合子篩選平板(含有40 mg·L-1萘啶酮酸和40 mg·L-1卡那霉素)傾注，于37 ℃下倒置培養12 h后計算受體菌數(CFU·mL-1)和接合子數(CFU·mL-1)。根據式(4)和式(5)計算接合轉移頻率和接合轉移頻率促進率：

(4)

(5)

式中：T為接合轉移頻率；Nc是接合子數(CFU·mL-1)；Nr為受體菌數(CFU·mL-1)；Promition2為接合轉移頻率促進率(%)；Tt和Tc分別為實驗組和對照組的接合轉移頻率。最后，利用Hormesis模型(Origin8.6)擬合接合轉移數據。

1.6 數據分析

采用SPSS18.0軟件進行線性回歸分析，通過相關系數(r2)、標準誤差(SE)、Fisher統計(F)和顯著性水平(P)來評價。

2 結果與討論(Results and discussion)

2.1 SAs對E. coli生長的毒性作用

如圖1(a)所示，SAs對E.coli生長毒性劑量-效應曲線呈現典型的S型，說明SAs對E.coli生長的抑制率隨著SAs濃度的增加而逐漸增大。根據毒性劑量-效應曲線，計算了SAs對E.coli生長的半數抑制濃度(EC50)(表1)。SAs的EC50順序為：SPY

圖1 磺胺類藥物(SAs)對E. coli的生長毒性劑量-效應曲線注：(a)毒性；(b)突變頻率；(c)接合轉移頻率。Fig. 1 The concentration-response curves for sulfonamides (SAs) effect on E. coli growthNote: (a) the growth; (b) the mutation frequency; (c) the conjugative transfer frequency.

為了探究SAs脅迫與ARGs在E.coli中產生和傳播的關系，根據毒性劑量-效應曲線選擇了典型的毒性參數，包括無觀察效應濃度(NOEC)，EC50和抑制率80%的化合物濃度(EC80)。NOEC、EC50和EC80的對數值如表2所示。

表2 SAs對E. coli生長、突變和接合轉移作用的典型參數值Table 2 The typical concentration values of SAs to the growth, mutation, and the conjugative transfer of E. coli

2.2 SAs對E. coli突變頻率的影響

如圖1(b)所示，SAs促進E.coli突變頻率的劑量-效應曲線呈倒U型，表明SAs對E.coli突變頻率的促進率隨SAs濃度的增加先升高后降低。最大促進率的順序為SMZ(83.58%)

根據SAs促進E.coli突變頻率的劑量-效應曲線，本研究選取了典型的突變參數，包括促進率為1%時最低可觀測突變促進效應濃度(MC0-1)、促進率為50%時突變促進效應濃度(MC50)和促進率最大時突變促進效應濃度(MCmax)，并且MC0-1、MC50和MCmax的對數值如表2所示。

2.3 SAs對E. coli接合轉移頻率的影響

由圖1(c)可知，SAs促進E.coli接合轉移頻率的劑量-效應曲線呈現典型的倒J型。隨著SAs濃度的增加，接合轉移促進率的提升先增大后減小。最大促進率的順序為SMZ(29.18%)

圖2 SAs對E. coli的作用機理注：(a)抑制生長；(b)促進突變頻率；(c)促進接合轉移頻率；PABA表示對氨基苯甲酸，DHPS表示二氫蝶酸合成酶，DHFR表示二氫葉酸還原酶，DHFA表示二氫葉酸，THFA表示四氫葉酸。Fig. 2 The mechanistic hypothesis for SAs effect on E. coliNote: (a) the growth inhibition; (b) the promotion of the mutation frequency; (c) the promotion of the conjugative transfer frequency; PABA stands for para-aminobenzoic acid; DHPS stands for dihydropteroate synthase; DHFR stands for dihydrofolate reductase; DHFA stands for dihydrofolic acid; THFA stands for tetrahydrofolic acid.

典型的接合轉移參數包括促進率為1%時最低可觀測接合轉移促進效應濃度(RC0-1)、促進率最大時接合轉移促進效應濃度(RCmax)和促進率為1%時最高可觀測接合轉移促進效應濃度(RC0-2)，RC0-1、RCmax和RC0-2的對數值如表2所示。

2.4 SAs的脅迫與ARGs在E. coli中產生和傳播的關系2.4.1 SAs的脅迫與E. coli中ARGs突變頻率的關系

通過毒性參數(NOEC、EC50和EC80)與突變參數(MC0-1、MC50和MCmax)的線性回歸，探討SAs脅迫與E.coli突變頻率之間的關系，回歸方程如式(6)～(14)。

logMC0-1=0.391logNOEC-3.369

n=5,r2= 0.437, SE=0.174,F=2.327,P=0.225 (6)

logMC50=0.152logNOEC-4.755

n=5,r2=0.351, SE=0.081,F=1.624,P=0.292 (7)

logMCmax=0.109logNOEC-4.767

n=5,r2=0.050, SE=0.185,F=0.159,P=0.717 (8)

logM0-1=0.346logEC50-3.886

n=5,r2=0.529, SE=0.158,F=3.367,P=0.164 (9)

logMC50=0.156logEC50-4.820

n=5,r2=0.577, SE=0.065,F=4.094,P=0.136 (10)

logMCmax=0.045logEC50-5.221

n=5,r2=0.014, SE=0.188,F=0.041,P=0.852 (11)

logM0-1=0.313logEC80-4.180

n=5,r2=0.635, SE=0.139,F=5.214,P=0.107 (12)

logMC50=0.125logEC80-5.047

n=5,r2=0.544, SE=0.068,F=3.578,P=0.115 (13)

logMCmax=0.027logEC80-5.344

n=5,r2=0.027, SE=0.189,F=0.021,P=0.895 (14)

根據以上的回歸結果可知，EC80與MC0-1回歸的r2為0.64，是這些方程中最高的，說明EC80與MC0-1的相關性更好。結合圖2(a)和圖2(b)，分析EC80與MC0-1之間相關的可能機理如下(圖3)：較高的SAs脅迫作用可能會導致THFA的合成大大減少，從而限制了核苷酸堿基的產生；同時，堿基對錯配的概率可能由于核苷酸堿基的減少而大大增加，最終導致E.coli突變頻率的提高[29]。此外，任何細菌在接近抗生素最低抑菌濃度(MIC)時，可以獲得突變的最大選擇壓力，這說明突變在高壓力下發生得更多[16]。此外，大多數細菌的染色體中都含有豐富的毒素-抗毒素(TA)系統[37]。在低SAs脅迫下，TA系統可能為細菌種群提供耐受性，并保護細菌免受基因突變的影響[38]。因此，只有當SAs對E.coli施加更大的壓力時，SAs才可能導致E.coli突變頻率促進率增加。

2.4.2 SAs的脅迫與E.coli中ARGs接合轉移頻率的關系

通過毒性參數(NOEC、EC50和EC80)與接合轉移參數(RC0-1、RCmax和RC0-2)的線性回歸，探討SAs脅迫與E.coli接合轉移頻率之間的關系，回歸方程如式(15)～(23)。

logRC0-1=- 1.052logNOEC-16.240

n=5,r2=0.532, SE=0.386,F= 3.410,P=0.162 (15)

logRCmax=-0.732logNOEC-12.319

n=5,r2=0.115, SE=0.793,F=0.391,P=0.576 (16)

logRC0-2=-0.967logNOEC-11.949

n=5,r2=0.276, SE=0.612,F=1.146,P=0.363 (17)

logRC0-1=- 0.621logEC50-12.953

n=5,r2=0.286, SE=0.476,F=1.204,P=0.353 (18)

logRCmax=-0.179logEC50-8.486

n=5,r2= 0.011, SE=0.839,F=0.032,P=0.869 (19)

logRC0-2=-0.428logEC50-8.058

n=5,r2=0.084, SE=0.689,F=0.275,P=0.636 (20)

logRC0-1=- 0.448logEC80- 11.761

n=5,r2=0.218, SE=0.499,F=0.837,P=0.428 (21)

logRCmax=-0.023logEC80-7.525

n=5,r2=0.000, SE=0.843,F=0.001,P=0.980 (22)

logRC0-2=-0.260logEC80-6.949

n=5,r2=0.045, SE= 0.703,F=0.142,P=0.731 (23)

由以上回歸方程可知，NOEC與RC0-1回歸的r2值最高，為0.53，說明NOEC與RC0-1的相關性較好。根據圖2(a)和圖2(c)，分析了NOEC與RC0-1之間的密切關系如下(圖3)：在低SAs脅迫下，THFA合成受阻可能導致DNA損傷，從而觸發細胞SOS反應，最終促進RP4質粒的接合轉移[39]。此外，umuDC操縱子被認為是維持SOS應答的關鍵因素，高SAs脅迫可能導致umuD蛋白和umuC的損傷，從而抑制SOS反應[39]。因此，只有當SAs對E.coli施加較低的壓力時，才會導致其對接合轉移頻率的提升率增加。

圖3 SAs脅迫與突變和接合轉移的關系Fig. 3 The relationship of mutation and conjugative transfer with the SAs stress

2.5 影響抗生素脅迫與ARGs產生和傳播關系的因素

綜上所述，本研究認為ARGs的產生和傳播可能受到不同水平的抗生素脅迫的調控(圖3)：當高濃度抗生素脅迫引起突變頻率的初始提升時，低濃度抗生素脅迫引起接合轉移頻率的初始提升。然而，正如引言中提到的，一些研究人員對ARGs和抗生素之間的關系得出了不同的結論。環境中ARGs與抗生素濃度之間關系的不一致性可能是由2個因素造成的：

(1)不同的抗生素濃度。不同的環境條件下，抗生素濃度可能有很大的差異，這導致抗生素對細菌的脅迫大小不同，從而導致環境中ARGs的產生和傳播存在差異。

(2)在環境中可能的影響因素。在實際環境中，有許多因素影響抗生素脅迫與ARGs的產生和傳播的關系：①真實環境中存在許多抗生素外的其他種類的化合物可以影響ARGs的產生和傳播。例如，重金屬的亞抑制濃度，包括Cu(Ⅱ)、Ag(Ⅰ)、Cr(Ⅵ)和Zn(Ⅱ)都可以促進ARGs的產生和傳播[34]。②傳播介質的不同可能導致ARGs的傳播發生變化。例如，SMX促進的pB10質粒在活性污泥中的傳播速率遠遠高于其促進pB10質粒在細菌之間的傳播速率[40]。此外，還有研究表明，低溫和高鹽度會阻礙ARGs的產生和傳播[15]。③不同菌種ARGs的產生和傳播可能相互干擾。例如，有研究發現，來自其他細菌物種的水平基因轉移也會增加E.coli對抗生素的耐藥性[41]。

本研究發現，ARGs產生與傳播和抗生素脅迫之間是密切相關的。然而，在真實環境中也存在許多其他因素影響ARGs產生與傳播，例如，其他種類化合物、環境介質以及細菌種類等。因此，建議在探究ARGs產生與傳播時，應考慮這些影響因素和抗生素脅迫的綜合作用。本研究為研究抗生素脅迫下ARGs的產生和傳播提供了新的思路，為尋找ARGs污染的防治方法提供了一定的指導。

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