納米氧化鋅對美國紅魚肝細胞的毒性效應及機制

朱躍驊，張劍，錢云霞

寧波大學海洋學院，寧波 315823

納米材料是指任何一維的幾何尺寸處于納米尺度(1～100 nm)的一種新型材料。其中，納米氧化鋅(ZnO NPs)因其非遷移性、熒光性、壓電性以及可吸收并散射紫外線等特性，使它在制作氣敏傳感器和藥物緩釋劑以及微電子、光催化降解等領域有著廣闊的應用前景和發展潛力[1-3]。同時，ZnO NPs的廣泛應用造成了它在環境中的濃度快速升高，顯著增加了它與水生生物及人類接觸的風險，這對生態環境，尤其是水環境[4]造成了極為嚴重的影響。

魚類是水環境中最為常見的脊椎動物，同我們人類息息相關，為了評估ZnO NPs對水環境中生物的毒性，已有許多學者通過斑馬魚(Barchydanioreriovar)進行了多項實驗。已有研究報道，ZnO NPs會推遲斑馬魚胚胎的發育[5]和孵化[6]；Zhao等[7]發現，ZnO NPs會下調斑馬魚活性氧相關基因Bcl2和Nqo1的表達水平，引起氧化應激和DNA損傷；Xiong等[8]發現，在可見光照射96 h后，ZnO NPs能誘導羥基自由基，從而導致斑馬魚肝臟發生嚴重的氧化應激。ZnO NPs在水體中引起的生物安全問題逐漸引起人們的極大關注[9]，而海洋作為納米顆粒的主要最終歸宿，目前關于ZnO NPs對海洋環境生物影響的研究卻很少。

美國紅魚(Sciaenopsocellatus)是一類廣溫、廣鹽性魚類，具有生長速度快、適應力強、食性廣泛、產量高和經濟效益顯著等優點，是重要的海水養殖品種。肝臟是脊椎動物機體新陳代謝的重要器官，能不斷地調整其細胞的生理狀態以適應環境變化[10]，研究表明，肝細胞能表達大部分肝臟功能[11]，而細胞模型的建立不僅可以減少試驗動物的使用量，而且具有操作簡便、可重復性高和可避免體內復雜因素干擾等優點[12]。所以本研究以美國紅魚的肝細胞作為模型來評估ZnO NPs的毒性，觀察在不同濃度的ZnO NPs處理后細胞的活性、吞噬量、氧化應激水平以及凋亡情況的改變，探究美國紅魚肝細胞在ZnO NPs處理后受到的毒性影響，為ZnO NPs對水生生物的影響提供理論依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

實驗所用美國紅魚購于浙江省寧波市路林市場，體重(500±75) g，游泳狀況良好，可正常攝食。ZnO NPs購于杭州大洋納米新材料有限公司。DEME高糖培養基、青鏈雙抗(penicillin-streptomycin liquid)和胎牛血清(FBS)購于Hyclone生物試劑公司。MTT和DCFH-DA干粉購于Sigma試劑公司；中性紅和細胞凋亡試劑盒購于碧云天試劑公司；D-Hanks溶液和紅細胞裂解液購于北京索萊寶生物公司，丙二醛(MDA)試劑盒購于南京建成生物研究所，其他試劑均為國產分析純。流式細胞儀(Gillios)購于美國貝克曼庫爾特公司。

ZnO NPs的懸液配制：ZnO NPs溶解于磷酸鹽緩沖液(PBS)，配制成終濃度為500 μg·mL-1的母液，121 ℃高溫高壓滅菌15 min，4 ℃保存。實驗前超聲30 min，用完全培養基(10%FBS、1%青鏈雙抗和DEME)稀釋[13]至不同濃度，現配現用。

1.2 紅魚肝原代細胞分離

將美國紅魚用3-氨基苯甲酸乙酯(10 mg·L-1)麻醉，尾部靜脈抽血后摘取肝臟，在無血清培養基(0.1%FBS、1%青鏈雙抗和DEME)中仔細去除血液和結締組織，剪碎，用PBS洗滌2次，再用2倍體積的胰蛋白酶(0.25%)消化8 min得到細胞懸液，通過100 μm篩網過濾后放入離心管，1 000 r·min-1離心2 min，然后按1∶3的體積比加入D-Hanks和紅細胞裂解液，1 000 r·min-1離心3 min，棄上清，加入等體積的D-HANKS溶液，進行梯度離心(1 000 r·min-11 min，500 r·min-11 min)，棄上清，加入完全培養基制成細胞懸液[14]，用0.4%的臺盼藍染色并計數。

用于細胞毒性測定的肝細胞，接種于96孔板中，每孔100 μL，每個濃度5個復孔，并用無菌PBS封邊，細胞濃度為1.5×106cells·mL-1，每個實驗重復3次。用于測定細胞對ZnO NPs的吞噬、胞內活性氧(ROS)含量以及細胞凋亡的肝細胞接種于6孔板中，每孔2 mL，每個濃度3個復孔，重復3次。

1.3 MTT檢測毒性

將肝細胞過夜培養后，棄去培養基，分別加入ZnO NPs濃度為12.5、25、37.5和50 μg·mL-1的完全培養基處理6、12和24 h(對照組不加ZnO NPs)。處理結束后，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg·mL-1)，孵育4 h。離心去上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)(國藥分析純)，置搖床上低速振蕩10 min。用酶標儀測量各孔的吸光值OD490 nm，計算細胞的存活率。細胞存活率(%)=(試驗組OD值-空白OD值)/(對照組OD值-空白OD值)×100%。

1.4 中性紅攝取法檢測毒性

細胞處理方法同1.3，按中性紅細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒的操作說明檢測肝細胞對中性紅的攝取。

1.5 細胞吞噬

根據Suzuki等[15]的方法采用流式細胞儀測量細胞對納米顆粒的吞噬，當細胞攝取非熒光的納米顆粒時，前向散射(FSC)光線保持恒定的細胞，其側向散射(SSC)光的強度會與納米顆粒的濃度成比例增加。將肝細胞在含有不同濃度(12.5、25和50 μg·mL-1)的ZnO NPs完全培養基中培養6 h。處理結束后，用0.05%胰蛋白酶將細胞消化，收集至離心管中，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清液后重懸于0.5 mL的PBS中，用流式細胞儀進行檢測(488 nm激光器)。

1.6 氧化應激實驗

1.6.1 細胞內ROS含量檢測

采用流式細胞儀檢測肝細胞中的活性氧[16]，肝細胞處理方法同1.5，6 h后用含有DCFH-DA探針的無血清培養基孵育20 min，再用無血清培養基洗滌細胞，洗去未進入細胞內的DCFH-DA探針，在避光條件下收集細胞，用流式細胞儀(488 nm激發波長，525 nm發射波長)檢測細胞內活性氧含量。

1.6.2 MDA含量檢測

濃度為1×107cells·mL-1的肝細胞溶液于細胞培養瓶過夜培養后，處理方法同1.5，培養6 h后將細胞消化，收集至1.5 mL離心管中，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，將沉淀破碎，考馬斯亮藍法測定蛋白含量，用試劑盒進行MDA含量的檢測。

1.7 細胞凋亡

1.7.1 Hoechst 33342染色

將干凈的蓋玻片在70%乙醇中浸泡后，用無菌的PBS洗滌3遍，再用完全培養基洗滌一遍。將蓋玻片置于6孔板內，加入細胞懸液(濃度5×106cells·mL-1)。細胞經50 μg·mL-1ZnO NPs處理6 h后，按照Hoechst 33342染色試劑盒的說明操作，用熒光顯微鏡觀察肝細胞的凋亡現象。

1.7.2 Annexin V-FITC/PI染色

肝細胞處理方法方式同1.5，用細胞凋亡陽性質控液處理正常肝細胞作為空白，FITC和PI單染。收集處理的肝細胞用FITC和PI進行雙染，流式細胞儀檢測肝細胞凋亡率的改變。

1.8 實驗數據處理

實驗數據用平均值±標準誤(Mean±SE)表示。采用SPSS19.0軟件對數據進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，以Duncan新復極差法作多重比較(P<0.05)。

2 結果(Results)

2.1 細胞毒性實驗

美國紅魚原代肝細胞經過不同濃度的ZnO NPs處理6、12和24 h后，MTT法檢測細胞毒性結果如圖1(a)所示，細胞經過ZnO NPs處理6 h后，12.5 μg·mL-1和25 μg·mL-1實驗組的細胞存活率開始減少，但是差異不顯著(P>0.05)，而37.5 μg·mL-1和50 μg·mL-1實驗組降低至對照組的73%和69%，有顯著差異(P<0.05)；處理12 h后，25、37.5和50 μg·mL-1實驗組細胞存活率顯著低于對照組(P<0.05)，分別為對照組的71%、52%和40%；處理24 h后，這3個實驗組的細胞存活率只有對照組的58%、34%和17%；而12.5 μg·mL-1實驗組各個時間點的細胞存活率在各處理時間點無顯著變化。

通過中性紅實驗(NRU)測定細胞毒性的結果如圖1(b)所示。ZnO NPs濃度為12.5 μg·mL-1的實驗組，6 h和12 h組細胞存活率與對照組無顯著差異(P<0.05)，24 h組顯著低于對照組；25 μg·mL-1ZnO NPs的實驗組中，細胞經12 h和24 h作用后，細胞存活率顯著低于對照組(P<0.05)，但12 h與24 h兩組間未有顯著性差異(P>0.05)；ZnO NPs濃度為37.5 μg·mL-1和50 μg·mL-1的實驗組中，6 h組細胞存活率顯著低于對照組(P<0.05)，12 h組又顯著低于6 h組(P<0.05)，24 h和12 h無顯著差異(P>0.05)。

圖1 ZnO NPs對美國紅魚肝細胞的毒性作用注：相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；n=3，下同。Fig. 1 Cytotoxic effects of ZnO NPs in hepatocytes of Sciaenops ocellatusNote: The same small letter superscripts mean no significant difference (P>0.05); different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05); the same below.

以上2個實驗均顯示ZnO NPs產生的細胞毒性對濃度和時間具有依賴性。

2.2 肝細胞對ZnO NPs的吞噬

美國紅魚的肝細胞通過不同濃度的ZnO NPs處理6 h后，用流式細胞儀對細胞內含物的檢測結果如圖2所示。與對照組相比，ZnO NPs濃度為12.5 μg·mL-1和25 μg·mL-1的實驗組中，細胞的SSC-A Mean值有少許上升，但與對照組相比差異不顯著(P>0.05)，而50 μg·mL-1實驗組較其他3組有顯著性(P<0.05)上升，表明細胞在50 μg·mL-1ZnO NPs處理6 h后吞噬量顯著(P<0.05)增加。

圖2 美國紅魚肝細胞對ZnO NPs的攝取Fig. 2 Cellular uptake of ZnO NPs in hepatocytes of Sciaenops ocellatus

2.3 氧化應激實驗

美國紅魚肝細胞經不同濃度ZnO NPs處理6 h后細胞內的ROS量和脂質過氧化水平如表1所示。結果表明，12.5 μg·mL-1的實驗組細胞內ROS含量與對照組相比差異不顯著(P>0.05)，而25 μg·mL-1和50 μg·mL-1實驗組為對照組的354%和719%，較對照組有顯著升高(P<0.05)。只有50 μg·mL-1實驗組細胞內MDA含量顯著高于(P<0.05)對照組。

表1 ZnO NPs處理6 h后細胞內活性氧(ROS)產生量和脂質過氧化水平Table 1 Effect of ZnO NPs treatment for 6 h on intracellular reactive oxygen species (ROS) production and lipid peroxidation

2.4 細胞凋亡

Hoechst 33342在凋亡細胞中的熒光強度增高的機制與凋亡細胞膜通透性發生改變有關，凋亡細胞早期細胞膜的完整性沒有明顯改變，但細胞膜的通透性已有增強，因此，進入凋亡細胞中的Hoechst 33342比正常細胞的多，故通過此方法可定性檢測ZnO NPs對美國紅魚肝細胞的凋亡影響。由圖3可知，對照組細胞的肝細胞多呈細微的低藍色，而且密度稀疏，但經50 μg·mL-1ZnONPs處理6 h后的細胞由于細胞膜通透性的改變，Hoechst 33342染料進入，細胞呈現高藍色，且密度大大增加。

用不同濃度(12.5、25和50 μg·mL-1)ZnO NPs處理美國紅魚肝細胞6 h后，Annexin V-FITC/PI染色的流式分析結果如圖4和表2所示。結果表明，ZnO NPs濃度為12.5 μg·mL-1實驗組細胞的凋亡率(17.57%)與對照組相比無顯著性差異(P>0.05)，25 μg·mL-1和50 μg·mL-1組細胞凋亡率達32.8%和60.8%，顯著性高于對照組(P<0.05)。

3 討論(Discussion)

本文探究了ZnO NPs對美國紅魚肝細胞的毒性作用，而一些常用的細胞毒性的測試系統都已有研究[17-18]，因此，納米材料的細胞毒性可用2個或多個獨立的測試系統進行評估，以驗證研究結果。筆者采用MTT法和NRU法測定肝細胞經過不同ZnO NPs濃度處理不同時間后的細胞存活率。結果表明，37.5 μg·mL-1ZnO NPs處理肝細胞6 h后顯示出明顯的細胞毒性。細胞存活率隨著ZnO NPs的濃度增加和暴露時間的延長而降低，即ZnO NPs的毒性存在濃度和時間-效應依賴關系，這同ZnO NPs處理THP-1巨噬細胞后的狀況一致[19]，并與ZnO NPs處理鯰魚(Silurusasotus)原代肝細胞[20]和虹鱒魚(Oncorhynchusmykiss)肝瘤細胞RTH-149[21]的結果相類似。本研究中，12.5 μg·mL-1ZnO NPs作用24 h后細胞存活率與對照組相比沒有明顯變化，出現急性毒性效應的初始濃度為25 μg·mL-1，這與對鯰魚和虹鱒魚的研究結果一致[20-21]。

圖3 Hoechst 33342染色后細胞的熒光圖像注：(a)對照組；(b)ZnO NPs(50 μg·mL-1)處理組。Fig. 3 Fluorescence images of cells stained with Hoechst 33342Note: (a) control; (b) ZnO NPs (50 μg·mL-1) treatment group.

圖4 Annexin V-FITC/PI染色美國紅魚肝細胞的流式細胞術分析Fig. 4 Flow cytometric analysis of Annexin V-FITC/PI stained hepatocytes of Sciaenops ocellatus

表2 ZnO NPs誘導美國紅魚肝細胞凋亡Table 2 ZnO NPs induced apoptosis in hepatocytes of Sciaenops ocellatus

ZnO NPs在環境中不可溶，筆者在實驗中發現不同濃度ZnO NPs作用后，細胞中的內含物顆粒指標(SSC)會出現顯著性(P<0.05)增加，這表明，細胞會對環境中這種不溶性顆粒進行吞噬。進一步分析表明，細胞存活率與SSC值呈負相關(r=-0.721)，說明ZnO NPs作為一種外源物，在進入生物體內后會被肝細胞識別，在產生一些免疫應激的同時也會被細胞吞噬，并長時間積累在肝臟等器官內。在這個過程中，免疫系統的過度應激以及納米材料在器官中的積累，都可能會對生物體產生較大的毒性。

氧化應激指的是機體在遭受各種有害刺激時，活性氧自由基和活性氮自由基等高活性分子大量產生并積累，超過抗氧化防御系統的清除能力，即氧化系統和抗氧化系統失衡[22]，從而引發細胞損傷，導致機體組織損傷，如脂質過氧化、酶失活和DNA斷裂等。氧化應激通常被認為是ZnO NPs引發生物體細胞損傷的基本機制之一[23-24]。ZnO NPs的化學特征和表面效應使其在表面可自發產生ROS，同時還可與細胞組分發生相互作用，導致自由基的產生。在本研究中，肝細胞在含ZnO NPs的培養基中暴露6 h后，25 μg·mL-1和50 μg·mL-1組細胞內的ROS含量顯著增加(P<0.05)，該結果與在人淋巴母細胞(WIL2-NS)[23]和原代小鼠胚胎成纖維細胞[24]中的研究結果一致，表明細胞內的ROS含量增加也是ZnO NPs對魚類肝細胞產生毒性的原因。

MDA是生物膜中多種不飽和脂肪酸在自由基攻擊下形成的脂質過氧化產物，其含量變化可反映出機體損傷的程度[25]，結果表明，50 μg·mL-1實驗組紅魚肝細胞中的MDA含量顯著高于對照組(P<0.05)，表明細胞受ZnO NPs的作用后產生過多的自由基，而這些自由基則攻擊細胞膜中膜脂的不飽和脂肪酸，從而破壞細胞膜的完整性，擾亂細胞功能，進而產生過多的MDA。

筆者通過形態學觀察到經過ZnO NPs處理后細胞發生凋亡，25 μg·mL-1實驗組的細胞凋亡率較對照組顯著增加(P<0.05)，證明了ZnO NPs引起的細胞死亡模式是細胞凋亡。之前有研究表明，對結腸癌細胞[26]、小鼠表皮正常細胞[27]和人體肝癌細胞HepG2[28]進行ZnO NPs處理后，誘發細胞的氧化應激是造成毒性效應的關鍵，其產生的ROS導致自由基的過量堆積而線粒體作為細胞內主要的ROS發生器，通常是高濃度ROS攻擊的目標，常常產生有害的結果，例如線粒體DNA受到氧化損傷[29]從而造成細胞死亡。本實驗中發現，細胞內的ROS含量隨ZnO NPs濃度增加而逐漸增加，同時細胞凋亡率也隨之升高，與上述文獻的研究結果類似，由此推斷ZnO NPs引起的細胞氧化應激是誘導美國紅魚肝細胞死亡的主要方式。

綜上所述，美國紅魚肝細胞經ZnO NPs處理后存活率下降，細胞對ZnO NPs攝取也隨濃度的升高而升高，同時伴隨ROS和MDA的含量增加，最后引起細胞凋亡。

致謝：感謝寧波海洋漁業研究院申屠紀康老師為研究提供試驗場地。

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