重組人骨靶向干擾素γ的骨靶向性和對巨噬細胞向破骨細胞分化的影響*

山東省醫藥生物技術研究中心/山東第一醫科大學(山東省醫學科學院)/國家衛生健康委生物技術藥物重點實驗室/山東省罕少見病重點實驗室(山東 濟南 250062)

王志宇 曹廣祥 付加芳 宗工理 李俊玲 張佩佩 王世立

骨硬化病又稱石骨癥，是一種少見的全身性骨結構發育異常的先天性疾病，以骨密度增高、破骨細胞吸收功能障礙為主要特點[1]。2000年，美國FDA批準重組人干擾素γ(rhIFNγ-1b，商品名 Actimmune)上市用于治療骨硬化病。資料顯示，該藥用于骨硬化病治療存在周期長、副作用大等缺點，究其原因與藥物的平均組織分布有關[2-4]。我們課題組擬制備能夠靶向骨組織的干擾素γ。研究表明由天冬氨酸或谷氨酸組成的寡肽能夠選擇性輸送至骨組織，并且在骨組織內長期保留[5]。已有研究證實偶聯有上述酸性氨基酸寡肽的雌激素、左氧氟沙星、堿性磷酸酶、β-葡糖苷酸酶等藥物能夠選擇性靶向骨組織，使藥物在骨組織內富集[6-8]。基于上述酸性氨基酸寡肽的骨靶向系統，是否能夠應用于干擾素，使IFNγ更多富集于骨組織，目前尚不清楚。

將10個天冬氨酸殘基連接于人干擾素γ羧基端，在大腸桿菌內融合表達并純化[9]。本研究探討純化獲得的重組人干擾素γ在體外的生物學活性，包括是否具有骨靶向性以及是否能夠促進破骨細胞分化。

1 材料與方法

1.1 主要試劑rhIFNγ-D10和rhIFNγ為本實驗室制備；RANKL(PeproTech)納米羥基磷灰石(nHAP，Sigma)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天)；TRAP染色試劑盒(Sigma)；DMEM培養基(Gibco)；胎牛血清(四季青)。

1.2 細胞的傳代培養小鼠巨噬細胞株RAW264.7(ATCC，美國)用含有10%FBS的DMEM(高糖)培養基，于37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養。細胞融合度達到90%以上時，按1:3細胞傳代。不使用胰酶消化細胞，加入5mL培養基直接從壁上吹下細胞，轉入新的細胞培養瓶，確保細胞貼壁后融合度在25%～50%。

1.3 TRAP破骨細胞染色將RAW264.7細胞(1×105個/mL)接種于24孔細胞培養板，分為RANKL(終濃度100ng/mL)、RANKL+rhIFNγ-D10(分別為100ng/mL和30ng/mL)、RANKL+rhIFNγ(100ng/mL和30ng/mL)、rhIFNγ-D10(30ng/mL)和rhIFNγ(30ng/mL)五個組，每組3個重復孔。加藥后隔天更換含有上述細胞因子的新鮮培養液，于誘導后的第4天，按照TRAP試劑盒使用說明對細胞進行染色，利用倒置熒光顯微鏡(100×)觀察各組細胞TRAP染色情況。

1.4 重組人骨靶向干擾素γ(rhIFNγ-D10)的親骨性評價羥基磷灰石是骨基質的主要成分，本研究采用羥基磷灰石吸附法[10]評價蛋白的體外親骨性。以納米羥基磷灰石作為吸附介質，使其與待測蛋白溶液(C0)充分相互作用，除去吸附介質后用BCA(Bicinchoninine acid assay)法測定作用后蛋白溶液的濃度(Ca)。蛋白與羥基磷灰石親和性的大小通過吸附率計算，公式為：吸附率=(C0－Ca)/C0×100%。

具體方法為：吸取濃度為50μg/mL和100μg/mL的rhIFNγ-D10和rhIFNγ蛋白溶液各5mL，分別加入nHAP 15mg，超聲分散5min后，室溫下劇烈振搖90 min。另設1×PBS溶液為空白對照組。取溶液過濾并收集所有濾液，BCA法檢測并計算濾液中未吸附的蛋白濃度值(μg/mL)，根據上述公式計算不同蛋白的吸附率。

1.5 統計學方法所有數據采用SPSS13.0統計軟件分析，結果表示為(±s)。實驗結果采用配對t檢驗方法分析。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同種類干擾素對R A W 2 6 4.7 巨噬細胞分化為破骨細胞的影響分別用R A N K L、RANKL+rhIFNγ-D10、RANKL+rhIFNγ、rhIFNγ-D10和rhIFNγ誘導刺激RAW264.7巨噬細胞，并于誘導的第4天采用TRAP細胞染色法檢測不同蛋白因子對促巨噬細胞分化為破骨細胞的作用。結果顯示，RANKL組在誘導的第4天出現明顯的TRAP染色陽性破骨細胞，RANKL+rhIFNγ-D10組和RANKL+rhIFNγ組誘導TRAP染色陽性破骨細胞明顯少于RANKL組，rhIFNγ-D10組和rhIFNγ組沒有誘導產生TRAP染色陽性破骨細胞。以上結果表明：干擾素包括骨靶向干擾素(rhIFNγ-D10)和非骨靶向干擾素(rhIFNγ)在RANKL存在的前提下，對RANKL促進巨噬細胞向破骨細胞分化具有明顯的抑制作用。隨機挑選各組第4天的3個視野觀察TRAP染色陽性破骨細胞，結果如圖1。

2.2 重組人骨靶向干擾素rhIFNγ-D10的親骨性評價將50μg/mL和100μg/mL(C0)的rhIFNγ-D10、rhIFNγ溶液各5mL，于室溫劇烈振蕩條件下與超聲分散后的羥基磷灰石15mg結合90min。結合后過濾，取濾液BCA法測定溶液中未結合的各蛋白濃度(Ca)。根據公式1.4計算各蛋白吸附率。結果顯示，起始濃度為50μg/mL的rhIFNγ-D10組和rhIFNγ組吸附后濃度分別為22.71μg/mL和42.44μg/mL，根據公式計算吸附率分別為54.24%和15.13%，兩組差異具有統計學意義(P＜0.05)，如圖2。起始濃度為100μg/mL的rhIFNγ-D10組和rhIFNγ組吸附后濃度分別為46.68μg/mL和86.14μg/mL，根據公式計算吸附率分別為53.32%和13.86%，兩組差異具有統計學意義(P＜0.05)，如圖2。以上結果表明：前期制備的重組人骨靶向干擾素(rhIFNγ-D10)具有良好的骨靶向性。

圖1 rhIFNγ-D10和rhIFNγ對RAW264.7巨噬細胞分化形成破骨細胞的影響。

圖2 不同濃度的rhIFNγ-D10和rhIFNγ對羥基磷灰石的吸附率。

3 討 論

骨靶向藥物不僅能夠提高治療有效性，而且明顯降低毒副作用。其靶向策略主要包括兩大類，其一為靶向整個骨組織；其二為特異性地靶向骨細胞，如成骨細胞、破骨細胞等。大多數骨靶向藥物靶向骨基質的主要成分羥基磷灰石，包括帶負電荷的氨基酸寡肽或二膦酸鹽[11]。本研究將10個天冬氨酸寡肽偶聯干擾素γ羧基末端，在大腸桿菌原核表達系統表達并純化[9]，其純化產物經體外羥基磷灰石結合試驗表征，證實具有明顯的骨靶向性。目前骨靶向藥物已用于骨關節炎(OA)、骨質疏松以及骨代謝性發育不良等疾病的治療[11]。骨靶向性干擾素在動物體內的骨靶向性以及用于骨硬化癥等骨疾病的治療效果有待進一步研究。

2000年美國FDA批準干擾素γ用于骨硬化癥治療，但其機理尚不闡明。干擾素是骨免疫系統重要的細胞因子，其中干擾素γ為II型干擾素。目前認為干擾素-γ在促進破骨細胞形成過程中具有雙重作用，抑制或促進破骨細胞分化取決于局部環境中細胞因子的種類與濃度。有研究表明干擾素-γ通過誘導泛素依賴的TRAF6信號分子降解抑制RANK介導的破骨細胞分化[12]。干擾素-γ受體缺陷小鼠體內破骨細胞數量增多并表現出明顯骨丟失[12]。此外，干擾素-γ在感染、炎癥、雌激素缺乏等病理條件下間接促進破骨細胞形成，但干擾素-γ對破骨細胞形成的直接作用鮮有研究報道[13]。本研究發現在未加入RANKL的實驗組，干擾素-γ對破骨細胞沒有明顯的直接抑制或促進分化作用，但在RANKL促進破骨分化過程中表現出一定的抑制作用，對破骨細胞分化的免疫調控有了新的補充。

綜上所述，在羧基末端偶聯10個天冬氨酸多肽的骨靶向系統，可有效將干擾素γ靶向至骨組織。本研究利用大腸桿菌表達系統表達的干擾素γ及干擾素γ-D10(即骨靶向干擾素γ)均未顯示對巨噬細胞分化為破骨細胞的促進作用。與之相反，在破骨細胞誘導因子RANKL誘導破骨細胞分化過程中，兩者均顯示一定的抑制作用，其具體的分子調控機制目前鮮有報道。骨硬化癥是一種以破骨細胞骨吸收功能障礙為特征的遺傳性骨病，本研究初步研究結果表明，干擾素γ及骨靶向干擾素γ對破骨細胞分化有抑制作用，可能不適合骨硬化癥治療，此研究結果與Imel等[14]研究報道一致。此外，乳腺癌、肺癌骨轉移過程中，破骨細胞骨吸收功能過度增強[15]，本研究發現干擾素γ對破骨細胞分化的抑制作用提示可將干擾素γ用于防治腫瘤骨轉移，但具體應用有待進一步深入研究。