食蚊魚P-糖蛋白基因克隆及三氯生對其mRNA表達的影響

宋曉紅，陸愛金，杜士林，陳雙鳳，陳旺光，梁延鵬，黃亮亮，曾鴻鵠,*

1. 桂林理工大學環境科學與工程學院，桂林 541004 2. 廣西環境污染控制理論與技術重點實驗室，桂林 541004 3. 巖溶地區水污染控制與用水安全保障協同創新中心，桂林 541004

ATP結合轉運載體蛋白(ATP-binding cassette transporter, ABC)是一組細胞跨膜糖蛋白，主要功能是介導內源和外源分子的跨膜轉運。ABC家族具有很多結構相似的成員，其中，與毒理學比較相關的成員，包括P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp) (ABCB亞族)、多藥耐藥相關蛋白(multidrug resistance associated proteins, MRPs) (ABCC亞族)和乳腺癌耐受蛋白(breast cancer resistance protein, BCRP) (ABCG亞族)等[1-3]。其中，P-gp又叫MDR1(multidrug resistance protein 1)，作為能量依賴型的介導轉運糖蛋白，具有通道、運輸和調節功能，對外源性物質的吸收、分布、代謝、排泄和毒性均起到重要作用[4]，可以將細胞內的毒素、重金屬和藥物等物質泵出胞外，以減少異源物質在細胞內的積累，降低潛在的毒害威脅[5]。P-gp廣泛存在于水生生物組織中，其與機體內其他代謝系統組成完整的解毒和保護機制[6]。許多研究表明，生物體中P-gp的mRNA表達、蛋白水平和活性變化與外源污染物的攝入或暴露密切相關[2,7-8]，可作為環境污染物的有效生物標志物[9-11]。

三氯生(TCS)是一種常用的廣譜高效抗菌劑，廣泛應用于個人日常護理用品和醫療用品等。TCS具有醚類和酚類基團，具有親脂性，易被生物體細胞吸收并在生物體內富集累積[12-13]。近年來，在水環境和生物體內均不同程度地檢出了TCS，質量濃度通常在ng·L-1～μg·L-1和ng·kg-1～μg·kg-1水平[14-16]。TCS長時間持續存在于水環境中，會影響水生生物的正常代謝[17]、行為[18]、生長、繁殖和發育[19-20]，對生態環境和人類健康的潛在風險不可忽視。

魚類的生活與水環境息息相關，當外源污染物進入魚體時，機體會發生相應的免疫防御反應。檢測TCS暴露中P-gp表達的變化，有助于闡明TCS對魚體的毒性機理。食蚊魚(Gambusiaaffinis)是一種小型魚類，具有生長迅速、卵胎生和繁殖力強等特點，在水環境中廣泛分布，是重金屬、農藥和環境激素等[21-23]環境污染物監測的理想實驗動物。本研究以食蚊魚為實驗材料，通過克隆測序獲得了食蚊魚P-gpcDNA全長序列，用實時熒光定量PCR法開展了TCS脅迫與P-gp表達的時間-劑量效應關系研究，探討相關的免疫機制，為TCS的生物監測提供研究基礎。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗動物

本研究所用食蚊魚幼魚購自廣西荔浦青山水產養殖場，于實驗室水生生物養殖系統內馴養2周，水溫(24 ± 1) ℃，光周期為14 h∶10 h(白晝/黑暗)，每日固定喂食2次小型魚類專用飼料。選取健康、活潑和大小均勻的個體投入試驗，平均體質量為(0.10 ± 0.03) g，平均體長為(2.0 ± 0.3) cm。

1.2 TCS暴露實驗

三氯生(TCS)，純度≥97%，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二甲基亞砜(DMSO)，純度>99.8%，購自上海麥克林生化科技有限公司。將TCS用DMSO配制成貯備液備用，暴露實驗中DMSO的終濃度為0.01% (V/V)。本研究設置50、100和150g·L-13個TCS處理組和1個DMSO對照組(0.01%，V/V)，每組設置3個平行。

參照文獻方法[24]，在3 L燒杯中開展暴露實驗，每個燒杯中加入2 L實驗溶液，各放入12尾食蚊魚。采用半靜態換水方式，實驗用水均為曝氣2 d以上的自來水，pH為7.1～7.4，水溫(24 ± 1)℃，溶解氧≥5.0 mg·L-1，每日換1/2實驗溶液，固定喂食2次并及時吸出殘餌和排泄物。分別于12 h、1 d、3 d、5 d、7 d和9 d采樣，每次采樣每個燒杯隨機取2尾魚，即每個濃度組取6尾魚，冰浴解剖采集內臟團樣品后，立即放入RNA保存液(TaKaRa)中，-20 ℃保存備用。

1.3 P-gp基因cDNA的克隆與序列分析1.3.1 總RNA提取及cDNA的合成

取約30 mg食蚊魚內臟團組織勻漿，用RNAiso Plus試劑盒(TaKaRa)參照說明書提取總RNA。用瓊脂糖凝膠電泳和微量分光光度計(Quawell Q5000)檢測總RNA的質量和完整度。用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa)合成第一鏈cDNA，用于cDNA中間片段的擴增和熒光定量PCR實驗。用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas)合成3’ RACE cDNA模板。

1.3.2 cDNA克隆及測序

根據NCBI網站中光若花鳉(Poeciliopsislucida) (No. DQ842514.2)、劍尾魚(Xiphophorushellerii) (No. HQ829295.1)和羅非魚(Oreochromisniloticus) (No. DQ842514.2)的P-gp基因序列的保守區域，利用Primer Premier 5.0軟件設計引物(表1)，以食蚊魚內臟團cDNA為模板擴增中間片段。PCR產物經回收、純化和克隆后送至深圳華大基因公司測序。以獲得的食蚊魚P-gp基因序列為模板，設計3’ RACE引物(表1)，通過特異性引物和3’ RACE試劑盒自帶通用引物開展巢式PCR，擴增目的基因并測序。

表1 實驗所用引物序列Table 1 Nucleotide sequences of primers used in present study

1.3.3 序列分析

利用ContigExpress軟件對獲得的各中間片段與3’端擴增片段進行拼接。利用DNAStar軟件預測P-gp基因的ORF區域并推導出相應的氨基酸序列，統計蛋白質一級結構氨基酸的含量。用ExPASy在線分析軟件中ProtParam預測其等電點和理論分子量等理化性質。利用SOPMA在線工具預測蛋白質的二級結構。用Swiss model在線軟件預測蛋白質的三級結構。利用SignalP 5.0程序開展信號肽分析。利用SMART和ExPASy中的PROSITE預測蛋白質的功能結構域和作用位點。利用Tmpred預測跨膜性質。利用ESPript 3.0進行氨基酸序列的多重序列比對分析，運用BLAST軟件開展氨基酸序列的同源性分析，利用MEGA5.0軟件，以鄰位相連法構建系統進化樹，分支置信度采用自展法(Bootstrap analysis)重復檢驗1 000次。

1.4 TCS暴露后P-gp基因mRNA表達量的測定

根據以上實驗獲得的P-gpcDNA序列設計qRT-PCR特異性引物(表1)，以食蚊魚GAPDH基因作為內參基因[25]，參照SYBR?Premix Ex Taq Ⅱ (TaKaRa)試劑盒操作說明，運用CFX96 PCR儀(Bio-rad)開展實時熒光定量PCR實驗。以各采樣時間點時各處理組和對照組的6個樣品cDNA為模板，每個樣品重復3次，并設置陰性對照。PCR反應體系為SYBR?Premix Ex Taq Ⅱ 12.5 μL，cDNA模板2 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，雙蒸水8.5 μL。反應程序為預變性：95 ℃、30 s；40個循環：95 ℃、5 s，55 ℃、30 s；熔解曲線：95 ℃、10 s，65 ℃、5 s，95 ℃、0.5 s。反應結束后，查看PCR的擴增曲線和熔解曲線判斷PCR反應的特異性。

采用2-△△CT法[26]計算目的基因的相對表達量，△△CT=(CT目的基因-CT參考基因)TCS處理組-(CT目的基因-CT參考基因)對照組，結果采用平均值±標準誤差(Mean±SEM)表示，用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，采用Tukey B檢驗法開展多重比較分析，不同濃度暴露組與空白對照組之間開展配對t檢驗。以P<0.05、P<0.01表示差異顯著。

2 結果(Results)

2.1 食蚊魚P-gp基因序列擴增與分析

本研究克隆得到了食蚊魚P-gpcDNA序列，GenBank登錄號為MN628568。該基因的cDNA序列長5 452 bp，包含87 bp 5’UTR、3 885 bp ORF和1 480 bp 3’UTR，其中包含31個堿基的poly(A)尾巴。編碼1 294個氨基酸，其中，疏水性氨基酸502個(38.79%)，極性氨基酸314個(24.27%)，堿性氨基酸141個(10.90%)，酸性氨基酸143個(11.05%)。該蛋白分子式為C6387H10145N1693O1885S48，分子量約為142.35 kDa，理論等電點(pI)為6.85。在哺乳類紅細胞中表達的半衰期為30 h，在酵母和大腸桿菌體內表達的半衰期分別為>20 h和>10 h，脂溶系數(aliphatic index)為92.87，親水指數(GRAVY)為-0.012，不穩定系數為36.65，說明該蛋白在溶液中性質穩定。

SignalP 5.0信號肽分析顯示，食蚊魚P-gp蛋白沒有信號肽酶切位點，是一種非分泌蛋白。食蚊魚P-gp跨膜性質的預測結果表明，存在由內向外和由外向內的12個跨膜螺旋(表2)，具有典型的跨膜結構。保守結構功能域與基序分析顯示，該基因編碼蛋白具有ABC轉運家族的典型功能區域和位點，包含2個ABC轉運膜區(transmembrane domains, TMD)和2個ATP結合區(ATP-binding cassette, ABC) (圖1)，具有ABC轉運體家族標記序列、Walker A (P環)、Walker B、ATP結合位點、D環、H環和Q環等保守序列，屬于ABC轉運蛋白超家族成員，具有膜轉運糖蛋白的典型特征。

圖1 PROSITE軟件預測的食蚊魚P-gp蛋白結構域注：灰色ABC_TM1F表示ABC轉運膜區，橙色ABC_TRANSPORTER_2表示ATP結合區。Fig. 1 The conserved domains prediction of P-gp coding protein from G. affinis using PROSITENote: ABC_TM1F indicates ABC transporter integral membrane type-1 fused domain profile; ABC_TRANSPORTER_2 indicates ATP-binding cassette, namely ABC transporter-type domain profile.

二級結構預測結果顯示，食蚊魚P-gp的氨基酸序列包含647個α螺旋(50%)、228個延伸主鏈(17.62%)、337個無規則卷曲(26.04%)和82個β轉角(6.34%)。蛋白質三級結構主要由α螺旋、無規則卷曲、延伸主鏈和β轉角構成(圖2)，與二級結構預測結果一致。三級結構顯示該蛋白有2個跨膜區和2個核苷酸結合區，每個跨膜區由6個α螺旋組成。

表2 食蚊魚P-糖蛋白(P-gp)跨膜區位置預測結果Table 2 The prediction of transmembrane domain sites in G. affinis P-glycoprotein (P-gp)

圖2 食蚊魚P-gp蛋白質三級結構預測Fig. 2 The third structure prediction of P-gp coding protein from G. affinis

2.2 食蚊魚P-gp氨基酸序列的同源性分析

運用BLAST軟件對食蚊魚P-gp氨基酸序列的同源性分析表明，食蚊魚P-gp氨基酸序列與同屬鳉形目的花斑劍尾魚(Xiphophorusmaculatus)、光若花鳉(Poeciliopsislucida)和底鳉(Fundulusheteroclitus)等魚類的P-gp (MDR1)氨基酸序列具有較高的同源性(圖3)，分別為96.3%、96.0%和91.2%，而與人類(Homosapiens)和小鼠(Musmusculus)的同源性相對較低，分別為63.2%和62.9%。

圖3 食蚊魚與其他魚類P-gp (MDR1)的氨基酸序列比對注：完全一致的氨基酸殘基用紅底白字表示，結構保守性氨基酸殘基用紅字加藍色方框表示。Fig. 3 P-gp (MDR1) amino acid sequences of G. affinis and other fishesNote: White letters with red shading indicate that residues are identical and red leters with blue-rim box mean conserved residues.

系統進化樹的研究結果表明(圖4)，食蚊魚P-gp與劍尾魚、光若花鳉和底鳉的親緣關系較近，遺傳進化分析聚為一支，與巨魾(Bagariusyarrelli)、南亞野鯪(Labeorohita)和白邊鋸鱗魚(Myripristismurdjan)等魚類的親緣關系較遠。

圖4 食蚊魚與其他魚類P-gp (MDR1)的NJ進化樹分析Fig. 4 NJ phylogenetic tree of P-gp (MDR1) amino acid sequences from G. affinis and other fishes

2.3 TCS暴露對食蚊魚P-gp基因mRNA表達的影響

不同濃度TCS暴露9 d后，食蚊魚內臟團中P-gp的表達變化如圖5所示。50g·L-1TCS暴露3 d后食蚊魚P-gp表達量最高(P<0.05)；100g·L-1TCS暴露組中，P-gp在1 d(P<0.01)和3 d(P<0.05)表達量較高，出現峰值，隨后減弱，呈現下降趨勢(P<0.05)；150g·L-1TCS暴露9 d，P-gp在不同時間段的表達差異不顯著(P>0.05)。配對t檢驗結果顯示，TCS暴露1 d時，100g·L-1濃度組P-gp表達量與對照組差異顯著(P<0.05)；暴露5 d時，50g·L-1濃度組P-gp表達量與對照組差異顯著(P<0.05)。

圖5 三氯生(TCS)暴露對食蚊魚P-gp mRNA表達的影響注：*、**表示相同TCS濃度下不同暴露時間組間差異顯著性水平為P<0.05、P<0.01；?表示TCS暴露組與空白對照組之間差異顯著性水平為P<0.05。Fig. 5 The effects of triclosan (TCS) on the mRNA expression of P-gp in G. affinisNote: Asterisks indicate statistical significance among groups with different exposure time (*P<0.05, **P<0.01); ? indicates difference between TCS treatment against control by t-test (P<0.05).

3 討論(Discussion)

3.1 食蚊魚P-gp基因序列分析

本研究成功克隆了食蚊魚P-gp基因，對其編碼的氨基酸序列開展了信號肽、跨膜性質、保守功能區域與位點、蛋白質一級、二級和三級結構分析，結合多序列比對、同源性比較與系統進化樹分析結果，可以確定獲得的食蚊魚P-gp是ABC轉運蛋白超家族的P-糖蛋白基因。同源性分析顯示，食蚊魚P-gp與同屬鳉形目的其他魚類氨基酸序列相似度較高，均達90%以上，且在系統進化分析中也聚為一支，其進化地位與傳統生物學分類、系統演化基本吻合，說明P-gp在進化過程中具有較高的序列保守性和功能一致性，在不同物種的生長發育過程中具有重要作用。

P-gp編碼的蛋白具有ABC家族的典型功能區域和保守作用位點，從N端到C端呈TMD-ABC-TMD-ABC排列，是典型的ABCB亞家族全轉運子[6]。TMD是ABC轉運蛋白的跨膜通道，用于內源、外源物質的跨膜轉運，ABC區域主要起結合與水解ATP的功能，為物質轉運提供足夠的能量[4]，P-gp在這些結構基礎上發揮運輸、通道和和調節等功能。

3.2 TCS對P-gp基因mRNA表達的影響

多型異源物質抗性系統(multixenobiotic resistance, MXR)和耐藥系統(multidrug resistance system, MDR)是水生生物體內廣泛存在的對內源和外源毒性物質的重要細胞防御機制[10]。P-gp是與該機制密切相關的重要解毒蛋白之一，通過水解ATP或與ATP結合發揮外排泵作用，防止異源有害物質與細胞內的靶分子結合，降低異源物質對細胞的傷害與毒性作用[27]。

TCS的辛醇水分配系數(logKow)為4.76[28]，能在魚體內產生生物累積[29-30]，Escarrone等[13]比較了200g·L-1TCS暴露后孔雀魚不同組織中的TCS含量，結果表明，肝臟和性腺是TCS的重要生物累積部位。研究發現，P-gp在魚類的肝臟、腸道、腎、性腺、心臟、腦和肌肉等多個組織中均有表達[6,31]，表現屏障功能，在環境毒性物質對水生生物脅迫過程中發揮了重要的免疫作用。此外，藥物在魚類的肝臟、腸道等組織中存在“首過效應”，藥物通過這些器官時被部分分解或外排，使藥物進入血液或其他靶器官的劑量減少[9]。

內臟團包含了魚體的肝臟、腸道、腎和性腺等組織，取樣快速方便，本實驗以食蚊魚的內臟團為整體研究對象，對P-gp的表達情況開展綜合評價，可以更快速地為TCS的環境監測提供參考數據。結果表明，100g·L-1TCS暴露明顯促進食蚊魚P-gp的表達，表達高峰在暴露1 d后，隨著時間的推移其促進作用呈減弱趨勢；50g·L-1TCS暴露對P-gp表達的促進高峰時間延遲至3 d，而150g·L-1濃度組P-gp表達變化不顯著，說明TCS對P-gpmRNA表達的影響具有一定的時間-劑量效應，其變化趨勢可能與食蚊魚體內外源TCS有效劑量的變化與累積有關。

環境污染物對水生生物P-gp表達變化的影響因素較多，包括不同的暴露時間和濃度、不同的實驗動物或不同的組織器官、實驗動物所處的不同生長發育階段或生理時期、個體差異、不同實驗環境與實驗方法、生物體內其他解毒代謝機制等。例如，TCS暴露對雌性和雄性劍尾魚肝臟組織中P-gp的表達分別呈現抑制和誘導效應[35]。此外，也有研究認為P-gp的表達調控可能在翻譯水平而不是轉錄水平[27]，污染物暴露后P-gp在基因水平和蛋白質水平具有不同的表達模式[36]。因此，TCS對P-gpmRNA表達的影響機制還需進一步探究。

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