響應面優化黑曲霉生物發酵花生粕脫除黃曲霉毒素研究

邱天宇，王海鳴，朱 瑜，楊 陽，紀 劍，孫秀蘭

（1.江南大學食品學院，江蘇無錫 214122；2.廣州廣電計量檢測股份有限公司，廣東廣州 510665；3.漢中市質量技術檢驗檢測中心，陜西漢中 723000；4.新疆農業大學 食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊 830052）

0 引言

黃曲霉毒素是曲霉屬真菌的次生代謝產物，對人類和動物危害顯著[1-2]，對食品的污染是食品安全領域最棘手的問題之一[3-4]。黃曲霉毒素主要分為4 種，分別為黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2，這4 種毒素化學結構相似（如圖1），致毒基團大致相同[5]，其中以AFB1毒性和致癌性最強[6-7]。并且，AFB1具有較高的分解溫度，在常規食品加工溫度范圍內（80～121 ℃） 時被認為是熱穩定的[8]。多種谷物都易感染曲霉，尤其花生[9-10]。花生粕作為花生榨油的副產品，產量高且蛋白質含量豐富，可利用其成為一種蛋白質功能性食品[11-13]，但由于其極易受霉菌污染，從而限制了應用[14-15]。黃曲霉毒素殘留于花生粕中導致其污染率較高，應盡可能降低其中黃曲霉毒素含量。然而，目前較多農產品中存在著多種黃曲霉毒素，因此試驗通過優化生物發酵工藝條件盡可能降低花生粕中4 種黃曲霉素含量。

AFB1(a)，AFB2(b)，AFG1(c)，AFG2(d)化學結構圖見圖1。

生物發酵是一種易于實施和較為經濟的生物技術，不僅在農產品應用中占據著重要地位[16-17]，而且在脫除粕類有毒物質方面也有著廣泛的應用[18-20]。降解菌株FS10 已證明其生物安全性[21]，不僅表現出優異的AFB1降解能力，而且有望作為工業發酵菌株在食品工業中發揮作用。

利用黑曲霉生物發酵花生粕的方法有效脫除花生粕中AFB1，AFB2，AFG1，AFG24 種黃曲霉毒素，研究接種量、發酵溫度、發酵時間、料液比4 個因素對花生粕中黃曲霉毒素的脫除，采用響應面法對其中AFB1和總AFT（AFB1+AFB2+AFG1+AFG2） 脫除率進行優化，通過對發酵條件的優化發現該黑曲霉對4 種黃曲霉毒素的脫除有著顯著效果。

1 材料與方法

1.1 試劑與培養基

AFB1，AFB2，AFG1，AFG2標準品，純度為99.9%，美國Sigma 公司提供；甲醇、乙腈（色譜純），美國TEDIA 公司提供；硫酸鎂等化學純試劑，上海國藥集團化學試劑有限公司提供。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA 培養基）：馬鈴薯300 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，氯霉素0.1 g，蒸餾水1 L，于121 ℃下高壓滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

WATERS MALDI SYNAPT Q-TOF MS，美國沃特世公司產品；VB-40 型立式高溫高壓滅菌鍋，德國SYSTEC 產品；BSC-1300 型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司產品；SHP-150 型生化培養箱，上海森信實驗儀器有限公司產品；電熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司產品；THZ-D 型臺式恒溫振蕩器，上海百典儀器設備有限公司產品；EX-OHOUS 型電子天平、旋渦振蕩儀，美國奧豪斯公司產品；Scientz-10N 型臺式冷凍干燥機、Scientz-10LS 型真空離心濃縮儀、SB-5200DT 型超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司產品；Eppendorf 型離心機，德國艾本德公司產品；Milli-Q型超純水儀，美國Millipore 公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 黑曲霉及FS10 孢子懸浮液的制備

從醬醅中篩選出一株具有降解黃曲霉毒素能力的FS10 黑曲霉菌株，保藏于中國典型培養物保藏中心，編號為CCTCC NO:M2013703。從-80 ℃取出黑曲霉FS10 復蘇，接種于種子培養基，于28 ℃下培養7 d，然后用無菌生理鹽水（含0.05%吐溫-80） 將孢子洗下，調整孢子含量為1×106CFU/mL，備用。

1.3.2 生物發酵

將花生粕粉碎，過40 目篩后混合均勻收集樣品花生粕，備用。利用GB/T 14699.1—2005 方法采樣并稱取花生粕分裝于50 mL 三角錐形瓶中，4 層紗布報紙封口，進行121 ℃，20 min 滅菌處理。

將滅菌處理過的花生粕轉移至發酵容器中，加入無菌水至一定料液比（花生粕質量與無菌水體積的比值，g/mL），加入FS10 孢子懸浮液至一定接種量（菌液體積與花生粕質量的百分比），攪拌均勻后于一定溫度下恒溫發酵，分別在發酵后一定時間取樣。

1.3.3 AFB1，AFB2，AFG1，AFG24 種黃曲霉毒素的測定

收集發酵完成的樣品，干燥后分別將每份花生粕導入離心管內，加入乙腈-水溶液（70+30） 進行提取并沖洗發酵容器一并導入離心管內，避免因粕中毒素分布不均對試驗結果的影響，混勻后超聲處理10 min，振蕩30 min，以轉速8 000 r/min 離心10 min，取過濾后上清液過固相凈化柱，收集液體后進行冷凍濃縮，用甲醇-水溶液（50+50） 復溶過濾膜后，上LC-MS/MS 檢測。

取無菌花生粕樣品，該組為無菌對照組，按上述方法提取毒素、檢測。

配制黃曲霉毒素AFB1，AFB2，AFG1，AFG2混標：質量濃度梯度為0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0 ng/mL 的系列標準溶液。

1.3.4 色譜條件

色譜條件：色譜柱為BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流動相A 為乙腈，B 為甲酸銨溶液，柱溫45 ℃，流速0.3 mL/min，進樣量5 μL。

梯度洗脫見表1。

表1 梯度洗脫

質譜條件：離子方式ESI+，毛細管電壓3.50 kV，錐孔電壓30 V，離子源溫度110 ℃，脫溶劑氣溫度400 ℃，流速700 lit/hr；錐形氣流50 lit/hr，碰撞能量6 eV，質量范圍20～800 m/z，探測器電壓1 800 eV，碰撞氣體流量0.15 mL/min；多反應監測模式（MRM）。

1.3.5 單因素試驗

以AFB1，AFB2，AFG1，AFG2脫 除 率 為 指 標，控制孢子懸浮液含量為1×106CFU/mL，分別對接種量1%，5%，10%，15%，20%；發酵溫度20，25，30，35，40 ℃；發酵時間24，36，48，60，72 h；料液比1∶0，1∶0.5，1∶1.0，1∶1.5，1∶2.0 進行單因素試驗，確定各因素對黃曲霉毒素脫除情況的影響。

1.3.6 響應面法因素水平設計

根據單因素試驗結果，利用Box-behnken 設計方法，選擇接種量（A）、發酵溫度（B）、發酵時間（C）、料液比（D） 作為4 個因素，以AFB1和總AFT脫除率作為響應值進行響應面優化設計。

1.4 數據處理

所有試驗均重復3 次，采用SPSS19.0、Origin 2018、Design Expert 10 軟件對數據進行處理分析及圖像繪制。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 接種量對4 種黃曲霉毒素毒素脫除率的影響

在孢子懸浮液含量為1×106CFU/mL，料液比1∶1，培養溫度30 ℃，發酵時間48 h 條件下，研究接種量分別為1%，5%，10%，15%，20%對4 種黃曲霉毒素脫除效果。

接種量對黑曲霉脫除4 種黃曲霉毒素的影響見圖2。

不同接種量對于黑曲霉脫除花生粕中的黃曲霉毒素有著重要影響，接種量過小或過大均不利于發酵的進行。圖2 表明了不同接種量對脫除4 種黃曲霉毒素的影響結果，在接種量為15%，20%時，AFB1，AFB2，AFG2脫除率都比較高，在接種量為5%～15%時AFG1脫除率較為穩定，但接種量為20%時，AFG1、AFG2脫除率有明顯下降現象，推測AFG1，AFG2是中間降解產物的可能，仍需進一步研究。

2.1.2 發酵溫度對4 種黃曲霉毒素毒素脫除率影響

在孢子懸浮液含量為1×106CFU/mL，料液比1∶1，接種量10%，發酵時間48 h 條件下，研究發酵溫度分別為20，25，30，35，40 ℃對4 種黃曲霉毒素脫除率影響。

發酵溫度對黑曲霉脫除4 種黃曲霉毒素的影響見圖3。

不同溫度會對微生物生命活動產生極大的影響，且對同一微生物而言，微生物最適生長溫度與發酵速度最高的溫度不一定相同，故試驗研究了不同溫度對黑曲霉脫除花生粕中黃曲霉毒素的影響。由圖3可以看出在溫度分別達到30，25 ℃時AFB1，AFG1脫除率已達最高，分別為82.69%，53.43%，而AFB2和AFG2脫除率在40 ℃時有突增現象，可能由于在低溫脫除過程中AFB1和AFG1的末端呋喃環雙鍵結構已斷裂，導致所轉化的中間產物AFB2和AFG2在此時脫除率不明顯，而升高溫度促進毒素其他結構的破壞，從而出現升溫脫除率突增。有研究指出，在酸性溶液中AFB1和AFG1分別轉化成AFB2和AFG2[22]，所以在后續試驗中對總AFT 脫除率的監測是有必要的。

2.1.3 發酵時間對4 種黃曲霉毒素毒素脫除率的影響

在孢子懸浮液含量為1×106CFU/mL，料液比1∶1，接種量10%，培養溫度30 ℃條件下，研究發酵時間分別為24，36，48，60，72 h 對4 種黃曲霉毒素脫除率的影響。

發酵時間對黑曲霉脫除4 種黃曲霉毒素的影響見圖4。

發酵時間是發酵過程中的重要參數之一，由圖4可以看出AFB1，AFB2，AFG1，AFG24 種毒素脫除率隨時間的延長而升高，AFG1脫除率到36 h 后基本保持穩定，AFB1，AFB2，AFG23 種毒素脫除率到60 h后基本保持穩定，可能由于發酵后期菌體受到營養物質及發酵環境的限制，影響了其代謝生長。

2.1.4 料液比對4 種黃曲霉毒素毒素脫除率的影響

在孢子懸浮液含量為1×106CFU/mL，接種量10%，培養溫度30 ℃，發酵時間48 h 條件下，研究料液比分別為1∶0，1∶0.5，1∶1.0，1∶1.5，1∶2.0對4 種黃曲霉毒素脫除率影響。

料液比對黑曲霉脫除4 種黃曲霉毒素的影響見圖5。

料液比在微生物發酵過程中發揮至關重要的作用，從圖5 可以看出在料液比為1∶0 時，嚴重限制了菌體正常代謝活動，從而影響4 種毒素脫除效果。料液比為1∶1.5 時，AFB1，AFB2，AFG1，AFG24 種毒素脫除率分別為93.05%，53.23%，62.11%，65.06%，綜合4 種毒素脫除率，較為適宜的料液比為1∶1.5。

2.2 響應面優化試驗

2.2.1 響應面試驗設計因素與水平

為了得到黑曲霉脫除花生粕中黃曲霉毒素的最佳條件，根據上述單因素試驗得到的較優條件，采用響應面法對接種量、料液比、發酵時間、發酵溫度4 個因素兩兩交互影響進行試驗設計。

響應面試驗因素與水平設計見表2。

表2 響應面試驗因素與水平設計

通過單因素試驗確定黑曲霉生物發酵脫除黃曲霉毒素的4 個單因素適宜范圍，由于AFB1毒性最大，現今國內外對黃曲霉毒素總量關注度極高，所以試驗選取AFB1和總AFT 脫除率為考查指標進行響應面優化。

響應面試驗設計及結果見表3。

表3 響應面試驗設計及結果

2.2.2 響應面回歸模型的建立與分析

通過Design Expert 10 對試驗結果進行回歸擬合及方差分析，得到以AFB1脫除率（Y1） 和總AFT 脫除率（Y2） 為響應值，接種量（A）、發酵溫度（B）、發酵時間（C）、料液比（D） 的多元二次回歸方程：

為檢驗回歸方程有效性，對回歸方程進行方差和顯著性分析。

AFB1脫除率回歸模型方差分析見表4，總AFT脫除率回歸模型方差分析見表5。

表4 AFB1 脫除率回歸模型方差分析

結果表明，2 個回歸模型均極顯著（p＜0.001），2 個失擬項均不顯著（p＞0.05），R2分別為0.977 8，0.978 6，R2adj分別為0.958 6，0.957 2，表明該模型能夠較好地擬合數據，該回歸方程可用于預測分析且能較好地反映各因素與響應值之間的關系。由表3、表4 可知，AFB1脫除率的影響因素主次順序為發酵時間＞接種量＞發酵溫度＞料液比，總AFT 脫除率的影響因素主次順序為發酵時間＞接種量＞料液比＞發酵溫度。

2.2.3 各因素兩兩交互作用

各因素交互作用對AFB1脫除率影響的響應面圖見圖6，各因素交互作用對總AFT 脫除率影響的響應面圖見圖7。

圖6（a）、6（b）、6（c） 反映了接種量與其他3 個因素的交互作用，當接種量介于5%～11%時，AFB1脫除率可達到最高點，且接種量與料液比的交互作用顯著。圖6（a）、6（d）、6（e） 反映了溫度與其他3 個因素的交互作用，當溫度介于28～37 ℃時，AFB1脫除率可達最高點，且溫度與時間、料液比的交互作用顯著。圖6（b）、6（d）、6（f） 反映了時間與其他3 個因素的交互作用，當時間介于54～72 h 時，AFB1脫除率可達到最高點，且時間與溫度、料液比的交互作用顯著。圖6（c）、6（d）、6（f） 反映了料液比與其他3 個因素的交互作用，當料液比介于1.2～1.8 時，AFB1脫除率可達到最高點，且料液比與其他3 個因素交互作用均顯著。

表5 總AFT 脫除率回歸模型方差分析

圖7（a） -7（f） 反映了四因素兩兩交互作用，當接種量5%～11%，溫度28～34 ℃，時間54～63 h，料液比1.4～1.6 時，總AFT 脫除率可達最高點。等高線中心點均在上述條件范圍內，總AFT 脫除率可達70%以上。

2.2.4 響應面最優條件的確定

運用Design Expert 10 軟件分析得最優脫除毒素的條件為接種量9.28%，發酵溫度31.80 ℃，發酵時間63.30 h，料液比1∶1.56。此條件下預測的AFB1脫除率為95.99%，總AFT 脫除率為71.48%。在此條件下進行黑曲霉生物發酵花生粕，重復試驗3 次，得到AFB1脫除率（95.01%±0.50%），含量降至0.95 μg/kg，總AFT 脫除率為（72.90%±0.35%），含量降至26.80 μg/kg。與理論值相對誤差分別為1.03%，1.95%，說明該優化條件可行，具有實際應用價值。

3 結論

利用黑曲霉FS10 生物發酵花生粕，研究了接種量、料液比、發酵時間、發酵溫度4 個因素對花生粕中AFB1，AFB2，AFG1，AFG2脫除效果的影響，運用響應面法優化上述4 個條件對AFB1和總AFT 毒素脫除效果，研究結果表明，在接種量9.28%，發酵溫度31.80 ℃，發酵時間63.30 h，料液比1∶1.56 的條件下，花生粕中的AFB1脫除率為95.01%，總AFT 脫除率為72.90%，通過對發酵條件的優化發現該黑曲霉對4 種黃曲霉毒素的脫除有著顯著的效果，發酵后花生粕中AFB1含量不僅符合國內標準，也符合歐盟制定標準（＜2 μg/kg）[23]，使花生粕有成為一種低脂高蛋白農產品資源的潛力。