芽孢桿菌糖代謝操縱子及其阻遏機制

摘要：葡萄糖作為一種速效碳源，是大多數工業微生物包括芽孢桿菌優先利用的碳源。其分解代謝物會抑制其他糖代謝相關的基因表達，從而無法利用非速效碳源，這種現象被稱為碳代謝物阻遏效應，是細菌應用于工業化生產的一大難題。這種效應在革蘭氏陽性細菌中主要是由CcpA蛋白調控的。本綜述介紹了目前對這一現象的認識及未來的研究方向。

關鍵詞：芽孢桿菌；糖代謝；阻遏機制

芽孢桿菌（Bacillus）為革蘭氏陽性原核細菌，普遍存在于自然環境中。在土壤、哺乳動物的糞便、農產品、鳥類羽毛中是占據主導優勢的微生物。由于生存環境多變且差異較大，細胞均由復雜的代謝調控網絡來適應各種不良條件，如高溫、饑餓、酸堿、化合物變化引起的滲透壓變化等。不僅如此，芽孢桿菌還可以形成芽孢來抵御惡劣的生存環境，在生存條件惡劣、營養條件缺乏時，細胞內會形成抗逆性強的芽孢休眠體，一旦轉至營養豐富的環境中，處于休眠狀態的菌群會迅速繁殖，重新長成一個細菌。

芽孢桿菌由于其酶系豐富，生長速率適中，蛋白折疊充分，具有很多其他工業菌種沒有的優勢，被作為同源或異源表達的平臺，是優良的工業微生物菌株，在世界上被廣泛應用于生產淀粉酶、堿性蛋白酶和某些抗生素。其中地衣芽孢桿菌是嗜溫菌，在40-50℃下仍能較好的生長；在發酵過程中可以分泌肽類物質抑制其他細菌、真菌的生長，因此不易染菌；該菌自身酶系比較豐富、酶的產量比其他水平較高，其胞外蛋白分泌量可達枯草芽孢桿菌的2.4-2.6倍；該菌被稱為整腸生，因其對氧氣需求量高，可以在人、動物的腸道中迅速奪取氧氣，以保證腸道中厭氧菌群的平衡，從而維護腸道的生態平衡；此外，該菌被認定為食品安全級菌株 （Generally Recognized As Safe，GRAS），至今已有40多年的歷史。

盡管存在這些優勢，地衣芽孢桿菌中仍有很多未知的特性有待考察，其潛力仍需繼續挖掘。地衣芽孢桿菌主要分泌的酶是生長相關酶，如蛋白酶和淀粉酶，但這種其適應自身生長的機制并不適用于酶生產的工業過程。對于工業生產來說，菌株應以最低的資源消耗包括最低的生物量的積累最大限度地增加酶的表達。野生型地衣芽孢桿菌自身會在生長后期表達多種蛋白酶基因，其中編碼胞外堿性絲氨酸蛋白酶基因 （aprE）最為常見。而其分泌至特質制培養基中的蛋白酶，可能會對已表達的目標蛋白產生一定的降解作用。此外，還有報道指出，當地衣芽孢桿菌作為宿主進行外源蛋白的表達時，還存在著產量低等問題。比如本研究采用的是α-淀粉酶基因作為報告基因，而α-淀粉酶是對菌體本身有一定毒性的。

地衣芽孢桿菌在工業化生產上的應用，主要是采用組成型表達機制來合成其內源性代謝產物。一方面，組成型表達機制適用于宿主內源基因的高效表達，且不需要添加誘導劑；但另一方面，其表達量受菌體生長影響，不易控制，在生長早期，目標蛋白的大量表達對細胞生長有不利影響，所以當表達的目的蛋白對菌體有害時，其可能會影響菌體的正常生長代謝，甚至毒害菌體而威脅菌體生存，以致蛋白的表達量極低。由于當前對該菌株誘導表達系統的認識僅停留在解除效應物阻遏的開關機制，其在發酵過程中的各類影響因素尚不清楚，所以地衣芽孢桿菌在應用上不如已被充分研究的大腸桿菌和酵母，其優勢尚未良好地發揮。誘導表達系統將酶的生產與細胞生長分開，可以解決上述的這些問題，開發各種誘導表達系統可以大大拓寬這種優勢菌種的應用范圍。

1. 木糖操縱子的特性

在對芽孢桿菌研究的過程中發現它可以利用木糖，進一步在其胞內發現了木糖運輸系統及代謝途徑。地衣芽孢桿菌中存在的木糖運輸途徑為ABC運輸系統：以水解ATP得到的能量作為運輸動力，通過與木糖專一性結合的介導蛋白完成運輸。木糖進入枯草芽孢桿菌細胞內，在木糖異構酶（XylA）的作用下轉變為木酮糖，在木酮糖激酶（XylB）的催化作用下，進一步生成5-磷酸-木酮糖，5-磷酸-木酮糖經由磷酸戊糖途徑進入糖代謝途徑。

目前，研究較為透徹的木糖操縱子有兩種，分別來源于枯草芽孢桿菌和大腸桿菌。D-木糖操縱子位于大腸桿菌染色體glyS位點附近，XylA的結構基因編碼440個氨基酸，另外還有XylB、XylT和XylR三個讀碼框。大腸桿菌兩個啟動子PA、PF的轉錄翻譯均受木糖誘導，同時也受葡萄糖降解的抑制。XylR本身帶有弱啟動子且處于xylF（木糖結合蛋白基因）、xylG（ATP結合蛋白基因）、xylH（木糖轉運蛋白基因）下游，不受木糖和葡萄糖降解的調控，xylR生產的阻遏蛋白能夠正向調節xylAB的表達。枯草芽孢桿菌的xyl操縱子位于染色體168度，屬于強啟動子。xylR位于染色體162度，該基因編碼木糖啟動子的阻遏蛋白，與xylA相鄰但轉錄方向正好相反。枯草芽孢桿菌木糖操縱子有兩個調控元件OL和OR，這兩個調控元件相互串聯并交錯重疊，阻遏蛋白能同時分別與這兩個調控元件結合，實現對xyl操縱子的負調控。添加木糖后，阻遏蛋白從與xylO的復合物中分離，從而使xylA、xylB一系列基因得以轉錄。經研究發現，葡萄糖和果糖的存在會抑制木糖的誘導作用；而葡萄糖-6-磷酸會使XylR與xylO結合更緊密，是一種輔阻遏物。此外，xyl操縱子還受CCR效應的影響：在葡萄糖與木糖同時存在的條件下，微生物優先利用葡萄糖，葡萄糖耗盡時激活木糖利用基因。枯草芽孢桿菌的木糖特異性轉運蛋白位于cre之后，葡萄糖存在時CcpA與cre緊密結合，從而影響木糖的利用，同樣葡萄糖的存在也會影響木糖操縱子的作用。

2. 甘露糖操縱子的特性

目前已有研究的是枯草芽孢桿菌的甘露糖操縱子，該操縱子由三個基因組成，分別是manP，manA和yjdF，它們負責甘露糖的運輸和利用。在上游和與甘露糖操縱子相同的方向上調節基因ManR編碼甘露糖操縱子的轉錄激活因子。甘露糖誘導著甘露糖操縱子的轉錄和manR的轉錄。甘露糖的存在導致來自manP啟動子（PmanP）的lacZ表達增加了4至7倍，來自manR啟動子（PmanR）的lacZ表達增加了3倍。

D-甘露糖是一種2-二聚體葡萄糖，存在于甘露聚糖和異甘露聚糖多糖、糖蛋白和許多其他糖結合物中。許多細菌可以使用D-甘露糖作為碳源。在枯草芽孢桿菌中，甘露糖分兩步進入碳水化合物代謝。首先，它通過甘露糖特異性PTS轉運體在攝取過程中磷酸化到甘露糖-6-磷酸。其次，通過甘露糖-6-磷酸異構酶將其轉化為果糖-6-磷酸。甘露糖操縱子中的三個基因已經被鑒定。第一個基因manP編碼一個假定的PTS甘露糖特異性酶IIBCA組分（轉運蛋白），它與支原體的果糖特異性過氧化物酶具有明顯的序列相似性，因此屬于Fru過氧化物酶家族。第二個基因manA編碼甘露糖-6-磷酸異構酶，而第三個基因yjdF的功能尚不清楚。據推測，上游和與甘露糖操縱子相同的方向是一個調節基因manR編碼甘露糖操縱子的激活物。利用蛋白質序列比對N端DNA結合基序，鑒定出兩個PRDs和一個EIIAEII B結構域，表明manR是一種含有PRD的激活劑，類似于嗜硬脂菌的MTLR。

3. 地衣芽孢桿菌中鼠李糖操縱子的特性

鼠李糖操縱子作為一種誘導表達元件，在地衣芽孢桿菌中可以用來介導異源基因的表達。地衣芽孢桿菌中的鼠李糖啟動子，是由六個結構基因和一個啟動子（ori）組成，其結構基因分別為轉醛酶（rhaA），鼠李糖脫氫酶（rhaD），鼠李糖轉運蛋白（rhaB，rhaC，rhaE）和激活蛋白（rhaM）。轉運蛋白基因rhaB，rhaC，rhaE分別編碼鼠李糖PTS系統中的蛋白EIIC、EIIB和EIIA，負責轉運鼠李糖。

糖特異性膜結合酶I I復合物（EII），起到了特定糖的運輸和磷酸化作用。EII復合物通常由三個功能域組成，融合在單個蛋白或被分離的蛋白質上，其中IIA域（以前稱為EIII）和IIB域分別具有第一和第二磷酸化位點，而IIC域形成跨膜通道和糖結合位點。rhaM基因表達的是一種DNA結合蛋白，已被證明是激活操縱子所必需的蛋白。

4. CcpA蛋白的作用機理

4.1 碳代謝阻遏（CCR效應）

Jacques Monod等人在1942年觀察到，大腸桿菌E. coli在葡萄糖和半乳糖同時作為碳源的情況下，大腸桿菌會優先利用葡萄糖作為能源物質，當葡萄糖消耗后才開始利用半乳糖，即菌體的二次生長現象。之后許多研究結論表明，當葡萄糖存在時，其分解代謝物會抑制與其他糖代謝相關的基因表達，從而利用速效碳源，這種現象被稱為碳代謝物阻遏（CCR）效應。這種現象在細菌中普遍存在，是細菌應用于工業化生產的一大難題。而這種效應主要依賴于CcpA蛋白。

CCR效應的組成部分為一個特有的順式活性序列（cre位點：catabolite responsive element分解代謝反應元件）和一種反式作用蛋白（CcpA蛋白：catabolite control protein代謝控制蛋白），CcpA蛋白識別并與cre元件相互作用以負性調節相應基因的轉錄。芽孢桿菌中的典型cre序列已被確定為TGWAANCGNTNWCA，其中N代表任意堿基，W代表堿基A或者堿基T。這種結合序列通常存在與許多與碳代謝相關的基因的N末端序列處。

4.2 CcpA蛋白作用機制

CcpA是一種轉錄調控因子，與芽孢桿菌中某些非速效碳源代謝基因如木糖操縱子、甘露醇操縱子、山梨醇操縱子上的特定位點結合進而控制該基因的表達。早在1995年，Kim等人已在枯草芽孢桿菌中，通過足跡法和凝膠遷移阻滯（EMSA）實驗證明了CcpA蛋白可以在共阻遏物P-（Ser）-Hpr不存在的情況下與淀粉酶編碼基因amyE啟動子區域處的cre位點amyO結合。但之后的相關研究表明，在多數情況下，CcpA蛋白和cre位點的結合是需要共阻遏蛋白參與的。共阻遏HPr蛋白（histidine-phosphoryl protein）有兩個磷酸化位點：組氨酸殘基和絲氨酸殘基。該蛋白的HPr蛋白的絲氨酸殘基隨后在Hpr 激酶/磷酸酯酶（HPrK/ P：Hpr kinase/phosphoesterase）的催化下被磷酸化，形成P-（Ser）-HPr，并與轉錄調控因子CcpA形成復合體，而組氨酸殘基在磷酸轉移酶系統（PTS ：phosphotransferase system）中的酶I（EI：enzyme I）催化下以磷酸烯醇式丙酮酸（PEP： phosphoenolpyruvate）為底物進行磷酸化，并將磷酸基傳遞給負責葡萄磷酸化和糖轉運的PTS系統；參與CCR效應。

HPrK/P的活性受胞內能荷水平（ATP/Pi）以及葡萄糖代謝產物比如1，6-二磷酸果糖（F-BP）、6-磷酸葡萄糖（G-6-P）水平的影響。當葡萄糖等速效碳源存在時，在胞內高能荷水平上升和葡萄糖代謝生成產物這兩種條件下，HPrK/P的激酶活性被激活，HPr的絲氨酸殘基在催化下進行磷酸化，然后P-（Ser）-HPr與CcpA結合形成復合物，然后再與非速效碳源代謝基因的cre位點結合，抑制其轉錄及翻譯。

作者簡介：

樓志華（1981.08-）男，漢族，浙江省義烏市人，碩士；職稱：中級工程師；研究方向：發酵工程、生物分離純化、酶工程。