微塑料在日本虎斑猛水蚤(Tigriopus japonicus)體內的攝入、排出及對其攝食行為的影響

劉全斌，張明興，丁光輝，李西山，張典,3，張微微，王瑩,#，王菊英,*

1. 大連海事大學環境科學與工程學院，大連 116026 2. 國家海洋環境監測中心，海洋垃圾和微塑料研究中心，大連 116023 3. 自然資源部第三海洋研究所海洋生物與生態實驗室，廈門 361000

微塑料(microplastics)通常指尺寸<5 mm的塑料碎片、顆粒或纖維，海洋環境中的微塑料主要來源于大型塑料的破碎和風化[1-2]，以及工業原料的泄露和個人護理品的使用[3]。微塑料廣泛分布于海洋環境中，在大洋[4]、近岸海域[5]和極地[6]均有微塑料檢出。研究發現，北大西洋副熱帶環流區表層海水中微塑料豐度為13～501 個·m-3[4]，對我國海域進行調查發現，黃海表層水體中微塑料豐度為(0.330±0.278) 個·m-3[5]。檢出的微塑料主要成分為聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯和聚酯等[4-7]。

大量研究表明，微塑料能被浮游動物[8-9]、貝類[10-11]和魚類[12-13]等不同營養級海洋生物攝食并通過食物鏈傳遞[14-15]。微塑料被攝入后會造成生物體消化道的物理損傷[16]、攝食行為改變[17]以及誘發炎癥反應等[18-19]，對海洋生物存在潛在威脅。

浮游動物作為海洋食物網中的關鍵環節，在物質循環和能量傳遞過程中起著重要的作用，同時也影響污染物在食物鏈中的遷移[14,20]。野外調查發現，中國南海及黃海海域采集的浮游生物(橈足類、毛顎類和短尾類等)體內均有微塑料檢出，這表明，在自然環境中，浮游動物能夠攝入環境中的微塑料[21-22]。實驗室研究發現，北大西洋的多種浮游動物能夠攝入粒徑為1.7～30.6 μm的聚苯乙烯(PS)微粒，并通過“假排泄物”將PS微粒排出體外，暴露在濃度為7×103個·mL-1的PS溶液中的胸刺水蚤(Centropagestypicus)，對微藻的攝食顯著減少[23]。近期研究發現，鹵蟲(Artemiaparthenogenetica)幼體也可攝入濃度為1～1×105個·mL-1的10 μm的PS微粒，且PS微粒可在鹵蟲消化道內停留14 d以上[24]。

微塑料被浮游動物攝入體內后，會對其存活、生長發育及繁殖能力造成不利影響。日本虎斑猛水蚤(Tigriopusjaponicus)攝入粒徑為0.05～6 μm的PS微粒后，個體出現死亡和繁殖能力下降[25]；鹵蟲(A.parthenogenetica)攝入粒徑為10 μm的PS微粒后，會造成腸道上皮細胞損傷[24]；大型溞(Daphniamagna)攝入粒徑為100 nm的PS微粒后，生長發育過程受到抑制，繁殖能力下降[26]。目前，大多數研究主要集中在微塑料對海洋生物的毒性效應，但對于微塑料在浮游動物體內的毒動力學過程研究較少；因此，開展浮游生物對微塑料攝入和排出的動力學研究對評估微塑料的生態風險具有重要意義。

本研究使用海洋模式生物日本虎斑猛水蚤(T.japonicus)作為受試生物，探究了日本虎斑猛水蚤對10 μm PS微粒的攝入和排出過程，以及添加PS微粒對其攝食行為的影響，以期為科學評估微塑料的生態風險提供依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

熒光體式顯微鏡(Leica M205FA，德國)；熒光倒置顯微鏡(Leica DMI4000B，德國)。

熒光聚苯乙烯塑料微粒(10 μm)分散液購自美國Thermo Fisher公司，濃度為1.74×107個·mL-1[24]，濃硝酸(HNO3)為分析純，購自天津市科密歐化學試劑公司，人工海鹽購自天津中鹽海洋生物科學有限公司。

1.2 微藻培養

實驗選用牟氏角毛藻(Chaetocerosmuelleri)和小球藻(Chlorellasp.)，藻類培養條件為溫度(20±1) ℃，光照強度約2100 lux，光周期12 h(L)∶12 h(D)，培養基為f/2培養基。

1.3 受試生物

日本虎斑猛水蚤馴養理化條件：溫度(20±1) ℃，光照強度約2 100 lux，光周期12 h(L)∶12 h(D)，鹽度30.0±0.46，pH 8.2±0.12，溶解氧(DO)濃度(8.45±0.53) mg·L-1。以混合藻類投喂，餌料包括牟氏角毛藻和小球藻，投喂密度比例為1∶1，每3天投喂一次，投喂密度為1×106cells·mL-1。

1.4 實驗分組

本研究通過4個實驗探究了日本虎斑猛水蚤對PS微粒的攝入和排出的動力學過程及PS微粒的添加對其攝食行為的影響(表1)。實驗Ⅰ和實驗Ⅱ主要考察日本虎斑猛水蚤體內PS微粒的攝入量和殘留量隨時間變化情況，實驗Ⅲ考察了日本虎斑猛水蚤與PS微粒的相互作用，實驗Ⅳ考察了不同濃度PS微粒的添加對微藻生長的影響，以及濃度為1×103個·mL-1的PS微粒對日本虎斑猛水蚤對微藻攝食率的影響。

1.5 攝入(實驗Ⅰ)和排出(實驗Ⅱ)實驗

對日本虎斑猛水蚤的最低微塑料攝入濃度進行了預研究，結果表明，當PS微粒濃度<1×102個·mL-1時，在日本虎斑猛水蚤體內無PS微粒檢出，PS微粒濃度為1×103個·mL-1時，適于開展PS微粒在日本虎斑猛水蚤體內的富集和排出動力學研究，此濃度遠高于當前水環境中的微塑料檢出濃度[4-7]。

實驗暴露前，對熒光PS暴露溶液進行超聲處理，使用硝酸纖維素濾膜(0.45 μm，Sartorius ACN)進行抽濾，用熒光體式顯微鏡對PS微粒進行計數，從而確定PS溶液的實際暴露濃度。實驗Ⅰ、實驗Ⅱ和實驗Ⅳ中，在暴露前一天對日本虎斑猛水蚤投喂微藻，投喂密度為1×105cells·mL-1。實驗Ⅲ中，暴露前對日本虎斑猛水蚤進行饑餓處理24 h。

實驗Ⅰ中，根據暴露時長(0、3、6、9、12、24和48 h)設置7個實驗組，每組3個平行，每個平行中暴露溶液體積為20 mL，PS微粒的濃度為1×103個·mL-1，并加入10只齡期一致(蚤齡為(18±1) d)的日本虎斑猛水蚤，置于恒溫培養箱中培養，溫度(20±1) ℃，光照強度約2 100 lux，光周期12 h(L)∶12 h(D)，總暴露時長為48 h，暴露期間不喂食。分別于暴露0、3、6、9、12、24和48 h后，將每個平行中的10只日本虎斑猛水蚤取出，用人工海水沖洗3遍，置于20 mL玻璃閃爍瓶中，加入質量分數為65%的硝酸于40 ℃超聲40 min進行消解(熒光PS微粒回收率為100.0%±1.3%[27])。消解后，使用硝酸纖維素濾膜(0.45 μm，Sartorius ACN)抽濾，并在熒光體式顯微鏡下對PS微粒進行觀察和計數，從而計算日本虎斑猛水蚤對PS微粒的攝入量。

表1 實驗分組及聚苯乙烯(PS)微粒暴露濃度Table 1 Groups and concentrations of polystyrene (PS)

實驗Ⅱ中，設置6個實驗組(0、3、6、12、24和48 h)，每組3個平行，每個平行中10只日本虎斑猛水蚤，每個平行中加入清潔的人工海水20 mL。參照實驗Ⅰ，預先將齡期一致(蚤齡為(18±1) d)的日本虎斑猛水蚤暴露于濃度為1×103個·mL-1的PS微粒溶液中培養48 h，將日本虎斑猛水蚤用人工海水清洗3遍并轉移至實驗Ⅱ對應的實驗組中，繼續培養48 h，期間不喂食。培養條件與實驗Ⅰ一致，分別在轉移后的0、3、6、12、24和48 h，計算并觀察日本虎斑猛水蚤體內PS微粒的殘留量，方法與實驗Ⅰ一致。

1.6 日本虎斑猛水蚤與PS微粒的相互作用

實驗Ⅲ中，將饑餓處理24 h后的日本虎斑猛水蚤暴露于濃度為1×103個·mL-1的PS微粒溶液中，暴露期間不喂食。根據暴露時長(0、3、6、9、12、24和48 h)設置7個實驗組，每組3個平行，每個平行10只齡期一致(蚤齡為(18±1) d)的日本虎斑猛水蚤，培養條件與實驗Ⅰ一致。分別于暴露0、3、6、9、12、24和48 h后，將日本虎斑猛水蚤取出，使用人工海水沖洗3遍，用質量分數為4%的甲醛溶液固定，熒光倒置顯微鏡觀察PS微粒在日本虎斑猛水蚤體內分布情況和體表粘附情況。

1.7 微塑料對日本虎斑猛水蚤對微藻攝食率的影響(實驗Ⅳ)

實驗Ⅳ中，為了考察微塑料對微藻生長的影響，將牟氏角毛藻暴露在濃度分別為1×103個·mL-1和1×104個·mL-1的PS微粒溶液中。暴露0、24和48 h后，將暴露溶液轉移至閃爍瓶中顛倒搖勻，用移液槍吸取1 mL溶液置于離心管中，立即使用倒置顯微鏡和血球計數板對溶液中的微藻進行計數，計算溶液中微藻的密度。為了考察PS微粒對日本虎斑猛水蚤對微藻攝食率的影響，將日本虎斑猛水蚤暴露在濃度為1×103個·mL-1的PS微粒溶液中。暴露0、24和48 h后，將日本虎斑猛水蚤挑出，對暴露溶液中的微藻進行計數，并計算日本虎斑猛水蚤對微藻的攝食率，參考Frost[28]計算哲水蚤(Calanuspacificus)對微藻攝食率的方法。

1.8 統計分析

采用SPSS 16.0軟件對數據進行處理，實驗結果以平均值±標準差(mean±S.D.)表示，采用One-Way ANOVA(單因素方差分析)對實驗Ⅰ～Ⅱ中PS微粒的攝入量和殘留量間的差異進行顯著性檢驗，采用LSD法進行多重比較，對實驗Ⅳ中微藻密度間的差異和日本虎斑猛水蚤對微藻攝食率間的差異進行顯著性檢驗，P<0.05時認為具有顯著性差異。

2 結果(Results)

2.1 日本虎斑猛水蚤對PS的攝入及排出

采用熒光體式顯微鏡對熒光PS微粒的濃度進行定量分析，暴露溶液中熒光PS微粒實測濃度如表2所示。

表2 熒光PS微粒實測濃度(n=4)Table 2 Measured concentrations of fluorescently labelled PS (n=4)

實驗(Ⅰ～Ⅳ)中均未出現生物體死亡。攝入實驗(實驗Ⅰ)研究結果表明，日本虎斑猛水蚤暴露在濃度為1×103個·mL-1的PS微粒溶液中3 h后，可在日本虎斑猛水蚤體內檢出PS微粒，濃度為(0.67±0.21) 個·只-1，且PS微粒的攝入量隨著暴露時間增加呈現出逐漸增加的趨勢，24 h后達到最大值，為(7.00±2.44) 個·只-1，之后日本虎斑猛水蚤體內PS微粒的含量降低，在48 h后降至(3.20±1.93) 個·只-1(圖1(a))。

圖1 日本虎斑猛水蚤對熒光PS微粒的攝入情況(a)和暴露48 h后轉移至清潔海水中PS微粒的排出情況(b) (PS暴露初始濃度為1×103 個·mL-1)注：不同字母表明實驗組間存在顯著差異(P<0.05)。Fig. 1 The ingestion of fluorescent PS microspheres in T. japonicus (a) and the elimination of fluorescent PS microspheres by T. japonicus in clean seawater after pre-exposure to PS (concentrations 1×103 particles·mL-1) for 48 h (b)Note: Different letters indicate statistically significant differences (P<0.05).

排出實驗(實驗Ⅱ)研究結果表明，日本虎斑猛水蚤體內PS微粒的殘留量隨著時間增加呈現出逐漸降低的趨勢(圖1(b))，培養24 h后，即可排出體內96.33%±1.18%的PS微粒，48 h后，日本虎斑猛水蚤體內無PS微粒檢出。ANOVA統計分析結果表明，12、24和48 h的實驗組之間無顯著性差異(P>0.05)。

實驗Ⅲ通過熒光倒置顯微鏡對用質量分數為4%的甲醛固定的日本虎斑猛水蚤進行觀察，發現日本虎斑猛水蚤攝入的PS微粒主要分布在消化道中(圖2(a))，在其排泄物中也可觀察到PS微粒(圖2(c))，此外，PS微粒也會粘附在日本虎斑猛水蚤的外殼和附肢(游泳肢)上(圖2(b))。

圖2 熒光PS微粒在日本虎斑猛水蚤體內分布、體表粘附及排泄物中分布情況注：PS暴露初始濃度為1×103 個·mL-1，暴露時間為24 h。Fig. 2 Ingestion and conglutination of fluorescent PS microspheres in the gut, surface and feces of T. japonicusNote: The exposure concentration is 1×103 particles·mL-1; the exposure time is 24 h.

2.2 日本虎斑猛水蚤對微藻的攝食率

PS微粒的添加在一定程度上會對牟氏角毛藻的生長產生抑制作用。在PS微粒濃度為1×103個·mL-1的實驗組中，暴露24 h和48 h后，牟氏角毛藻的密度與對照組相比無顯著性差異(P>0.05)；在PS微粒濃度為1×104個·mL-1的實驗組中，暴露24 h和48 h后，牟氏角毛藻的密度與對照組相比分別降低了13.63%±8.72%和19.24%±1.26% (P<0.05)(圖3)。日本虎斑猛水蚤對微藻的攝食率實驗結果表明，在PS微粒濃度為1×103個·mL-1的實驗組中，暴露24 h和48 h后，日本虎斑猛水蚤對微藻的攝食率與對照組相比無顯著性差異(P>0.05)(圖4)。

圖3 不同濃度PS暴露組中微藻的密度注：*表明實驗組間存在顯著差異(P<0.05)。Fig. 3 The concentration of microalgae when exposed to PS microspheres at different concentrationsNote: *indicate statistically significant differences (P<0.05).

圖4 不同濃度PS暴露組中日本虎斑猛水蚤對微藻攝食率Fig. 4 The microalgae ingestion rates by T. japonicus when exposed to PS microspheres at different concentrations

3 討論(Discussion)

眾多研究表明，不同類別的浮游動物能夠攝入不同粒徑范圍的PS微粒。研究發現，鹵蟲(A.parthenogenetica)能夠攝入粒徑為1～20 μm的PS微粒[14]，海島哲水蚤(Calanushelgolandicus)能夠攝入粒徑為20 μm的PS微粒[20]，模糊網紋蚤(Ceriodaphniadubia)能攝入粒徑為1～5 μm的PS微粒[29]。本研究發現，日本虎斑猛水蚤能較快地攝入10 μm的PS微粒，暴露濃度為1×103個·mL-1時，暴露3 h后，即可在體內檢出。浮游動物對微塑料的攝入能力與微塑料的粒徑大小、暴露濃度及食物的供給有關。大型溞(D.magna)對PS微粒的攝入量隨著PS粒徑的增加而減小，攝入量與PS粒徑呈指數相關[30]；鹵蟲(A.parthenogenetica)對10 μm的PS微粒的攝入量隨著PS濃度和暴露時長的增加而增加[24]；提供藻類食物時，大型溞(D.magna)對2 μm的PS微粒的攝入量顯著降低，且隨著微藻密度增加，PS攝入量減少[31]。

生物體對微塑料的排出能力受物種種類、微塑料粒徑和食物的供給等因素的影響。1 μm和10 μm的PS微粒可在熱帶爪蟾(Xenopustropicalis)幼體的鰓和消化道中殘留6 d以上，且1 μm的PS微粒殘留量遠大于10 μm的PS微粒，食物的供給也會影響蝌蚪對微塑料的排出能力，缺乏食物的條件下，蝌蚪會攝入更多的PS微粒且很難將其排出[32]。本研究中的排出實驗Ⅱ的結果表明，日本虎斑猛水蚤能夠在3 h內開始排出體內的PS微粒，24 h后，可排出體內96.33%±1.18%的PS微粒，48 h后體內無熒光PS微粒檢出。這說明，日本虎斑猛水蚤能夠較快速地排出體內的PS微粒，但實驗室前期研究發現，10 μm的PS微粒可在鹵蟲體內停留14 d以上[24]，二者差異較大，因此，微塑料在不同生物體內的停留時間仍有待于進一步的研究。

微藻攝食率實驗Ⅳ結果表明，PS微粒的添加在一定程度上會對微藻的生長產生抑制作用。研究發現，5 μm PS微粒對蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)的生長產生抑制作用[33]。氨基修飾的2 μm PS微粒會顯著降低硅藻(Chaetocerosneogracile)細胞內酶的活性，并對硅藻的生長產生不利影響[34]。PS微粒濃度為1×103個·mL-1時，PS微粒對日本虎斑猛水蚤對微藻的攝食率無顯著影響(P>0.05)，這表明，在環境濃度下，微塑料對日本虎斑猛水蚤對微藻攝食率無顯著影響。當PS微粒濃度為1×104個·mL-1時，PS微粒抑制了微藻的生長，無法確定PS微粒是否對日本虎斑猛水蚤的攝食率產生影響。

微塑料被浮游動物攝入后，不僅會造成物理損傷，如機械損傷、消化道阻塞等，同時也會對浮游生物的生長發育繁殖造成不利的影響，造成生物體的生長發育遲緩，降低生物體的繁殖力，誘發炎癥反應等[18,20]。微塑料的毒性效應也與其大小及化學成分有關。研究發現，日本虎斑猛水蚤暴露于粒徑為0.05 μm的PS微粒溶液中，死亡率顯著高于0.5 μm和6 μm的PS微粒實驗組[25]。氨基修飾的PS微粒會改變鹵蟲體內基因的表達，抑制鹵蟲的生長發育，甚至導致個體死亡[35]，相較于未修飾的PS微粒，基團修飾的PS微粒對生物體毒性更大。

綜上所述，本文探究了日本虎斑猛水蚤成體對熒光PS微粒的攝入、排出動力學規律。結果表明，PS微粒能夠較快地被日本虎斑猛水蚤攝入和排出，且PS微粒濃度>1×104個·mL-1時，對牟氏角毛藻的生長產生了抑制作用。目前有關于微塑料在生物體內的毒動力學過程及致毒機理仍有待于更加廣泛和深入的研究。

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