微塑料在日本虎斑猛水蚤(Tigriopus japonicus)體內(nèi)的攝入、排出及對其攝食行為的影響

劉全斌，張明興，丁光輝，李西山，張典,3，張微微，王瑩,#，王菊英,*

1. 大連海事大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，大連 116026 2. 國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心，海洋垃圾和微塑料研究中心，大連 116023 3. 自然資源部第三海洋研究所海洋生物與生態(tài)實驗室，廈門 361000

微塑料(microplastics)通常指尺寸<5 mm的塑料碎片、顆粒或纖維，海洋環(huán)境中的微塑料主要來源于大型塑料的破碎和風(fēng)化[1-2]，以及工業(yè)原料的泄露和個人護(hù)理品的使用[3]。微塑料廣泛分布于海洋環(huán)境中，在大洋[4]、近岸海域[5]和極地[6]均有微塑料檢出。研究發(fā)現(xiàn)，北大西洋副熱帶環(huán)流區(qū)表層海水中微塑料豐度為13～501 個·m-3[4]，對我國海域進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，黃海表層水體中微塑料豐度為(0.330±0.278) 個·m-3[5]。檢出的微塑料主要成分為聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯和聚酯等[4-7]。

大量研究表明，微塑料能被浮游動物[8-9]、貝類[10-11]和魚類[12-13]等不同營養(yǎng)級海洋生物攝食并通過食物鏈傳遞[14-15]。微塑料被攝入后會造成生物體消化道的物理損傷[16]、攝食行為改變[17]以及誘發(fā)炎癥反應(yīng)等[18-19]，對海洋生物存在潛在威脅。

浮游動物作為海洋食物網(wǎng)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在物質(zhì)循環(huán)和能量傳遞過程中起著重要的作用，同時也影響污染物在食物鏈中的遷移[14,20]。野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)，中國南海及黃海海域采集的浮游生物(橈足類、毛顎類和短尾類等)體內(nèi)均有微塑料檢出，這表明，在自然環(huán)境中，浮游動物能夠攝入環(huán)境中的微塑料[21-22]。實驗室研究發(fā)現(xiàn)，北大西洋的多種浮游動物能夠攝入粒徑為1.7～30.6 μm的聚苯乙烯(PS)微粒，并通過“假排泄物”將PS微粒排出體外，暴露在濃度為7×103個·mL-1的PS溶液中的胸刺水蚤(Centropagestypicus)，對微藻的攝食顯著減少[23]。近期研究發(fā)現(xiàn)，鹵蟲(Artemiaparthenogenetica)幼體也可攝入濃度為1～1×105個·mL-1的10 μm的PS微粒，且PS微粒可在鹵蟲消化道內(nèi)停留14 d以上[24]。

微塑料被浮游動物攝入體內(nèi)后，會對其存活、生長發(fā)育及繁殖能力造成不利影響。日本虎斑猛水蚤(Tigriopusjaponicus)攝入粒徑為0.05～6 μm的PS微粒后，個體出現(xiàn)死亡和繁殖能力下降[25]；鹵蟲(A.parthenogenetica)攝入粒徑為10 μm的PS微粒后，會造成腸道上皮細(xì)胞損傷[24]；大型溞(Daphniamagna)攝入粒徑為100 nm的PS微粒后，生長發(fā)育過程受到抑制，繁殖能力下降[26]。目前，大多數(shù)研究主要集中在微塑料對海洋生物的毒性效應(yīng)，但對于微塑料在浮游動物體內(nèi)的毒動力學(xué)過程研究較少；因此，開展浮游生物對微塑料攝入和排出的動力學(xué)研究對評估微塑料的生態(tài)風(fēng)險具有重要意義。

本研究使用海洋模式生物日本虎斑猛水蚤(T.japonicus)作為受試生物，探究了日本虎斑猛水蚤對10 μm PS微粒的攝入和排出過程，以及添加PS微粒對其攝食行為的影響，以期為科學(xué)評估微塑料的生態(tài)風(fēng)險提供依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

熒光體式顯微鏡(Leica M205FA，德國)；熒光倒置顯微鏡(Leica DMI4000B，德國)。

熒光聚苯乙烯塑料微粒(10 μm)分散液購自美國Thermo Fisher公司，濃度為1.74×107個·mL-1[24]，濃硝酸(HNO3)為分析純，購自天津市科密歐化學(xué)試劑公司，人工海鹽購自天津中鹽海洋生物科學(xué)有限公司。

1.2 微藻培養(yǎng)

實驗選用牟氏角毛藻(Chaetocerosmuelleri)和小球藻(Chlorellasp.)，藻類培養(yǎng)條件為溫度(20±1) ℃，光照強度約2100 lux，光周期12 h(L)∶12 h(D)，培養(yǎng)基為f/2培養(yǎng)基。

1.3 受試生物

日本虎斑猛水蚤馴養(yǎng)理化條件：溫度(20±1) ℃，光照強度約2 100 lux，光周期12 h(L)∶12 h(D)，鹽度30.0±0.46，pH 8.2±0.12，溶解氧(DO)濃度(8.45±0.53) mg·L-1。以混合藻類投喂，餌料包括牟氏角毛藻和小球藻，投喂密度比例為1∶1，每3天投喂一次，投喂密度為1×106cells·mL-1。

1.4 實驗分組

本研究通過4個實驗探究了日本虎斑猛水蚤對PS微粒的攝入和排出的動力學(xué)過程及PS微粒的添加對其攝食行為的影響(表1)。實驗Ⅰ和實驗Ⅱ主要考察日本虎斑猛水蚤體內(nèi)PS微粒的攝入量和殘留量隨時間變化情況，實驗Ⅲ考察了日本虎斑猛水蚤與PS微粒的相互作用，實驗Ⅳ考察了不同濃度PS微粒的添加對微藻生長的影響，以及濃度為1×103個·mL-1的PS微粒對日本虎斑猛水蚤對微藻攝食率的影響。

1.5 攝入(實驗Ⅰ)和排出(實驗Ⅱ)實驗

對日本虎斑猛水蚤的最低微塑料攝入濃度進(jìn)行了預(yù)研究，結(jié)果表明，當(dāng)PS微粒濃度<1×102個·mL-1時，在日本虎斑猛水蚤體內(nèi)無PS微粒檢出，PS微粒濃度為1×103個·mL-1時，適于開展PS微粒在日本虎斑猛水蚤體內(nèi)的富集和排出動力學(xué)研究，此濃度遠(yuǎn)高于當(dāng)前水環(huán)境中的微塑料檢出濃度[4-7]。

實驗暴露前，對熒光PS暴露溶液進(jìn)行超聲處理，使用硝酸纖維素濾膜(0.45 μm，Sartorius ACN)進(jìn)行抽濾，用熒光體式顯微鏡對PS微粒進(jìn)行計數(shù)，從而確定PS溶液的實際暴露濃度。實驗Ⅰ、實驗Ⅱ和實驗Ⅳ中，在暴露前一天對日本虎斑猛水蚤投喂微藻，投喂密度為1×105cells·mL-1。實驗Ⅲ中，暴露前對日本虎斑猛水蚤進(jìn)行饑餓處理24 h。

實驗Ⅰ中，根據(jù)暴露時長(0、3、6、9、12、24和48 h)設(shè)置7個實驗組，每組3個平行，每個平行中暴露溶液體積為20 mL，PS微粒的濃度為1×103個·mL-1，并加入10只齡期一致(蚤齡為(18±1) d)的日本虎斑猛水蚤，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度(20±1) ℃，光照強度約2 100 lux，光周期12 h(L)∶12 h(D)，總暴露時長為48 h，暴露期間不喂食。分別于暴露0、3、6、9、12、24和48 h后，將每個平行中的10只日本虎斑猛水蚤取出，用人工海水沖洗3遍，置于20 mL玻璃閃爍瓶中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65%的硝酸于40 ℃超聲40 min進(jìn)行消解(熒光PS微粒回收率為100.0%±1.3%[27])。消解后，使用硝酸纖維素濾膜(0.45 μm，Sartorius ACN)抽濾，并在熒光體式顯微鏡下對PS微粒進(jìn)行觀察和計數(shù)，從而計算日本虎斑猛水蚤對PS微粒的攝入量。

表1 實驗分組及聚苯乙烯(PS)微粒暴露濃度Table 1 Groups and concentrations of polystyrene (PS)

實驗Ⅱ中，設(shè)置6個實驗組(0、3、6、12、24和48 h)，每組3個平行，每個平行中10只日本虎斑猛水蚤，每個平行中加入清潔的人工海水20 mL。參照實驗Ⅰ，預(yù)先將齡期一致(蚤齡為(18±1) d)的日本虎斑猛水蚤暴露于濃度為1×103個·mL-1的PS微粒溶液中培養(yǎng)48 h，將日本虎斑猛水蚤用人工海水清洗3遍并轉(zhuǎn)移至實驗Ⅱ?qū)?yīng)的實驗組中，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，期間不喂食。培養(yǎng)條件與實驗Ⅰ一致，分別在轉(zhuǎn)移后的0、3、6、12、24和48 h，計算并觀察日本虎斑猛水蚤體內(nèi)PS微粒的殘留量，方法與實驗Ⅰ一致。

1.6 日本虎斑猛水蚤與PS微粒的相互作用

實驗Ⅲ中，將饑餓處理24 h后的日本虎斑猛水蚤暴露于濃度為1×103個·mL-1的PS微粒溶液中，暴露期間不喂食。根據(jù)暴露時長(0、3、6、9、12、24和48 h)設(shè)置7個實驗組，每組3個平行，每個平行10只齡期一致(蚤齡為(18±1) d)的日本虎斑猛水蚤，培養(yǎng)條件與實驗Ⅰ一致。分別于暴露0、3、6、9、12、24和48 h后，將日本虎斑猛水蚤取出，使用人工海水沖洗3遍，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的甲醛溶液固定，熒光倒置顯微鏡觀察PS微粒在日本虎斑猛水蚤體內(nèi)分布情況和體表粘附情況。

1.7 微塑料對日本虎斑猛水蚤對微藻攝食率的影響(實驗Ⅳ)

實驗Ⅳ中，為了考察微塑料對微藻生長的影響，將牟氏角毛藻暴露在濃度分別為1×103個·mL-1和1×104個·mL-1的PS微粒溶液中。暴露0、24和48 h后，將暴露溶液轉(zhuǎn)移至閃爍瓶中顛倒搖勻，用移液槍吸取1 mL溶液置于離心管中，立即使用倒置顯微鏡和血球計數(shù)板對溶液中的微藻進(jìn)行計數(shù)，計算溶液中微藻的密度。為了考察PS微粒對日本虎斑猛水蚤對微藻攝食率的影響，將日本虎斑猛水蚤暴露在濃度為1×103個·mL-1的PS微粒溶液中。暴露0、24和48 h后，將日本虎斑猛水蚤挑出，對暴露溶液中的微藻進(jìn)行計數(shù)，并計算日本虎斑猛水蚤對微藻的攝食率，參考Frost[28]計算哲水蚤(Calanuspacificus)對微藻攝食率的方法。

1.8 統(tǒng)計分析

采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，實驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，采用One-Way ANOVA(單因素方差分析)對實驗Ⅰ～Ⅱ中PS微粒的攝入量和殘留量間的差異進(jìn)行顯著性檢驗，采用LSD法進(jìn)行多重比較，對實驗Ⅳ中微藻密度間的差異和日本虎斑猛水蚤對微藻攝食率間的差異進(jìn)行顯著性檢驗，P<0.05時認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果(Results)

2.1 日本虎斑猛水蚤對PS的攝入及排出

采用熒光體式顯微鏡對熒光PS微粒的濃度進(jìn)行定量分析，暴露溶液中熒光PS微粒實測濃度如表2所示。

表2 熒光PS微粒實測濃度(n=4)Table 2 Measured concentrations of fluorescently labelled PS (n=4)

實驗(Ⅰ～Ⅳ)中均未出現(xiàn)生物體死亡。攝入實驗(實驗Ⅰ)研究結(jié)果表明，日本虎斑猛水蚤暴露在濃度為1×103個·mL-1的PS微粒溶液中3 h后，可在日本虎斑猛水蚤體內(nèi)檢出PS微粒，濃度為(0.67±0.21) 個·只-1，且PS微粒的攝入量隨著暴露時間增加呈現(xiàn)出逐漸增加的趨勢，24 h后達(dá)到最大值，為(7.00±2.44) 個·只-1，之后日本虎斑猛水蚤體內(nèi)PS微粒的含量降低，在48 h后降至(3.20±1.93) 個·只-1(圖1(a))。

圖1 日本虎斑猛水蚤對熒光PS微粒的攝入情況(a)和暴露48 h后轉(zhuǎn)移至清潔海水中PS微粒的排出情況(b) (PS暴露初始濃度為1×103 個·mL-1)注：不同字母表明實驗組間存在顯著差異(P<0.05)。Fig. 1 The ingestion of fluorescent PS microspheres in T. japonicus (a) and the elimination of fluorescent PS microspheres by T. japonicus in clean seawater after pre-exposure to PS (concentrations 1×103 particles·mL-1) for 48 h (b)Note: Different letters indicate statistically significant differences (P<0.05).

排出實驗(實驗Ⅱ)研究結(jié)果表明，日本虎斑猛水蚤體內(nèi)PS微粒的殘留量隨著時間增加呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢(圖1(b))，培養(yǎng)24 h后，即可排出體內(nèi)96.33%±1.18%的PS微粒，48 h后，日本虎斑猛水蚤體內(nèi)無PS微粒檢出。ANOVA統(tǒng)計分析結(jié)果表明，12、24和48 h的實驗組之間無顯著性差異(P>0.05)。

實驗Ⅲ通過熒光倒置顯微鏡對用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的甲醛固定的日本虎斑猛水蚤進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)日本虎斑猛水蚤攝入的PS微粒主要分布在消化道中(圖2(a))，在其排泄物中也可觀察到PS微粒(圖2(c))，此外，PS微粒也會粘附在日本虎斑猛水蚤的外殼和附肢(游泳肢)上(圖2(b))。

圖2 熒光PS微粒在日本虎斑猛水蚤體內(nèi)分布、體表粘附及排泄物中分布情況注：PS暴露初始濃度為1×103 個·mL-1，暴露時間為24 h。Fig. 2 Ingestion and conglutination of fluorescent PS microspheres in the gut, surface and feces of T. japonicusNote: The exposure concentration is 1×103 particles·mL-1; the exposure time is 24 h.

2.2 日本虎斑猛水蚤對微藻的攝食率

PS微粒的添加在一定程度上會對牟氏角毛藻的生長產(chǎn)生抑制作用。在PS微粒濃度為1×103個·mL-1的實驗組中，暴露24 h和48 h后，牟氏角毛藻的密度與對照組相比無顯著性差異(P>0.05)；在PS微粒濃度為1×104個·mL-1的實驗組中，暴露24 h和48 h后，牟氏角毛藻的密度與對照組相比分別降低了13.63%±8.72%和19.24%±1.26% (P<0.05)(圖3)。日本虎斑猛水蚤對微藻的攝食率實驗結(jié)果表明，在PS微粒濃度為1×103個·mL-1的實驗組中，暴露24 h和48 h后，日本虎斑猛水蚤對微藻的攝食率與對照組相比無顯著性差異(P>0.05)(圖4)。

圖3 不同濃度PS暴露組中微藻的密度注：*表明實驗組間存在顯著差異(P<0.05)。Fig. 3 The concentration of microalgae when exposed to PS microspheres at different concentrationsNote: *indicate statistically significant differences (P<0.05).

圖4 不同濃度PS暴露組中日本虎斑猛水蚤對微藻攝食率Fig. 4 The microalgae ingestion rates by T. japonicus when exposed to PS microspheres at different concentrations

3 討論(Discussion)

眾多研究表明，不同類別的浮游動物能夠攝入不同粒徑范圍的PS微粒。研究發(fā)現(xiàn)，鹵蟲(A.parthenogenetica)能夠攝入粒徑為1～20 μm的PS微粒[14]，海島哲水蚤(Calanushelgolandicus)能夠攝入粒徑為20 μm的PS微粒[20]，模糊網(wǎng)紋蚤(Ceriodaphniadubia)能攝入粒徑為1～5 μm的PS微粒[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，日本虎斑猛水蚤能較快地攝入10 μm的PS微粒，暴露濃度為1×103個·mL-1時，暴露3 h后，即可在體內(nèi)檢出。浮游動物對微塑料的攝入能力與微塑料的粒徑大小、暴露濃度及食物的供給有關(guān)。大型溞(D.magna)對PS微粒的攝入量隨著PS粒徑的增加而減小，攝入量與PS粒徑呈指數(shù)相關(guān)[30]；鹵蟲(A.parthenogenetica)對10 μm的PS微粒的攝入量隨著PS濃度和暴露時長的增加而增加[24]；提供藻類食物時，大型溞(D.magna)對2 μm的PS微粒的攝入量顯著降低，且隨著微藻密度增加，PS攝入量減少[31]。

生物體對微塑料的排出能力受物種種類、微塑料粒徑和食物的供給等因素的影響。1 μm和10 μm的PS微粒可在熱帶爪蟾(Xenopustropicalis)幼體的鰓和消化道中殘留6 d以上，且1 μm的PS微粒殘留量遠(yuǎn)大于10 μm的PS微粒，食物的供給也會影響蝌蚪對微塑料的排出能力，缺乏食物的條件下，蝌蚪會攝入更多的PS微粒且很難將其排出[32]。本研究中的排出實驗Ⅱ的結(jié)果表明，日本虎斑猛水蚤能夠在3 h內(nèi)開始排出體內(nèi)的PS微粒，24 h后，可排出體內(nèi)96.33%±1.18%的PS微粒，48 h后體內(nèi)無熒光PS微粒檢出。這說明，日本虎斑猛水蚤能夠較快速地排出體內(nèi)的PS微粒，但實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，10 μm的PS微粒可在鹵蟲體內(nèi)停留14 d以上[24]，二者差異較大，因此，微塑料在不同生物體內(nèi)的停留時間仍有待于進(jìn)一步的研究。

微藻攝食率實驗Ⅳ結(jié)果表明，PS微粒的添加在一定程度上會對微藻的生長產(chǎn)生抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，5 μm PS微粒對蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)的生長產(chǎn)生抑制作用[33]。氨基修飾的2 μm PS微粒會顯著降低硅藻(Chaetocerosneogracile)細(xì)胞內(nèi)酶的活性，并對硅藻的生長產(chǎn)生不利影響[34]。PS微粒濃度為1×103個·mL-1時，PS微粒對日本虎斑猛水蚤對微藻的攝食率無顯著影響(P>0.05)，這表明，在環(huán)境濃度下，微塑料對日本虎斑猛水蚤對微藻攝食率無顯著影響。當(dāng)PS微粒濃度為1×104個·mL-1時，PS微粒抑制了微藻的生長，無法確定PS微粒是否對日本虎斑猛水蚤的攝食率產(chǎn)生影響。

微塑料被浮游動物攝入后，不僅會造成物理損傷，如機(jī)械損傷、消化道阻塞等，同時也會對浮游生物的生長發(fā)育繁殖造成不利的影響，造成生物體的生長發(fā)育遲緩，降低生物體的繁殖力，誘發(fā)炎癥反應(yīng)等[18,20]。微塑料的毒性效應(yīng)也與其大小及化學(xué)成分有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，日本虎斑猛水蚤暴露于粒徑為0.05 μm的PS微粒溶液中，死亡率顯著高于0.5 μm和6 μm的PS微粒實驗組[25]。氨基修飾的PS微粒會改變鹵蟲體內(nèi)基因的表達(dá)，抑制鹵蟲的生長發(fā)育，甚至導(dǎo)致個體死亡[35]，相較于未修飾的PS微粒，基團(tuán)修飾的PS微粒對生物體毒性更大。

綜上所述，本文探究了日本虎斑猛水蚤成體對熒光PS微粒的攝入、排出動力學(xué)規(guī)律。結(jié)果表明，PS微粒能夠較快地被日本虎斑猛水蚤攝入和排出，且PS微粒濃度>1×104個·mL-1時，對牟氏角毛藻的生長產(chǎn)生了抑制作用。目前有關(guān)于微塑料在生物體內(nèi)的毒動力學(xué)過程及致毒機(jī)理仍有待于更加廣泛和深入的研究。

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