利用室內微宇宙系統研究三唑酮對淡水浮游動物群落的影響

孫健，肖鵬飛，劉毅華，尹曉輝，朱國念

1. 浙江農林大學，杭州 311300 2. 浙江農林大學暨陽學院，諸暨 311800 3. 中國林科院亞熱帶林業研究所，富陽 311400 4. 浙江大學農藥與環境毒理研究所，杭州 310029

三唑酮(triadimefon)是一種甾醇合成抑制劑，因其廣譜性的殺菌作用，可用于防治水稻銹病[1]。在我國，三唑酮在農田中被廣泛使用。施用方式的原因導致三唑酮利用率不高，最終在環境中存在殘留。根據中華人民共和國環境保護部2008年發布的《雜環類農藥工業水污染物排放標準》，三唑酮原藥生產企業廢水處理設施總排放口的排放標準為5 000 μg·L-1。如果按照國家標準的臨界值濃度排放含有三唑酮的工業廢水，三唑酮有可能在環境中表現出短期高濃度暴露[2]。付巖[3]在農藥使用期間檢測到稻田溝渠水中三唑酮的殘留濃度為12 μg·L-1，稻田附近池塘檢測到三唑酮濃度達到0.4 μg·L-1。三唑酮的用途廣泛，在國外，三唑酮可用于草坪防治灰斑病，Vincelli[4]模擬了高爾夫球場草地施用三唑酮后，檢測周圍地表水中農藥的殘留情況，結果表明，水中三唑酮含量峰值可高達300 μg·L-1。除了三唑酮在施用地點的環境濃度有報道外，在江河湖口也有三唑酮檢出。游明華[5]在九龍江江口豐水期時檢測到三唑酮含量達0.173 μg·L-1，劉娜等[6]在2014—2017年于太湖流域飲用水源地檢測出三唑酮，濃度為0.002 μg·L-1。

三唑酮可以通過抑制細胞色素P-450酶系，以抑制麥角甾醇合成，使新生真菌細胞壁畸形，達到抑菌效果[7]。P-450酶系參與生物體多種內分泌生物通路，因此，三唑酮可能會對水生動物造成影響，這個影響可能是由于甾醇合成受抑制而導致生物內分泌紊亂[8]，進而對脊椎動物和無脊椎動物產生致畸作用。劉少穎[9]發現在實驗室條件下三唑酮濃度達到2 000 μg·L-1和4 000 μg·L-1時，斑馬魚胚胎出現畸形。三唑酮進入水體后可在非洲爪蟾體內累積，干預神經嵴細胞的遷移，致使爪蟾胚胎鰓弓畸變[10]。Kenneke等[11]的21 d慢性毒性研究表明，當三唑酮濃度>50 μg·L-1時可導致大型溞幼溞蛻皮頻率降低。有研究表明，三唑酮可以推遲大型溞的蛻皮時間，并對子代眼部造成畸形[12]。三唑酮可以抑制生物發育，進而導致生物種群增長受抑制。胡芳華等[13]的研究表明，三唑酮的濃度達到160 μg·L-1時，三唑酮可以影響母溞的產溞數量，并抑制幼溞的體長。

水環境中往往含有多種農藥，三唑酮可以和其他殺蟲劑產生協同增效毒性作用。Cedergreen和Streibig[14]的研究表明，很多殺蟲劑和殺菌劑的組合存在明顯的協同增效作用，其中，大約96%屬于唑類殺菌劑(包括咪唑、吡唑和三唑類)和神經毒劑殺蟲劑的組合。Bjergager等[15]通過聯合使用咪酰胺和高效氯氰菊酯，發現該協同增效作用在浮游動物群落水平上同樣存在。淡水浮游動物在水生態系統中起著承上啟下的作用，受到影響后會影響其他水生動物。

因此，研究三唑酮在水環境中的生態毒性十分必要。目前，三唑酮的研究主要是其對動物個體的影響，對動物的群落效應研究不多。本文利用標準微宇宙進行試驗，評定三唑酮對淡水浮游動物種群的生態風險。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 微宇宙試驗系統構建

室內微宇宙系統在投藥前14 d(記為-14 d)開始裝配，依次加入4種淡水藻類(購自中國科學院水生生物研究所)和8種浮游動物(由浙江大學農藥與生態毒理研究所提供)，生物種類及數量如表1所示。微宇宙系統靜置孵育4 d后投放農藥，投藥當日記為0 d。微宇宙系統構建工作流程圖如圖1所示。整個實驗周期，微宇宙系統安置于大型水浴裝置上(圖3(a))。自-14～0 d，為微宇宙系統構建平衡期，保持溫度24～26 ℃，光強度3 000 lux，光周期L∶D = 14 h∶10 h。自0 d起，每隔7 d向系統補充藻類(1×103cells·mL-1，1 mL)和浮游動物(輪蟲儲備液1 mL，甲殼綱生物5個成體)。

圖1 微宇宙系統構建工作流程圖注：(a)水生微宇宙系統；(b)大型控溫水浴設備。Fig. 1 Aquatic microcosm system internal structure and establishment flowsheetNote: (a) Aquatic microcosm system; (b) thermostat water bath equipment.

1.2 受試化學品、濃度設置及其檢測方式

受試化學品為三唑酮原藥(純度98.5%，由江蘇劍牌股份有限公司提供)。試驗設置6個濃度，依次為0 μg·L-1(ds0)、156 μg·L-1(ds1)、315 μg·L-1(ds2)、625 μg·L-1(ds3)、1 250 μg·L-1(ds4)和2 500 μg·L-1(ds5)，每個暴露濃度重復3次。在投藥后2 h采集所有處理組的水樣，在投藥后1、3、5、7、10、14、21、28和35 d采集最高濃度處理組的水樣，檢測三唑酮在水中的殘留量。

所有水樣通過有機溶劑萃取，采用氣相色譜法檢測其濃度，色譜條件為：Agilent 6 890氣相色譜儀，HP-5色譜柱，ECD檢測器，進樣口溫度240 ℃，檢測器溫度250 ℃，柱溫初始溫度70 ℃，進樣體積1 μL，載氣為高純氮(99.999%)，恒壓180 kPa，梯度升溫程序為柱溫70 ℃保持2 min，15 ℃·min-1升至190 ℃保持1 min，5 ℃·min-1升至240 ℃。進樣模式為不分流進樣。在此檢測條件下，三唑酮的保留時間為9.4 min(圖2)。三唑酮的回收率為93.6% (SD=0.1)。

圖2 三唑酮檢測的氣相色譜圖Fig. 2 Gas chromatography of triadimefon

1.3 水質理化參數測定

水質理化指標包括酸堿度(pH)、電導率(EC)、溶解氧濃度(DO)和可溶性有機碳濃度(DOC)。酸堿度和電導率的測定均在每次生物樣品采集前進行。為排除采集水樣對溶解氧濃度的干擾，溶解氧濃度測定在水樣采集前一日完成(即試驗進行的第1、6、13、20、27和34天)，測定2次，分別在光周期開始前(在8:00—9:00內完成)，定義為系統中溶解氧濃度最低值(DOd)；暗周期開始前(在22:00—23:00內完成)，定義為系統中溶解氧濃度最高值(DOL)。計算得到每日溶氧消耗量(DOδ= DOL-DOd)。溶氧消耗量可以間接表征微宇宙系統整體的代謝情況。可溶性有機碳樣品采集與生物樣品采集同時進行，采集50 mL水樣經過0.4 μm水性濾膜過濾，使用CN200TOC-VCPH FA有機碳測定儀檢測水樣中有機碳濃度。

表1 構建標準化微宇宙的浮游動物及淡水藻類種類來源Table 1 Freshwater algae source and zooplankton for standardized microcosm

1.4 生物樣品采集與檢測

在0 d投藥前以及投藥后7、14、21、28和35 d采集上覆水，采用0.5 L深水采樣器(圖3(c))采集上覆水樣品。分3次采集水樣，共采集1.5 L上覆水，混勻后保留0.5 L分樣品用于浮游生物鏡檢。向樣品中滴加2 mL魯哥氏液(Lugol’s solution)固定染色，靜置48 h后用虹吸管(管頭包有孔徑為25 μm絹紗)排去上清液，濃縮至20 mL左右，用10%甲醛溶液定容至30 mL。濃縮樣品裝入棕色塑料樣品瓶，4 ℃冷藏待鏡檢。體視鏡下采用5 mL和0.1 mL生物技術框(圖3(b))鏡檢計數浮游動物。

圖3 自制的微宇宙系統設備注：(a)大型控溫水浴設備；(b)浮游生物計數板；(c)深水采樣器。Fig. 3 Microcosmic test equipmentNote: (a) thermostat water bath equipment; (b) plankton counting chamber; (c) water sampler.

1.5 數據分析

使用SPSS 22.0對水質參數、浮游動物數據進行描述性統計分析。對浮游動物群落結構變化采用Canoco?5.0軟件分析，分析內容包括(1)對微宇宙系統內的浮游動物組成進行主成分分析PCA[16-18]，獲得浮游動物在微宇宙內的第一排序軸取值(CaseRZ.)；(2)對0～35 d內浮游動物豐度的變化進行主效應曲線分析PRC[19-22]，并進行蒙特卡洛置換檢驗(Monte Carlo permutation test)，隨機置換599次，置信限為95%，以驗證標準化微宇宙中浮游動物隨時間變化的顯著性。浮游動物種群的最大無作用劑量(NOECspecies)的計算方法為通過方差分析得到與對照組差異不顯著的最大濃度；浮游動物群落的最大無作用劑量(NOECcommunity)的計算方法為：按照PCA分析得到2個獨立的統計變量CaseR1.和CaseR2.，將三唑酮濃度和取樣時間設為自變量，各處理組及不同采樣日樣品的CaseR1.和CaseR2.設為因變量，取每個取樣樣品與對照組在95%置信限水平下無顯著性差異的最高濃度。

2 結果(Results)

2.1 三唑酮在水體中的濃度變化

投藥后2 h水中三唑酮濃度的分析結果顯示，三唑酮實際暴露濃度為名義濃度的65.3%～86.1%(表2)。最高濃度處理組的三唑酮消解動態結果如圖4所示。三唑酮的消解動力學方程為cDT= 2705.5e-0.12t，cDT為時間為t時的三唑酮濃度，t為時間，R2= 0.9782，半衰期DT1/2為8.28 d。

表2 三唑酮處理組的理論和實際濃度Table 2 Nominal and actual concentrations of triadimefon treatment

圖4 三唑酮在標準化微宇宙上覆水中的消解動力學曲線注：cDT為時間為t時的三唑酮濃度，t為時間。Fig. 4 Kinetics curve of triadimefon in standardized aquatic microcosm overlying waterNote: When the time is t, the concentration of triadimefon is cDT.

2.2 三唑酮對水質參數的影響

在試驗周期內測定了所有微宇宙系統的光周期和暗周期的溶解氧濃度，并在根據溶氧檢測數據計算微宇宙系統中暗周期溶解氧消耗量(DOc)。三唑酮處理組的DOc變化趨勢與對照組一致(P>0.05，Duncan test)。各個微宇宙系統的pH值始終在7.08～7.65，保持中性。方差分析顯示，各系統酸堿度在處理組和時間上沒有顯著性差異(P>0.05，Duncan test)。各個微宇宙系統的電導率(EC)在694～794 μS·cm-1范圍內無顯著性差異(P>0.05，Duncan test)。各微宇宙系統的可溶性有機碳濃度(DOC)范圍在39.40～44.09 mg·L-1，方差分析顯示無顯著性差異(P>0.05，Duncan test)。由此判斷三唑酮在(119.06 ± 11.16)～(2 078.88 ± 153.18) μg·L-1濃度下對標準微宇宙系統水質指標沒有影響。

2.3 三唑酮對單物種豐度的影響

試驗開始(0 d)時，各微宇宙系統間8種浮游動物數量無顯著性差異，平均豐度分別為：無節幼蟲(327 ± 126.4) ind·L-1、鋸緣真劍水蚤(107 ± 41.4) ind·L-1、中華薄殼介(5 ± 2.9) ind·L-1、隆線溞(10 ± 7.2) ind·L-1、低額溞(7 ± 3.2) ind·L-1、平突船卵溞(10 ± 6.0) ind·L-1、盤腸溞(9 ± 5.7) ind·L-1、萼花臂尾輪蟲(45 ± 32.2) ind·L-1和單趾輪蟲(52 ± 25.5) ind·L-1。隨著暴露時間的延長，三唑酮對枝角類生物的影響比較明顯，三唑酮處理組中的枝角類生物豐度大多低于同期對照組(表3)，當三唑酮濃度>104.97 μg·L-1(實際暴露濃度，下同)，在7～21 d時，處理組枝角類生物豐度與對照組差異顯著。

表3 三唑酮對枝角類豐度的影響Table 3 Effects of triadimefon on Cladocerans secies abundance

2.4 三唑酮對浮游動物種群的影響

對照組和各三唑酮處理組中浮游動物組成變化經PRC分析的結果如圖5所示。置換檢驗結果表明，三唑酮處理組中浮游動物組成隨時間變化達到顯著水平(Pseudo-F = 12.9，P= 0.002)。圖5中Resp.1反映的是不同物種對三唑酮的敏感性差異。本研究中浮游生物對三唑酮的敏感性依次為：盤腸溞>平突船卵溞>隆線溞>萼花臂尾輪蟲>低額溞≥鋸緣真劍水蚤≥無節幼蟲≥單趾輪蟲≥中華薄殼介。三唑酮處理對單趾輪蟲以及介蟲沒有明顯的作用(Resp.1接近0)；鋸緣真劍水蚤與其無節幼蟲受到三唑酮輕微的影響；三唑酮對枝角類生物具有顯著的負效應(Resp.1為1～4.8)。

圖5 三唑酮對浮游動物組成結構的影響注：圖例中的濃度值為三唑酮理論濃度/實際濃度。Fig. 5 Effects of triadimefon on zooplankton assemblageNote: The concentration is theoretical concentration/actual concentration in legend.

筆者研究發現，三唑酮對室內標準微宇宙試驗的浮游動物群落沒有出現崩潰式的影響[23]。三唑酮暴露下的浮游動物群落演替過程可分為：演替前期(表現農藥直接效應)、演替后期(表現農藥間接效應)和平衡期[24]。在試驗初期(即0～7 d)三唑酮對枝角類生物產生明顯的負效應，對橈足類生物則產生輕微的負效應。三唑酮對浮游動物群落的影響逐漸減小。試驗開始14 d后，三唑酮對浮游動物群落的影響不明顯。在試驗21 d后除了最高濃度處理組，其余的處理組生物豐度有顯著的回升。

三唑酮對整個室內微宇宙的顯著效應主要在試驗初期，在該時間段三唑酮對隆線溞的NOEC為537.98 μg·L-1(實際濃度，下同)；對低額溞、平突船卵溞和盤腸溞的NOEC均為1 042.97 μg·L-1。其他階段，三唑酮對其他生物的NOEC均>2 078.88 μg·L-1。經過PCA分析得到統計變量CaseR1.和CaseR2.。CaseR1.體現了輪蟲物種豐度信息，CaseR2.主要體現了三唑酮對其他甲殼類浮游生物的影響。兩者所代表的生物變量組成接近，對變量總體的解釋能力分布為30.87%和20.02%。各物種對CaseR1.和CaseR2.排序軸的貢獻度如表4所示。對CaseR1.和CaseR2.進行方差分析，結果表明，在浮游動物水平上三唑酮僅在試驗早期7 d內有明顯作用，其NOECcommunity為537.98 μg·L-1，對三唑酮處理組浮游動物主成分分析如圖6所示。三唑酮整個試驗周期NOECcommunity>2 078.88 μg·L-1(表5)

圖6 三唑酮處理組中浮游動物組成結構主成分分析注：(a)和(b)象限內物種種群數量與三唑酮濃度呈正相關；(c)和(d)象限內的呈負相關。Fig. 6 Principal component analysis of triadimefon treated zooplankton communityNote: Species in (a) and (b) quadrants are positive correlation with concentration of triadimefon, and those in (c) and (d) quadrants are negative correlation.

3 討論(Discussion)

三唑酮對微宇宙系統的直接效應主要表現在施藥后的0～7 d。從PRC圖分析可以看出，浮游動物對三唑酮的敏感程度排序主要是枝角類>橈足類≥輪蟲類≥介形蟲。其中，枝角類為最敏感的動物，這與Yin等[25]對咯菌腈暴露的室外微宇宙研究的結果類似。三唑酮對整個室內微宇宙的顯著效應主要在試驗初期(即0～7 d)，在該時間段三唑酮對隆線溞的NOEC為537.98 μg·L-1(實際濃度，下同)；對低額溞、平突船卵溞和盤腸溞的NOEC均為1 042.97 μg·L-1。其他階段三唑酮對其他生物的NOEC均>2 078.88 μg·L-1。方差分析表明，三唑酮僅在試驗早期7 d內對微宇宙系統的生物群落有明顯作用，其NOECcommunity為537.98 μg·L-1，這個值與三唑酮對大型溞的NOEC值相同，表明三唑酮對微宇宙系統的NOECcommunity與系統內最敏感浮游動物的NOECspecies有關。其余時間段三唑酮對微宇宙試驗系統的NOECcommunity均>2 078.88 μg·L-1。根據文獻報道，在三唑酮使用期間，稻田附近溝渠水三唑酮濃度為12 μg·L-1，這個值低于本實驗三唑酮暴露初期的NOECcommunity(即537.98 μg·L-1)。因此，三唑酮對浮游動物群落產生的生態效應很小。

表4 三唑酮處理組浮游動物對主成分排序軸的貢獻度及相關性Table 4 Species contribution and correlation for PCA axis in triadimefon treatment

表5 三唑酮對浮游動物物種及其群落的最大無作用濃度(NOEC)Table 5 The no observed effect concentration (NOEC) of triadimefon to zooplankton species and its community (μg·L-1)

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