補腎活血方對精索靜脈曲張模型大鼠生精功能的影響

劉建國，趙紅樂，李姣姣，馬亞玲，趙宇濤

補腎活血方對精索靜脈曲張模型大鼠生精功能的影響

劉建國1，2，趙紅樂1，李姣姣2，馬亞玲2，趙宇濤2

1.陜西省中醫醫院，陜西 西安 710003；2.陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046

觀察補腎活血方對精索靜脈曲張模型大鼠生精功能的影響，探討其作用機制。SD雄性大鼠40只，隨機抽取8只為假手術組，其余大鼠采用左腎靜脈部分結扎法造成精索靜脈曲張病理模型，造模成功大鼠隨機分為模型組和補腎活血方低、中、高劑量組，每組8只。造模后48 d開始灌胃給藥，連續60 d。摘取大鼠左側睪丸、附睪，稱重并計算臟器指數，檢測精子濃度、活動率，HE染色觀察睪丸病理改變，TUNEL法檢測生精細胞凋亡，睪丸組織勻漿檢測一氧化氮水平。與假手術組比較，模型組大鼠睪丸、附睪質量及臟器指數明顯降低，精子濃度、活動率明顯降低，睪丸組織生精上皮明顯變薄，大量生精細胞缺失，管腔內幾乎無成熟的精子細胞，生精細胞凋亡指數、睪丸組織一氧化氮含量均顯著增加；與模型組比較，補腎活血方各劑量組大鼠睪丸、附睪質量及臟器指數、精子濃度及活動率增加，睪丸組織損傷明顯恢復，生精細胞凋亡及睪丸組織一氧化氮含量均明顯降低。補腎活血方可改善精索靜脈曲張模型大鼠生精功能損傷，其機制可能與抑制生精細胞凋亡及減少一氧化氮對睪丸組織的毒性損傷有關。

補腎活血方；精索靜脈曲張；精子發生；細胞凋亡；一氧化氮；大鼠

精索靜脈曲張是導致男性不育的重要因素之一，其發病率在男性人群中占15%，在不育男性中約占45%[1]。精索靜脈曲張可造成睪丸灌注減少，引起精液質量異常、睪丸體積下降及睪丸生精功能障礙等。針對精索靜脈曲張的相關研究較多，但其導致男性不育的機制仍未完全闡明。目前，研究重點主要集中在細胞凋亡、氧化應激、一氧化氮（NO）毒性損傷等[2]。中醫藥在治療精索靜脈曲張所致不育方面有較好療效，不僅可有效緩解精索靜脈曲張癥狀，還能改善精液參數，調節性激素水平，提高配偶受孕率[3-5]，但其具體機制仍未明了。補腎活血方是筆者根據金保方教授養精膠囊加減化裁而成，具有補腎填精、養血活血功效。前期臨床研究表明，補腎活血方可改善少弱精子癥患者的精液量、精子濃度、活動力，同時可提高精漿超氧化物歧化酶活性，降低精漿丙二醛含量，表明補腎活血方改善精子質量可能與其抗氧化作用有關[6]。為進一步探究補腎活血方對精索靜脈曲張導致生精功能損傷的療效機制，本研究通過建立精索靜脈曲張大鼠模型，觀察補腎活血方對模型大鼠精子參數、睪丸組織病理學、生精細胞凋亡及睪丸組織NO含量的影響，探究其作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠40只，3月齡，體質量150～200 g，購自第四軍醫大學實驗動物中心，動物許可證號SYXK2012（陜）2012-006；動物分籠飼養在普通級動物房，溫度20～22 ℃、相對濕度50%～70%，明暗周期12 h/12 h，自由攝食飲水。

1.2 藥物及制備

補腎活血方（淫羊藿20 g，熟地黃10 g，當歸15 g，紫河車10 g，黃精10 g，黃芪15 g，制水蛭10 g，沙苑子10 g，煅牡蠣20 g，荔枝核10 g，王不留行20 g），飲片由陜西省中醫醫院中藥房提供，用時將中藥常規煎煮，過濾，濃縮，4 ℃冰箱保存備用。灌胃時配制相應濃度混懸液。

1.3 主要試劑與儀器

TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，貨號MK1020），NO測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號A012-1-2）。電子分析天平（瑞士梅特勒托利多公司，型號AL104）；高速低溫離心機（美國賽默飛世爾科技公司，型號Thermo Fresco17），圖像分析系統（成都泰盟軟件有限公司，型號BI-2000），光學顯微鏡（上海尼康儀器胡限公司，型號E200）。

1.4 造模、分組及給藥

參照文獻[7]方法造模，部分結扎左腎靜脈及左腎總靜脈之間交通支。假手術組只行左腎靜脈分離而不結扎。術后大鼠肌注青霉素鈉，20萬U/d，連續3 d，預防感染。喂食標準飼料，繼續飼養48 d。術后48 d，所有大鼠剖腹觀察，用游標卡尺測量左側精索靜脈直徑，觀察其曲張程度。如大鼠左側精索內靜脈直徑比假手術組擴張2倍且雙腎大小無明顯差異，左腎無缺血萎縮等明顯病變，表明造模成功[8]；假手術組精索靜脈無擴張增粗。將造模成功大鼠隨機分為模型組和補腎活血方低、中、高劑量組，每組8只。假手術組和模型組給予10 mL/kg雙蒸水灌胃；中藥給藥劑量按人和大鼠體表面積換算成臨床成人用量的3、6、12倍，即補腎活血方低、中、高劑量組分別為6.3、12.6、25.2 g/kg，給予相應劑量混懸液灌胃，給藥體積均為10 mL/kg。每日1次，連續60 d。末次給藥1 h后稱重。水合氯醛腹腔注射麻醉，摘除左側睪丸、附睪，稱重。之后取每只大鼠左側睪丸，一半用于睪丸組織病理分析、生精細胞凋亡檢測，另一半睪丸組織冰上勻漿，用于NO含量測定。

1.5 精子濃度和活動率檢測

迅速取左側附睪，剪碎，溶于2 mL生理鹽水，37 ℃繼續孵育15 min至精子完全游出，以獲得精子懸液。取精子懸液混勻，滴到血細胞計數板上，進行精子濃度、活動率檢測。

1.6 睪丸組織學分析

睪丸組織常規固定，24 h后脫水，石蠟包埋，切片（厚度約3 μm），HE染色，光鏡下觀察睪丸生精小管形態、精子發生狀態和睪丸組織形態。

1.7 睪丸生精細胞凋亡檢測

TUNEL法檢測睪丸組織生精細胞凋亡。按TUNEL檢測試劑盒說明書進行操作。細胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞，即凋亡細胞。將組織切片置于400倍光鏡下觀察，每張切片隨機選擇5個視野，計數500個細胞，進行陽性細胞計數，取平均值，求得陽性細胞率即為凋亡指數。

1.8 睪丸組織勻漿一氧化氮含量測定

睪丸組織冰上勻漿，測定NO含量，按試劑盒說明書進行操作。

1.9 統計學方法

2 結果

2.1 補腎活血方對精索靜脈曲張模型大鼠睪丸、附睪質量及臟器指數的影響

與假手術組比較，模型組大鼠睪丸、附睪質量及臟器指數均明顯降低，差異有統計學意義（＜0.05，＜0.01）；與模型組比較，補腎活血方低、中劑量組大鼠睪丸、附睪質量及臟器指數顯著增加，差異有統計學意義（＜0.05，＜0.01）。結果見表1。

表1 各組大鼠睪丸、附睪質量及臟器指數比較（±s）

注：與假手術組比較，*＜0.05，**＜0.01；與模型組比較，#＜0.05，##＜0.01

2.2 補腎活血方對精索靜脈曲張模型大鼠精子濃度及活動率的影響

與假手術組比較，模型組大鼠精子濃度、活動率顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，補腎活血方中、高劑量組大鼠精子濃度、活動率明顯增加（＜0.05，＜0.01）。結果見表2。

表2 各組大鼠精子濃度和活動率比較（±s）

注：與假手術組比較，**＜0.01；與模型組比較，#＜0.05，##＜0.01

2.3 補腎活血方對精索靜脈曲張模型大鼠睪丸組織損傷的影響

假手術組大鼠生精小管飽滿，小管內生精上皮層數完整，各級生精細胞排列整齊有序，管腔內可見大量成形的精子細胞；模型組大鼠生精小管內生精上皮明顯變薄，且可見到大量生精細胞的缺失，管腔內幾乎無成熟的精子細胞；補腎活血方低劑量組生精上皮仍薄，且有生精細胞缺失，但管腔中可見成熟的精子細胞；補腎活血方中、高劑量組小鼠生精上皮層數增加，各級生精細胞排列規律，管腔中可見大量的成熟精子細胞。結果見圖1。

2.4 補腎活血方對精索靜脈曲張模型大鼠睪丸生精細胞凋亡的影響

與假手術組比較，模型組大鼠睪丸生精細胞凋亡明顯增多；與模型組比較，補腎活血方低、中、高劑量組大鼠睪丸生精細胞凋亡顯著減少，見圖2。模型組大鼠睪丸生精細胞凋亡指數較假手術組顯著增加（＜0.01），補腎活血方低、中、高劑量組較模型組大鼠睪丸生精細胞凋亡指數顯著降低（＜0.01），見表3。

圖1 各組大鼠睪丸組織形態（HE染色，×200）

注：棕色細胞為凋亡的生精細胞

表3 各組大鼠睪丸生精細胞凋亡指數比較（±s，%）

注：與假手術組比較，**＜0.01；與模型組比較，##＜0.01

2.5 補腎活血方對精索靜脈曲張模型大鼠睪丸組織一氧化氮含量的影響

與假手術組比較，模型組大鼠睪丸組織NO含量顯著增加，差異有統計學意義（＜0.01）；與模型組比較，補腎活血方低、中、高劑量組大鼠睪丸組織NO含量明顯降低，差異有統計學意義（＜0.01）。結果見表4。

表4 各組大鼠睪丸組織NO含量比較（±s，mg/mL）

注：與假手術組比較，**＜0.01；與模型組比較，##＜0.01

3 討論

目前，關于精索靜脈曲張致男性不育的機制可能與睪丸微循環障礙、睪丸局部溫度增高、缺氧、氧自由基增多及細胞凋亡等多種途徑共同作用有關[9]。其中睪丸生精細胞凋亡是精索靜脈曲張致不育的重要機制之一。正常精子發生過程中，生精細胞增殖和凋亡維持相對平衡。在生理情況下，哺乳動物精子發生過程中存在不同階段生殖細胞凋亡，可消除異常的生精細胞，維持支持細胞和生精細胞比例，從而確保精子的質量和數量。精索靜脈曲張時如低氧、氧化應激、陰囊局部溫度升高、免疫作用、腎臟及腎上腺毒性物質返流等均可致生精細胞凋亡[10]。生精細胞凋亡增加可導致少精或弱精癥，引起男性生殖力下降或不育。

精索靜脈曲張性不育屬中醫學“筋瘤”“精瘀”“不育”范疇，目前大多醫家認為“腎虛血瘀”是精索靜脈曲張性不育的主要病機，補腎活血法為主要治法，且臨床療效顯著[11-14]。補腎活血方以“補腎填精、養血活血”為大法組方，方中淫羊藿溫腎助陽，熟地黃滋補腎陰、填精益髓，兩者合用補腎填精、補陰益陽，共為君藥。黃精益氣健脾補腎，先后天之精同補，紫河車系血肉有情之品，能補腎益精、養血益氣，沙苑子、煅牡蠣與黃芪共用補氣固精，有助于恢復“腎藏精”的功能，當歸養血活血，取精血同源、養血填精之功，水蛭專走血分，破血化瘀，散瘀通絡，共為臣藥。荔枝核、王不留行行氣活血，氣行則血行，改變久病絡脈氣血瘀滯的狀態，共為佐藥。諸藥合用，共奏補腎填精、養血活血之功。現代藥理研究發現，補腎活血方中主要藥物具有抗凋亡的作用。淫羊藿中主要成分淫羊藿苷和淫羊藿總黃酮對生精細胞凋亡有明顯調控作用[15-16]。當歸多糖、黃芪多糖及其配伍對化療性骨髓抑制小鼠骨髓干細胞能促進Bcl-2 mRNA表達、降低Bax、Caspase-9 mRNA表達，抑制細胞凋亡[17]。黃精多糖可抑制長春新堿對骨髓基質細胞生長的抑制及凋亡作用[18]。荔枝核總黃酮可上調Bcl-2、下調Bax的表達，抑制肝細胞凋亡，發揮抗肝纖維化的作用[19]。沙苑子黃酮可減輕內質網應激誘導的細胞凋亡，保護百草枯所致的肺損傷[20]。牡蠣提取液對高溫所致神經干細胞的凋亡具有一定的保護作用[21]。

本實驗研究發現，模型組大鼠精子濃度、活動率較假手術組明顯降低，睪丸組織病理學顯示生精小管內生精上皮明顯變薄，可見大量生精細胞缺失，管腔內成熟精子細胞較少，表明精索靜脈曲張性生精障礙模型建立成功。經補腎活血方干預后，中、高劑量組模型大鼠精子濃度、活動率明顯升高，睪丸組織病理損傷明顯改善，且隨著藥物劑量的增加，恢復趨勢更為明顯，表明補腎活血方可改善精索靜脈曲張模型大鼠生精損傷，減少睪丸組織病理損傷。本實驗采用TUNEL法檢測生精細胞凋亡，結果顯示模型組生精細胞凋亡指數較假手術組顯著增加；而補腎活血方組較模型組生精細胞凋亡顯著減少，中劑量組最顯著，表明補腎活血方可通過抑制精索靜脈曲張模型大鼠的生精細胞凋亡改善生精損傷。

近年來，NO為研究較多的精索靜脈曲張致男性不育的一種效應分子。精索靜脈曲張時，精索靜脈血液淤積，以及返流的代謝產物刺激血管內皮細胞、巨噬細胞和睪丸細胞產生過量的一氧化氮合酶（NOS），加之精索靜脈血中L-精氨酸含量升高，多因素促使NO生成增加[22]。研究表明，NO對精子有雙重影響：低水平NO可維持正常生精、滅活超氧陰離子、提高精子活動度；然而，NO濃度過高會讓機體內誘導型NOS過度表達，進而對線粒體呼吸鏈中的酶起到抑制作用，損害正常細胞，從而使生精細胞數量減少，降低精子獲能和頂體反應率，抑制精子的活動度，導致生育力下降[23]。因此，調節NO過度生成是治療精索靜脈曲張性男性不育的重要方式。研究表明，補腎活血方藥物中的多糖如熟地多糖、當歸多糖、黃精多糖等均有顯著抗氧化作用，可通過提高抗氧化酶的活性，清除過量自由基的產生，調節NO體系的平衡，減輕NO產生伴隨的細胞毒性作用[24-25]。本實驗中模型大鼠睪丸組織NO含量明顯高于假手術組，而補腎活血方各劑量組大鼠睪丸NO含量較模型組明顯減少，且隨著藥物劑量的增加更為明顯，表明補腎活血方可通過降低NO水平減少其對精索靜脈曲張模型大鼠睪丸的毒性損傷，從而改善其生精功能。

綜上，補腎活血方可通過改善精索靜脈曲張大鼠精液參數，睪丸、附睪臟器指數，睪丸組織病理損傷，降低其生精功能損傷，其機制可能與抑制生精細胞凋亡、減少NO造成的睪丸毒性損傷有關。

[1] OMAR S S, MAHFOUZ W, DAWOOD W, et al. Relation of nitric oxide synthase gene (NOS3) polymorphisms to varicocele risk and post-varicocelectomy seminal oxidative stress reduction[J]. Andrologia,2020,52(3)：e13525.

[2] 柯鑫文,武政華,馮少勇,等.茶多酚對精索靜脈曲張大鼠睪丸組織氧化應激和細胞凋亡的影響[J].現代泌尿外科雜志,2015,20(7)：505-508.

[3] 傅顯文,李毅,朱文雄,等.顯微鏡精索靜脈結扎術聯合桃紅四物湯對氣滯血瘀型精索靜脈曲張不育臨床療效觀察[J].中醫藥臨床雜志, 2019,31(6)：1119-1122.

[4] 宋愛敏,張俊.滋陰活血中藥聯合馬栗樹籽提取物治療腎虛血瘀型精索靜脈曲張性不育療效觀察[J].現代中西醫結合雜志,2019,28(12)：1316-1318.

[5] 畢海寧.益腎祛瘀方治療精索靜脈曲張不育對精子質量和氧化應激的影響[J].實用中醫藥雜志,2019,35(4)：389-390.

[6] 劉建國,孫大林,金保方,等.補腎活血方治療少弱精子癥的臨床研究[J].中國性科學,2015,24(11)：85-88.

[7] 張長城,周安方,張茂林,等.補腎活血方對實驗性精索靜脈曲張大鼠睪丸組織SOD、NOS、MDA水平的影響[J].中國實驗方劑學雜志,2005, 11(2)：54-56.

[8] 王悅良,陳豪特,代波,等.精索靜脈曲張模型大鼠睪丸改變及大黃?蟲丸的干預作用[J].中國中醫基礎醫學雜志,2018,24(12)：1703-1706.

[9] 寧金卓,程帆,余偉民,等.精索靜脈曲張與男性不育研究進展[J].中國醫藥導報,2017,14(13)：38-41.

[10] WANG H, LV Y, HU K, et al. Seminal plasma leptin and spermatozoon apoptosis in patients with varicocele and leucocytospermia[J]. Andrologia,2015,47(6)：655-661.

[11] 張長城,周安方.精索靜脈曲張性不育的病機探討[J].中國中醫基礎醫學雜志,2004,10(11)：56-58.

[12] 余海保,蔣平.精索靜脈曲張性不育從腎虛血瘀辨治[J].河南中醫, 2008,28(8)：44-45.

[13] 俞保柱,曹莉,王健,等.五子衍宗丸加味治療精索靜脈曲張性不育腎虛血瘀證的臨床研究[J].中國性科學,2019,28(6)：23-26.

[14] 王權勝,藍廣和,賓彬,等.從“腎虛血瘀”論治精索靜脈曲張性不育40例臨床觀察[J].中國中醫基礎醫學雜志,2014,20(1)：124-125,133.

[15] 潘曉燕.淫羊藿苷對酒精損傷小鼠睪丸生精細胞凋亡的影響[J].中國婦幼保健,2014,29(15)：2438-2440.

[16] YUAN D, WANG H W, HE H B, et al. Protective effects of total flavonoids from epimedium on the male mouse reproductive system against cyclophosphamide-induced oxidative injury by up- regulating the expressions of SOD3 and GPX1[J]. Phytotherapy Research,2014,28(1)：88-97.

[17] 崔運浩,初杰,范穎,等.當歸多糖、黃芪多糖及其配伍對化療性骨髓抑制小鼠骨髓干細胞凋亡和脫核因子的影響[J].遼寧中醫藥大學學報, 2019,21(8)：38-43.

[18] 胡微煦,文珠,戎吉平,等.黃精多糖干預長春新堿誘導的骨髓基質細胞生長抑制及凋亡[J].中藥藥理與臨床,2012,28(6)：79-82.

[19] 靳雅玲,羅偉生,歐士鈺,等.荔枝核總黃酮對肝纖維化大鼠肝細胞凋亡機制的研究[J].時珍國醫國藥,2012,23(9)：2197-2199.

[20] 張志堅,吳燦,田黎,等.沙苑子總黃酮對內質網應激誘導的細胞凋亡在百草枯致大鼠肺損傷中的保護作用[J].醫學研究生學報,2014, 27(8)：806-809.

[21] 宋海巖,宋勇莉,于清梅,等.牡蠣提取物在高溫誘導皮質神經干細胞凋亡中的保護作用[J].中國組織工程研究,2010,14(27)：5127-5130.

[22] 張建華,楊為民,周四維.曲張的精索靜脈血一氧化氮的測定及意義[J].中華男科學雜志,2005,11(3)：229-230.

[23] PAJOVIC B, RADOJEVIC N, TERZIC N, et al. Correlation between nitricoxide levels, the hypo-osmotic swelling test for sperm membranes and semen analysis in patients with varicocele[J]. Scand J Urol,2013,47(5)：404-410.

[24] 佟雙喜,郭蔚瑩.當歸多糖對糖尿病大鼠腎組織抗氧化能力及NOS、NO水平的影響[J].中國老年學雜志,2015,35(24)：43-44.

[25] 葉素英,周艷陽,葉紹凡.黃精多糖對大強度訓練大鼠血紅蛋白、乳酸及腦組織抗氧化能力、一氧化氮體系的影響[J].中國老年學雜志,2014, 34(23)：164-166.

Effects ofPrescription on Spermatogenesis in Varicocele Model Rats

LIU Jianguo1,2, ZHAO Hongle1, LI Jiaojiao2, MA Yaling2, ZHAO Yutao2

To study the effects ofPrescription on spermatogenic of experimental varicocele model rats; To discuss its mechanism.8 out of 40 male SD rats were randomly selected as sham-operation group, and the rest rats were ligated with left renal vein to create the pathological model of varicocele. After the model was established successfully, they were randomly divided into the model group,Prescription low-, medium- and high-dosage groups, with 8 rats in each group. 48 days after establishing the model, medicine was given continuously for 60 days. At the end of the treatment, the left testis and epididymis of rats were removed; the weight of testis and epididymis, organ index, sperm concentration and activity rate were measured; pathological changes of testis were observed by HE staining; spermatogenic cell apoptosis was detected by TUNEL; NO level of testicular tissue was detected by homogenization.Compared with the sham-operation group, the weight of testis and epididymis and organ index, sperm density and vitality were significantly reduced; the seminiferous epithelium of testis was obviously thinner; a large number of seminiferous cells were missing; there were almost no mature sperm cells in the lumen; the spermatogenic cells apoptosis index and the concentration of NO in testicular tissue significantly increased. Compared with the model group, the weight of testis and epididymis and organ index, sperm density and vitality increased significantly; the injury of testicular tissue recovered obviously; the spermatogenic cell apoptosis index and NO concentration decreased significantly inPrescription groups.Prescription can improve the spermatogenesis of varicocele model rats, and the mechanism may be related to inhibiting spermatogenic cell apoptosis and reducing the toxic damage of NO to testicular tissue.

Prescription; varicocele; spermatogenesis; apoptosis; NO; rats

R285.5

A

1005-5304(2020)10-0054-05

10.19879/j.cnki.1005-5304.202003639

國家自然科學基金（81603631）；陜西省自然科學基金（2016JQ8034）；陜西省中醫藥管理局項目（2015-JC012）

趙紅樂，E-mail：zhaohongle1988@163.com

（2020-03-24）

（2020-04-08；編輯：華強）