結核分枝桿菌與宿主相互作用的分子機制

謝建平

（西南大學生命科學學院現代生物醫藥研究所三峽庫區生態環境與生物資源省部共建國家重點實驗室培育基地，重慶400715）

結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，以下簡稱結核桿菌）感染導致的結核病（tuberculosis）仍然是全球公共衛生重大威脅，是全球十大死因之一，位居單一傳染病原死亡人數之首.根據世界衛生組織 2019 年全球結核病報告［1］，2018 年，全球至少300 萬結核病患者無法得到合格的醫治.耐藥結核病的威脅更大，只有三分之一的耐藥結核病患者接受治療.2018 年全球利福平耐藥新發病例約50 萬（其中78%為多耐藥）.全球三大耐藥結核病高負擔國家和地區為：印度（27%）、中國（14%）、俄羅斯聯邦（9%）.全球3. 4%新發結核病患者、18%復治患者為多耐藥（multidrug resistant TB，MDR-TB）或者利福平耐藥患者（rifampicin -resistant TB，RR -TB）.全球結核病防控和基礎研究的資金缺口每年高達50 億美元.2018 年聯合國全球結核病高級別會議發表的政治宣言提出了2018—2022 年期間結核病防控的4 個新目標：1）治療4 000 萬結核病患者；2）預防性治療3 000 萬潛伏結核病患者；3）募集130 億美元進行結核病診斷、治療和護理；4）每年獲得20 億美元結核病研究經費.逆轉結核病流行的趨勢需要多方合作、投入和基礎科研.本文將概述結核桿菌與宿主相互作用以及涉及的效應分子和細胞類型、作用過程.

1 人體病灶內結核分枝桿菌呈現異質性

結核桿菌可感染人體幾乎所有器官、系統，其中最常見的是肺部.90%以上的肺結核是通過氣溶膠和呼吸道傳染，但結核桿菌也可以通過消化道和破損的皮膚黏膜進入機體，感染各種組織器官，導致相應器官的結核病.

人與結核桿菌基因組之間共進化并相互作用［2］，即使在患者體內，結核桿菌基因組的穩定也是相對的.分離同一個患者不同時間的菌株［3］，以及與來自不同患者的菌株進行全基因組測序發現：結核桿菌基因組即使在體內，也存在一些變異，而且變異位點相當保守［4］.目前的觀點是：肺結核患者的病灶中至少是4 種不同代謝狀態結核桿菌的復合體［5］：（A）持續生長繁殖菌，（B）間斷繁殖菌，（C）酸性環境中半休眠狀態菌，（D）完全休眠菌［6］.一線抗結核藥物不能殺死所有代謝狀態的細菌，例如鏈霉素對（C）群的結核桿菌完全無效，吡嗪酰胺對此群菌的作用卻最強.（B）（C）群結核桿菌在體內可以長期持留，化療藥物應使用足夠的療程才能殺滅.化療藥物使用不當或者療程不夠，（B）（C）群結核桿菌不能被清除，可能是結核病復發的根源.深入研究結核桿菌生理與代謝，進行表型篩選，有助于藥物靶標和先導物的發現［7］.

2 與宿主相互作用的結核桿菌重要效應分子

結核桿菌與人類共進化（coevolution）了數千年，是迄今最成功的致病菌.結核桿菌可以逃避、破壞宿主的先天免疫和后天免疫，包括改變宿主巨噬細胞內的吞噬體環境，選擇性躲避模式識別受體（pattern recognition receptor，PPR），調控宿主細胞因子的產生，改變抗原遞呈并降低 T 細胞應答的質量.

2.1 結核桿菌獨特的細胞壁在細菌存活和感染中發揮重要作用結核桿菌細胞壁是重要的抗生素靶標［8］.許多綜述對細胞壁各主要組分的結構、功能、合成的遺傳學和基因組學等都進行了總結，如肽聚糖［9］細胞壁脂類組分，尤其是枝菌酸的合成與功能，與其他細胞壁組分的聯系等［10］，細胞壁阿拉伯半乳聚糖與枝菌酸的關系［11］，細胞壁組分合成的遺傳學、基因及其功能［12］等.聚異戊烯醇磷酸酯（polyprenyl phosphate，Pol -P）是結核桿菌細胞壁合成的糖基供體（glycocarrier），也是必需代謝產物.異戊二烯單元以異戊二烯焦磷酸（isopentenyl diphosphate，IPP）形式添加到不同的烯丙基異戊二烯焦磷酸（allylic isoprenyl diphosphate）受體（acceptor）上，合成Pol -P.烯丙基異戊二烯焦磷酸的長度、雙鍵類型差異很大.Rv0989c編碼合成（E）-＝牛基焦磷酸（（E）- geranyl diphosphate，GPP）的酶［13］，GPP 是 DPP 的前體.Rv0989c 缺陷的結核桿菌不能穿透血腦屏障模型［14］. grcC2（Rv0989c）的精氨酸與異戊二烯鏈長決定有關［15］.結核桿菌法尼基焦磷酸（farnesyl diphosphate）合成酶具有一定靈活性.結核桿菌利用10 個異戊二烯單元，即十聚異戊二烯焦磷酸（decaprenyl diphosphate）組裝其細胞壁.其形成由Rv1086 負責催化一單元IPP 添加到（E）-＝牛基焦磷酸（（E）-geranyl diphosphate，GPP），Rv2361c催化添加7 個 IPP 到（Z，E）-法尼基焦磷酸（（Z，E）-farnesyl diphosphate，FPP），合成（Z，E）-FPP［16］.

Rv1086、Rv2361c 和 GTP 合成酶（GPP synthase）Rv0989 共同作用，完成結核分枝桿菌的十聚異戊二烯焦磷酸合成，如圖1 所示.

圖1 結核分枝桿菌的十聚異戊二烯焦磷酸合成Fig. 1 The biosynthesis of Mycobacterium tuberculosis decaprenyl diphosphate

2.2 結核桿菌的小分子量（low molecular weight，LMW）硫醇（Thiol）這些分子具有硫氫基（sulfhydryl group），可以脫毒活性氧（reactive oxygen species）、活性氮（reactive nitrogen species），以及其他自由基（free radicals），調控免疫系統，防止 DNA 和蛋白質被氧化、硝化和酸性脅迫損傷.結核桿菌中典型的硫醇包括麥角硫因（ergothioneine，ERG）、分枝桿菌硫醇（mycothiol，MSH）和 γ -谷氨酰半胱氨酸（gamma-glutamylcysteine，GGC）.分枝桿菌小分子量硫醇生物合成途徑的關鍵基因是藥物靶標［17］.

2.3 結核桿菌具有一些持留狀態下復制所需的特殊分子比如PerM 是分枝桿菌分裂體（divisome）的組分，負責穩定分裂體必需蛋白ftsB. PerM 缺陷影響小鼠感染慢性期的細胞分裂缺陷，但是不影響急性期感染的結核桿菌的細胞復制［18］.

2.4 結核桿菌效應分子-宿主分子相互作用及其過程宿主先天免疫依賴宿主胚系（germline）編碼的致病菌識別受體-模式識別受體PPR.PPR包括但不限于Toll-like receptor（TLR），細胞核寡聚化功能域（nuclear oligomerization domain，NOD），NOD樣受體（NOD-like receptors，NLR），C 型凝集素受體（C-type lectin receptor），補體受體（complement receptor），甘露糖受體（mannose receptor）等.先天免疫系統的吞噬細胞（phagocytic cells）識別、攝取和加工結核桿菌或多或少都利用了受體及其信號通路.宿主細胞不同類型的程序性死亡（programmed cell death），比如凋亡（apoptosis）、焦亡（pyroptosis）、自噬（autophagy）也利用了這些受體.結核桿菌持留和存活的機制多種多樣.這包括阻斷吞噬體（phagosome）與溶酶體（lysosome）融合，激活胞內自噬途徑（autophagic pathway）等.最近發現結核桿菌效應分子還可以促進吞噬體-溶酶體融合，但是滯后溶酶體效應分子的釋放.認識結核桿菌抑制宿主的不同先天識別途徑，有助于揭示其致病機制，研發控制新措施［19］.

結核桿菌與宿主相互作用如圖2 所示.

圖2 結核桿菌與宿主相互作用Fig. 2 The interaction between Mycobacterium tuberculosis and host

圖2 中，（a）為結核桿菌主要通過呼吸道氣溶膠形式傳播.（b）為結核桿菌感染時CD4+T 輔助細胞發育.樹突狀細胞遞呈結核桿菌抗原.表達MHC - II 分子激活結核桿菌特異性的未致敏CD4+T 細胞（M. tuberculosis-specific na?ve CD4 T cell）.其結局多種多樣，取決于T 細胞激發環境中的細胞因子種類、數量及其相對關系.CD4+T 能夠分化為抑制多種免疫應答的FoxP3+調控T 細胞（FoxP3+regulatory T cells，Tregs）.另一條相關但不同的分化途徑是上調轉錄因子RORγt，分化為產生IL-17A、IL -17F 和 IL -22 的 Th17 細胞，促進中性粒細胞趨化運動.表達轉錄因子Tbet，分化為Th1細胞，既可能是Tbet+Th1 細胞，表型為PD-1+，產生少量IFN-γ和TNF-α，也可能是終末效應Th1細胞，表型為KLRG1+，產生大量IFN-γ和TNF-α，在結核桿菌感染過程中，刺激巨噬細胞的效應功能.（c1）為肉芽腫中結核桿菌，（c2）為人結核病肉芽腫主要特征.人結核病肉芽腫分為多層.中間是干酪狀，富含脂類，主要來自泡沫巨噬細胞（foamy macrophage），其次是富含巨噬細胞層，含有泡沫巨噬細胞、多核巨大細胞（multinucleated giant cell），類上皮巨噬細胞（epithelioid macrophage）.許多細胞內有結核桿菌.再外層是膠原和其他胞外基質蛋白質構成的纖維狀莢膜.淋巴細胞局限分布在肉芽腫周圍，在纖維層外面.結核桿菌主要利用脂類.雙功能的異檸檬酸裂合酶（isocitrate lyase），尤其是其甲基異檸檬酸裂合酶（methyl isocitrate lyase）活性是甲基檸檬酸循環（methylcitrate cycle）所需.甲基檸檬酸循環是丙酰輔酶A（propionyl coenzyme A）脫毒所需.膽固醇降解會積累丙酰輔酶A.肉芽腫內脂類主要是甘油三酯、膽固醇、膽固醇酯.膽固醇酯可能來自泡沫巨噬細胞的脂滴.（d）結核桿菌阻斷吞噬體與溶酶體融合.（e）細菌外表面的細胞壁脂類和脂蛋白，是吞噬細胞天然免疫模式識別受體最初的刺激.吞噬結核桿菌的巨噬細胞最直接的相互作用可能是C型凝集素mincle（C -type lectin mincle）識別海藻糖 -6，6 - 二枝菌酸（trehalose -6，6-dimycolate，TDM），隨之的逐級信號傳遞最終啟動炎癥性細胞因子基因的轉錄.細胞漿膜上的TLR2 / TLR1 或 TLR2/TLR6 異 二 聚 體 （heterodimer）識別二酰基化（di -acylated）或者三酰基化（tri-acylated）的脂蛋白（lipoprotein）、脂甘露聚糖（lipomannan）、脂阿拉伯甘露聚糖（lipoarabinomannan，LAM），激活 NF -κB 和細胞因子表達.內吞體內的結核菌低甲基化（hypomethylated）DNA 使TLR9 二聚體化（dimerization），通過激活 IRF7 促進I型IFN產生.結核桿菌分泌的ESAT -6 蛋白使得吞噬體膜通透性提高，激活 NLRP3，招募 ASC 和pro-caspase-1，形成炎癥體（inflammasome），激活caspase-1，產生并分泌活性形式的 IL-1β、IL-18和IL -33.結核桿菌破壞MHC -II 抗原加工和遞呈.分枝桿菌產物如19kDa 脂蛋白介導的TLR2 信號通路阻斷新MHC -II 合成；分枝桿菌感染誘導IL-10 產生，阻遏組織蛋白酶 S（cathepsin S），破壞MHC-II的胞內運輸；分枝桿菌感染也抑制產生肽類抗原，阻止被裝載到內吞體空間的MHC -II 分子.這些過程包括抑制吞噬體-溶酶體融合，細菌的脲酶（urease）中和吞噬體pH，阻止招募液泡質子ATPase；抑制自噬和自噬泡形成，減少可能被裝載到MHC-II分子上的抗原肽；減少抗原肽暴露，抑制組織蛋白酶S，不完全切割MHC -II相關的恒定鏈（MHC class II associated invariant chain，Ii），導致到達抗原遞呈細胞表面的穩定的肽荷載MHC -II分子（stable peptide - loaded MHC class II molecule）數量降低.結核桿菌感染過程中MHC-I抗原遞呈.被結核桿菌感染的巨噬細胞中，內質網新合成的MHC-I 分子裝載上細胞漿蛋白酶體產生的肽段，被 TAP（transporter associated with antigen presentation）運輸到內質網腔.細胞漿來源的肽段被內質網腔中的氨肽酶（aminopeptidase）進一步切割.分枝桿菌蛋白可能從吞噬體逃逸至細胞漿，然后被MHC-I途徑遞呈.吞噬體腔內可能將肽段裝載到MHC-I分子.液泡途徑交叉遞呈可能涉及轉移內質網膜組分如新合成的MHC -I 分子和TAP分子到吞噬體膜，裝載細胞漿中產生的肽段.吞噬體腔內蛋白酶可能產生肽段，也可能裝載到質膜循環來的MHC-I分子.迂回途徑（detour pathway）含有胞內致病菌如結核桿菌的小泡可以被MHC -I交叉遞呈.被感染的細胞先凋亡，釋放的凋亡小泡攜帶分枝桿菌抗原到未感染的樹突狀細胞.結核桿菌感染可以主動抑制或者繞開上述各種途徑.

2.5 結核桿菌逃避宿主TLR信號傳遞的效應分子結核桿菌的脂蛋白（lipoprotein）和脂聚糖（lipoglycan）：宿主的TLR2 異二聚體可以識別位于結核桿菌細胞壁以及分泌膜泡（secreted membrane vesicles）的脂蛋白和脂聚糖，如lpqH（19 kDa 脂蛋白）和抑制溶酶體的 lprI［20］.TLR2 識別這些組分后，激活巨噬細胞，表達細胞因子，形成肉芽腫［21］. TLR4和TLR9 也可能參與識別.不同受體介導的信號傳遞都涉及共同的接頭分子（adaptor molecule）-髓狀分化因子MyD88（myeloid differentiation factor -88）.缺失MyD88 的小鼠對氣溶膠形式的結核桿菌異常敏感，感染后42 天即死亡.這與MyD88 在白介素-1 受體（interleukin -1R，IL -1R）信號傳遞中的功能有關，與其在TLR2、TLR4 或TLR9 激活途徑中的功能無關.MyD88 介導的信號轉導在人體結核桿菌感染中的作用尚待研究.先天MyD88 或IRAK-4 缺陷的個體并未對結核桿菌異常敏感.依賴TLR2 的耗盡胞內 IRAK1（IL -1 receptor associated kinase -1）可以抵消 TLR9 信號傳遞促進的Th1 免疫. TLR2 信號傳遞使結核桿菌感染過程中不能產生最適的免疫激活，產生IL -10，最終下調抗原特異性CD4+T細胞激發［22］.非致病分枝桿菌細胞壁組分脂阿拉伯甘露聚糖（lipoarabinomannan，LAM）是TLR2 激活劑，免疫原性強.來自致病分枝桿菌的甘露糖加帽的脂阿拉伯甘露聚糖（mannosecapped LAM，ManLAM）則缺乏免疫原性.細胞壁中雖然富含這類糖脂，但不容易啟動巨噬細胞的γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）受體介導的信號傳遞、樹突狀細胞產生IL-12p70、吞噬體成熟、被感染細胞凋亡等效應. TLR2 多態性影響宿主對結核桿菌的易感性.結核桿菌的TLR2 配體可以改變宿主細胞環境，有利于細菌持留.宿主細胞表達的C 型凝集素受體 CLEC4E（C - type lectin receptor 4E）［23-24］和 TLR4（Toll -like receptor 4）可以激活MyD88、PtdIns3K、STAT1 和 RelA/NFκB，增加溶酶體的產生，降低IL-10 和IL-4 表達，促進自噬，限制 結 核 桿 菌 存 活［25］. CLEC4E rs10841845 和rs10841847 賦予保護性免疫［26］.

2.6 結核桿菌逃避宿主NLR 信號傳遞的效應分子傳統的觀點一般認為結核桿菌進入宿主吞噬細胞后，主要滯留在被改變了的內吞體，胞內階段不進入細胞漿.大約1993 年，開始有證據表明，結核桿菌可以從吞噬體逃到細胞漿.這種逃離是協調有序的行動.電鏡觀察單核細胞衍生的樹突狀細胞與致病分枝桿菌的相互作用發現，分枝桿菌依賴早期分泌性抗原靶標-6（early secretory antigenic Target-6，ESAT-6，也稱為 ESXA）分泌系統 -1（ESX-1）定期從吞噬溶酶體（phagolysosome）逃到細胞漿中進行復制.因此可以認為，細胞漿模式識別受體也參與了宿主針對結核桿菌的先天免疫和后天免疫.ESXA也是細胞壁結合蛋白質［27］.

細菌肽聚糖（peptidoglycan，PGN）的胞壁酰二肽（muramyl dipeptide，MDP）：這是 NOD2 受體的配體.結合MDD 后，NOD2 可以與多個信號傳遞中間分子寡聚化（oligomerization），啟動細胞應答，包括從自噬到炎癥性細胞因子的產生.結核桿菌的MDP獨特之處是具有 N -糖基化修飾（N - glycolyl MDP），而不是其他細菌的N -乙酰化修飾（N -acetylated MDP）.MDP結構差異使結核桿菌可以使得巨噬細胞通過受體相互作用蛋白激酶2（receptor-interacting protein kinase-2，RIP2）和干擾素調節因子5（interferon regulatory factor - 5，IRF5）途徑產生 I 型 IFN 如 IFN - α/β. ESX -1 介導破壞吞噬體膜，MDP 片段進入細胞漿，才能夠被識別.結核桿菌促進I 型IFN 信號傳遞，抵消宿主保護性IL -1β 和IFN -γ 信號通路的作用.利用I型IFN受體缺陷小鼠進行的實驗表明，IFN -α/β不影響結核桿菌在肺部的生長，甚至促進細菌在肺外繁殖.最近，細胞漿受體NLR在微生物感染中的作用備受關注.激活后，NLR 被招募到大分子復合體 - 炎癥體（inflammasome）. NLR 含有 pyrin 的功能域（PYD）與含有PYD 和天冬半胱酰胺酶激活與招募功能域（caspase activation and recruitment domain，CARD）的接頭蛋白（adaptor protein）ASC 相互作用，完成該招募.天冬半胱酰胺酶-1 前體（pro -caspase-1）被加工為具有活性的酶，細胞分泌IL-1β、IL -18 和IL -33.多數情況下，這種激活導致宿主細胞編程死亡 - 焦亡（pyroptosis）［28-29］.關于NLR家族中的NLRP3，以及結核桿菌體內外感染中的炎癥體末端效應分子的研究較多.不論小鼠還是人巨噬細胞中，結核桿菌依賴ESAT -6 激活炎癥體，釋放IL -1β，導致焦亡.小鼠樹突狀細胞分泌IL-1β則不依賴NLRP3 -和ASC，也未發現焦亡.不能產生IL-1β，或者不能對IL -1β 應答的遺傳缺陷小鼠對氣溶膠形式的結核桿菌攻擊更易感，且不依賴 TLR、NLRP3、caspase -1 和 ASC.慢性感染小鼠時，細胞漿中的這些受體協同作用，維持肉芽腫結構，穩定結核菌毒力.結核桿菌可以控制炎癥體激活的時機，促進持留感染.

2.7 結核桿菌逃避宿主C型凝集素受體信號傳遞的效應分子分枝桿菌索狀因子（cord factor）-海藻糖 -6，6′ - 二枝菌酸（trehalose -6，6′ -dimycolate，TDM）：注射TDM乳化油滴可以誘導小鼠產生類似結核桿菌感染的無細胞的肉芽腫（granuloma）.結核桿菌負責TDMs合成的基因包括：環丙烷合成酶（cyclopropyl synthetase）pcaA 和cmaA2.如果這些基因缺失，枝菌酸（mycolate）結構會改變，宿主的免疫應答也會相應變化［30-32］.M. tuberculosis pcaA 突變菌株的 TDM 含有缺乏環丙烷基（cyclopropyl group）的 α -枝菌酸（α -mycolate），酮枝菌酸（ketomycolate）含量很高，誘導野生型小鼠巨噬細胞產生促炎癥細胞因子和形成新肉芽腫的能力降低.M.tuberculosis cmaA2突變菌株缺乏反式構象（trans -configuration）的枝菌酸環丙烷基（mycolate cyclopropyl group），對小鼠的毒力增加.從該突變菌株分離的TDM 刺激巨噬細胞產生腫瘤壞死因子 - α（tumor necrosis factor -α，TNF -α）的能力增加 5倍.結核桿菌mmaA4 負責在枝菌酸合成過程中，在中長鏈枝菌酸（meromycolate）鏈的遠端引入羥基（hydroxyl group），形成羥基枝菌酸（hydroxymycolate）中間產物.結核桿菌mmaA4 突變菌株在小鼠中的毒力和存活能力降低，從其分離的TDMs增加小鼠巨噬細胞產生IL-12p40，而野生型的TDM抑制小鼠巨噬細胞產生IL-12p40.

TDMs的受體是巨噬細胞誘導性C型凝集素受體 mincle（macrophage -inducible C -type lectin receptor，mincle）. mincle 經 Syk - CARD9 - Bcl10 途徑激活巨噬細胞，產生細胞因子. CARD9 缺失小鼠能夠發動有效的適應性免疫應答，但是對氣溶膠形式的結核桿菌攻擊易感，結核桿菌在其中的生長不受限制，肺部中性粒細胞增多（neutrophilia）.枝菌酸激活 Mincle［33］，部分通過放大 IL -1R 信號傳遞，產生形成Th1 和Th17 CD4+T細胞非常重要的細胞因子. Mincle 是TDM 體內外佐劑效應和誘導中性粒細胞增多癥所需.但是，比較同窩小鼠的Mincle缺陷和野生型對氣溶膠形式結核桿菌感染的反應發現：二者的器官病理或者細菌數量無顯著差異.這可能是結核桿菌可以微調枝菌酸合成，以使產生的炎癥水平足以促進肉芽腫發育但又不刺激產生過量IL -12p40 所致.通過調控 IL -12p40水平，結核桿菌得以緩慢持留或者增殖，宿主也不至于快速死亡.

關于中性粒細胞在結核病中的作用，現在又有新認識.中性粒細胞是結核桿菌感染的常見吞噬細胞之一，但是關于其保護性或者病理作用，目前尚有爭議.結核病患者中發現了一群低密度中性粒細胞（low density neutrophils，LDNs）［34］.其出現頻率、表型、功能、基因表達、抑制T 細胞的活性等均不同.活動性結核病患者外周血LDN 高表達CD66b，CD33，CD15 和 CD16.與 NDNs 比較，LDNs 差異表達的基因有 12 個：CCL5、CCR5、CD4、IL10、LYZ 和STAT4 上調，而 CXCL8、IFNAR1、NFKB1A、STAT1、TICAM1 和 TNFα 下調. LDNs 不能吞噬活結核桿菌，也不能產生氧化爆發（oxidative burst），或者NETosis，但能夠抑制抗原特異性和IL -10 部分介導的多克隆T細胞增殖.

2.8 抑制巨噬細胞效應分子功能和吞噬體成熟感染過程中，結核桿菌主要滯留在巨噬細胞中.結核桿菌具有多種機制，確保在巨噬細胞中持留和繁殖.結核桿菌可以阻斷被感染巨噬細胞的吞噬體-溶酶體融合，避免溶酶體中水解酶（lysosomal hydrolase）、低pH，以及其他殺菌的溶酶體組分的攻擊.有關機制研究很多但都不透徹.分枝桿菌吞噬體（mycobacterial phagosome）不能摻入小泡 ATP 酶（vacuolar ATPase），因此不能酸化（acidification）.分枝桿菌吞噬體細胞漿一側的膜上還可以滯留coronin-1（tryptophan aspartate-containing coat protein，TACO）［35-37］，而與溶酶體融合的吞噬體則會迅速丟失該蛋白.揭示具體機制還需要超越結核桿菌抑制吞噬體-溶酶體融合的分子細節.

結核桿菌的絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threonine kinase）pknG 是抑制吞噬體-溶酶體融合的效應分子. pknG 重組 M. smegmatis 可以抑制吞噬體-溶酶體融合，缺失pknG 的結核桿菌則不能定位到宿主細胞的溶酶體樣結構. pknG 通過磷酸化底物garA 調控三羧酸循環、感知氨基酸含量［38］，pknG也協調潛伏信號，與氧化還原電勢、低氧持留有關［39］，這也涉及其 Rubredoxin 功能域的氧化去折疊［40］.分泌性蛋白質酪氨酸磷酸酶（secreted protein tyrosine phosphatase，ptpA）結合巨噬細胞小泡質子ATP酶（vacuolar H+-ATPase）的 H 亞基，抑制小泡酸化（vacuolar acidification）.強毒性結核桿菌的酸性和吞噬體調控的分子（acid - and phagosome regulated，aprABC）基因位點（locus）參與應答吞噬體內酸性脅迫. phoPR 操縱子（phoPR operon）感知酸脅迫，表達aprABC，調控細胞壁脂類合成和隱蔽（sequestration），確保細菌在低 pH 時存活［41］.結核桿菌腺苷酸環化酶（adenylate cyclase）Rv0386導致巨噬細胞細胞漿中的環腺苷一磷酸（cyclic AMP）水平瞬間激增［42-43］，促進蛋白激酶 A（protein kinase A，PKA）依賴性磷酸化轉錄因子CREB（cyclic AMP response element binding）的表達，擾亂宿主信號傳遞.

2.9 結核桿菌防止自噬的效應分子自噬（Autophagy）是宿主負責細胞自我穩態、可以誘導的過程，可以清除受損細胞器或者不再需要的亞細胞結構.自噬先形成雙層膜結構的自噬泡（autophagic vacuole），吞噬細胞器（organelle）或者細胞漿中其他包涵體（inclusion body），與溶酶體融合后，自噬泡吞噬的物質被消化.包括結核桿菌在內的致病菌可以定位到宿主細胞內的自噬泡.自噬可以清除結核桿菌.營養缺乏或者IFN -γ 處理都可以誘導結核桿菌感染的細胞自噬.含有結核桿菌的吞噬體獲得溶酶體標志分子后酸化.脂多糖處理細胞后，被感染細胞中定位到自噬體（autophagosome）的結核桿菌數量激增.這提示 TLR4 介導自噬的誘導.ESX-1 介導增加吞噬體的透性（permeabilization）［44-45］.ESX-1 是多亞基膜復合體，在膜上形成通道.結核桿菌該復合體有5 個膜蛋白：EccB1、EccCa1、EccCb1、EccD1 和 EccE1.缺失 EccE1 后，EccB1、EccCa1 和 EccD1 的水平降低，ESX -1 分泌功能丟失，結核桿菌毒力降低，但不影響EspB 分泌［46］.結核桿菌激活巨噬細胞自噬依賴感知胞內DNA的STING、維生素D受體和IL-1R等途徑.從自噬細胞分離的結核桿菌存活率降低.髓細胞（myeloid cell）條件性敲除自噬功能（Atg5flox/floxLysMCre）的小鼠對氣溶膠形式攻擊的結核桿菌特別易感，細菌在其中的增殖不受限制，增加炎癥性細胞因子的產生，肺部形成大的膿腫病灶.結核桿菌胞內存活增強基因（enhanced intracellular survival，eis）編碼對溫度穩定的六聚體蛋白（temperature -stable hexameric protein）.該蛋白直接乙酰化c-Jun N-末端激酶（c -Jun N -terminal kinase，JNK）特異性磷酸酶，抑制吞噬體成熟、活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產生和自噬.

結核桿菌利用宿主miRNA 通路協調抑制自噬，重編程宿主脂類代謝，確保其胞內存活和持留［47］.結核桿菌誘導 microRNA （miRNA）miR-33及其附隨鏈（passenger strand）miR -33*，綜合抑制參與自噬、溶酶體功能和脂肪酸氧化的途徑，有利于其復制.遺傳或者藥物抑制miR -33 和miR -33* ，阻遏關鍵自噬因子（如 ATG5、ATG12、LC3B和LAMP1）和AMPK -依賴激活轉錄因子FOXO3和TFEB，促進自噬流（autophagy flux），增強脂類分解代謝和結核桿菌異噬（xenophagy）.

2.10 結核桿菌PE和PE_PGRS蛋白介導免疫逃避結核桿菌基因組編碼至少99 個PE 家族蛋白質，約為其基因組編碼能力的4%.該家族蛋白質具有特征性的脯氨酸（proline）和谷氨酸（glutamic acid）（PE）模體（motif）.其中61 個為 PE_PGRS，其C-末端功能域含有多態性富含鳥嘌呤胞嘧啶序列（polymorphic guanosine - cytosine - rich sequences，PGRSs），在大小、序列、重復拷貝數方面都具有多態性.結核桿菌和其他致病分枝桿菌中，PE 和 PE_PGRS蛋白質顯著擴增（expansion），可能與致病和持留相關.這些蛋白質主要位于細胞壁和細胞膜，也就是結核桿菌-吞噬體相互作用的表面，可能與宿主相互作用密切相關.因為缺乏標準的N端信號肽，其分泌由VII型分泌系統ESX-5 介導.M. marinum PE_PGRS 蛋白質在爪蟾（Xenopus）感染模型中是毒力因子.兩個PE_PGRS 基因的轉錄在被感染的爪蟾肉芽腫樣結構中上調.突變菌株在巨噬細胞中的存活力降低. PE_PGRS33 是該家族最初被研究的分子.表達PE_PGRS33 的非致病 M. smegmatis重組菌在巨噬細胞內的存活增加，被感染巨噬細胞壞死增多，TNF -α 表達增加，一氧化氮（nitric oxide，NO）量減少.異位表達 PE_PGRS33 的Jurkat T 細胞發生凋亡，該過程依賴TLR2 信號途徑.Bcl-2 可以阻斷PE_PGRS33 凋亡誘導效應.結核桿菌感染巨噬細胞或小鼠肺部時，差異調控PE_PGRS33、PE_PGRS16 和 PE_PGRS26 的表達.

結核桿菌PGRS 分子差異調控宿主的細胞因子產生［48］.PE_PGRS33 提高 TNF - α 和 IL -10 產生，而降低 IL -12p40 和 NO 的產生. PE_PGRS16增加IL-12p40 和NO水平，降低IL-10 數量.PE_PGRS26 的效應與 PE_PGRS16 相反. PE_PGRS62降低IL-1β、IL-6、誘導性一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synThase，iNOS）水平，阻斷吞噬體成熟.

結核桿菌PGRS 分子阻斷吞噬體成熟所需的Ca2+信號傳遞［49］.PE_PGRS 家族的大多數成員的PGRS功能域具有鈣離子結合蛋白典型的Ca2+結合功能域 -平行 β -螺旋（parallel β -helix），目前僅發現 5 個例外，即 PE_PGRS8、PE_PGR12、PE_PGR17、PE_PGR60 和 PE_PGR62.包括 PGRS 在內的PE-PPE 家族分子結構在無序-有序之間變化（disorder - order structural dynamics），逃避宿主免疫攻擊.

3 結核桿菌逃避適應性免疫

結核桿菌可以破壞或者抑制宿主抗原遞呈全過程，破壞T細胞介導的免疫.

3.1 感染抗原遞呈細胞逃避抗原特異性T細胞應答.結核桿菌可以感染多種吞噬細胞如巨噬細胞、中性粒細胞、間質巨噬細胞和樹突狀細胞.每種細胞類型對于結核桿菌感染生物學都有其貢獻［50］.巨噬細胞是結核桿菌滯留的主要宿主細胞.巨噬細胞可以經MHC -I/MHC -II 遞呈結核桿菌肽段給效應T 細胞.T 細胞的殺菌活性依賴NO 等分子.抗原遞呈對于已經激發的效應T細胞或者記憶T細胞的抗菌功能非常重要.激發未致敏T細胞攻擊結核桿菌的能力方面，巨噬細胞的功能有限，主要依賴樹突狀細胞.樹突狀細胞負責加工和遞呈各種抗原給未致敏的CD4+和CD8+T 細胞.綠色熒光蛋白GFP標記的重組結核桿菌有利于觀察亞細胞定位.氣溶膠形式攻擊的GFP重組結核桿菌主要定位在小鼠肺部的髓狀樹突細胞（CD11chighCD11bhigh）、肺泡巨噬細胞 （CD11chighCD11blow），以及招募來的間質巨噬細胞（recruited interstitial macrophage）（CD11clowCD11blow）、單核細胞、中性粒細胞.肺部被感染小鼠的樹突狀細胞將分枝桿菌抗原運輸至縱膈淋巴結（mediastinal lymph node），啟動適應性免疫.未被充分激活的巨噬細胞和樹突狀細胞不能殺死胞內細菌，反而成了結核桿菌的藏身之地，便于擴散和延遲適應性免疫的啟動，類似“特洛伊木馬”，攜帶結核桿菌從原發感染部位播散到其他組織.組織樹突狀細胞遷移能力強，因此，可能是結核桿菌播散的關鍵.

3.2 結核桿菌破壞樹突狀細胞成熟樹突狀細胞有效引發抗原特異性T 細胞需要一個正常的成熟進程，但是結核桿菌感染會改變該成熟進程.人單核細胞衍生的樹突狀細胞被結核桿菌感染后，正常成熟進程被破壞.樹突狀細胞正常成熟過程伴隨MHC-II分子快速動員到細胞表面.結核桿菌感染后，MHC -II 不能快速遷移到細胞表面.也有數據表明，結核桿菌感染可能導致大量MHC-II分子遷移到細胞表面，但新MHC -II 分子的合成則會停止.內吞體中，結核桿菌分泌的抗原無法被裝載到MHC-II分子上.結核桿菌逃避免疫的動力學模型（kinetic model）可以解釋被感染的樹突狀細胞遞呈細菌抗原能力有限的現象.但是不能解釋未被感染的樹突狀細胞為何可以交叉遞呈（cross -presentation）結核桿菌分泌抗原.結核桿菌感染細胞凋亡，其凋亡小泡（apoptotic vesicles）中的蛋白質和脂類抗原可能被交叉遞呈［51］.抗原交叉遞呈可以解釋為何被結核桿菌感染的動物T 細胞偏好識別分泌蛋白抗原.

3.3 調控CD4+T輔助細胞的分化CD4 T 細胞是人體和其他動物控制結核桿菌感染的關鍵. CD4 T 細胞分化、發育的途徑多樣，以便適應、限制或者殺死多種致病菌.與控制結核桿菌，提供保護性免疫密切相關的包括：產 IFN - γ 的 Th1 細胞，FoxP3+調控 T 細 胞 （FoxP3+regulatory T cells，Treg）、產 IL -17 的 Th17 細胞.結核分枝桿菌表達模式識別受體的配體分子，激發的宿主環境起初有利于Treg細胞增殖，隨后則有利于Th1 和Th17 細胞增殖.結核桿菌感染小鼠的肺部Treg 細胞增殖，延遲Th1 細胞從縱膈淋巴結歸巢到肺部，限制這些細胞的功能發揮.結核桿菌可以招募CD103+樹突狀細胞到被感染組織.結核桿菌氣溶膠攻擊的小鼠肺部炎癥部位具有產IL -17 的Th17 細胞.疫苗介導的保護性免疫與產IL -17 的Th17 細胞數量正相關.IL-6 和IL-1β存在時，這些Th17 細胞進行分化.IL-23 是維持Th17 細胞分化狀態的關鍵細胞因子.結核桿菌感染或者注射死結核桿菌時，宿主大量產生這些細胞因子.IL-23 刺激被感染小鼠的肺部形成依賴CXCL13 的B 細胞濾泡（follicle），控制結核桿菌.IL-17 間接作為中性粒細胞的趨化因子（chemoattractant）.被感染的中性粒細胞凋亡，將分枝桿菌抗原投送給樹突狀細胞，有利于激發未致敏CD4+T細胞.結核桿菌抑制中性粒細胞凋亡和Th17 細胞激活，降低中性粒細胞肺部浸潤.關于結核病的Th1 免疫研究較多.識別抗原后，Th1 細胞產生多種細胞因子如IFN-γ、TNF-α和IL-2.這些細胞也稱為多功能T細胞.它們在結核桿菌感染或者疫苗保護中的作用尚有爭議.結核桿菌感染小鼠的肺部存在大量特異性的CD4+T 細胞，其中可能存在尚未被發現的殺菌免疫的關鍵細胞類型.四聚體技術（tetramer）［52］分析抗原特異性 CD4+T細胞發現了結核桿菌特異性的效應記憶CD4+T細胞分化細胞（M. tuberculosis-specific effector memory CD4+T cell）以及記憶干細胞（stem cell memory，TSCM）CD4 T 細胞［53］.根據細胞表面 PD -1（programmed death receptor - 1）和 KLRG1（killer cell lectin-like receptor G1）兩種分子的表達情況，效應CD4 T細胞分為三群.這些標記分子可以區分自我更新（self renewing）和終末效應（terminal effector）亞群.KLRG1negCD4 T 細胞的PD -1 表達或高或低，但是產生細胞因子的能力都很低，都能夠自我更新.高表達KLRG1 且缺乏 PD -1 的 CD4 T 細胞產生大量IFN-γ和TNF-α，但不增殖.感染90 天及之后，缺乏KLRG1 的小鼠能夠更有效發動針對結核桿菌的T細胞應答，體內細菌數量更低.PD-1缺陷小鼠更容易被氣溶膠攻擊的結核桿菌致死，這些小鼠具有主要由浸潤中性粒細胞組成的大片無序損傷.根據細胞因子產生情況，CD4 T 細胞多功能性降低，耗盡CD4 T 細胞后，結核桿菌感染的小鼠早期不容易死亡.這兩種現象之間的聯系，尚無研究.KLRG1 和PD-1 不僅僅是表型標記，可能在結核桿菌特異性的CD4 T 細胞自我更新為終末效應細胞的發育中發揮功能［54-55］.結核病患者中的研究也提示PD -1 具有重要作用［56］.控制結核桿菌感染需要CD4 分化表型不同的細胞亞群之間的平衡，結核桿菌也可能通過打破這種平衡逃避免疫.但是，結核桿菌具體哪些效應分子參與調控這些細胞亞群的分化與平衡，則有待研究.

3.4 結核桿菌分泌蛋白可能作為免疫偽裝分子（decoy）雖然有爭議［57］，結核桿菌的免疫偽裝分子可能是表達一個或者小部分抗原如TB10.4［58］，控制宿主免疫應答.這些抗原可能屬于偽裝分子，轉移宿主免疫的方向，掩護真正重要的結核桿菌抗原.偽裝抗原與MHC -I/MHC -II 分子的親和力高，而其它在分化形成保護性效應/記憶T 細胞中更重要或者次優勢的表位，與MHC-I/MHC-II分子的親和力反而較弱.免疫優勢的分泌抗原Ag85B并非細菌存活必需，感染建立后，往往停止表達.偽裝抗原可以破壞T細胞應答，或者雖然可以激發強免疫應答，但隨后不能識別致病菌.激發靶向這些偽裝抗原的效應T 細胞去搜索不再存在的抗原靶標，不能識別被結核桿菌感染的巨噬細胞.因為感染成功的結核桿菌不再表達偽裝抗原表位，反而表達免疫系統無法識別的抗原.一旦建立了主要免疫應答的初始靶標，結核桿菌可能主動抑制宿主針對次要表位的新應答，或者抑制那些延遲表達的表位，防止形成真正的保護性應答.密度感應（quorum sensing）反饋調節可能控制結核桿菌的抗原表達［59-60］.

比較基因組研究也支持結核桿菌的免疫偽裝策略.測序比較21 株結核分枝桿菌復合群（M. tuberculosis complex）的基因組發現，編碼人T細胞抗原表位的序列在這些菌株中高度保守.16 個人T細胞抗原的序列在99 株細菌中保守.T細胞識別其優勢表位（immunodominant epitope）可能賦予結核桿菌一些選擇優勢，這可能是結核桿菌這些表位不突變或者逃避免疫選擇壓力的原因所在.偶爾也發現針對非分泌蛋白或者細胞漿蛋白的抗體，結核桿菌特異性T細胞應答一般不會靶向非分泌蛋白或者細胞漿蛋白質.但這并不完全排除T細胞針對這些抗原進行應答.用非分泌抗原免疫的動物，對隨后的分枝桿菌攻擊也有保護性.非分泌蛋白不能有效激發MHC-I、MHC-II限制性T細胞應答可能與結核桿菌主動逃避免疫有關.滅活分枝桿菌疫苗的效果不如減毒活疫苗也提示保護性免疫需要分泌蛋白.

比較潛伏結核桿菌感染者的CD4 T 細胞識別預測結核桿菌基因組中的HLA -DR、-DB 和-DQ表位的能力，發現有3 個明顯的抗原島（antigenic islands）［57］.抗原島部分包括 ESX 分泌蛋白，也包括本身不分泌的ESX分泌機器.現在疫苗開發用的主要是分泌的優勢抗原，這些抗原可能是沒有保護效果的偽裝抗原.比較分泌抗原和非分泌抗原的免疫保護效果，可能有助于揭示更多細節，指導新疫苗設計.

3.5 結核桿菌感染滯后適應性免疫的激活針對結核桿菌的肺部免疫的明顯特征是滯后、遲緩.小鼠中，結核桿菌可以不受控制地生長21 天.結核桿菌Ag85B和ESAT-6 抗原經MHC-II遞呈的TCR轉基因小鼠適合作為研究低劑量氣溶膠結核桿菌攻擊后，小鼠肺部適應性免疫應答早期事件工具［61］.Ag85B 和 ESAT6 是分泌抗原，在感染初期高表達，3 周后表達降低.從TCR 轉基因鼠過繼轉移T細胞，提示針對即使高表達的分泌抗原，肺結核初期的T細胞應答也很緩慢.結核桿菌感染后，小鼠T細胞應答在引流縱膈淋巴結形成.這需要肺部遷移的樹突狀細胞把結核桿菌運輸到淋巴結.這種運輸很緩慢，可以解釋T 細胞應答滯后.11 ～12 天后，才可以檢測到T細胞應答.這種滯后，使得結核桿菌得以在宿主體內建立感染和持留.結核桿菌感染早期，雖然可以產生許多分泌抗原，但是宿主免疫系統不能快速發動保護性免疫.氣溶膠攻擊比靜脈感染形成T細胞應答更慢.致病菌可能抑制了肺部抗原遞呈細胞.這也是結核桿菌適應其自然感染路徑的表現.這與病毒或者其他胞內致病菌如李斯特單增菌（Listeria monocytogenes）感染的動力學不同.通過抑制抗原遞呈的關鍵步驟，結核桿菌得以破壞、逃避或者改變抗菌免疫應答的動力學.

3.6 結核桿菌操縱MHC -II 抗原遞呈人體和實驗動物中，MHC- II 限制性CD4+T細胞都是控制結核桿菌的關鍵.結核桿菌增強胞內存活和持留可能破壞MHC- II 途徑.結核桿菌阻斷吞噬體成熟及與溶酶體的融合，維持有利于細菌存活的胞內環境.這也減少了被加工的結核桿菌抗原，降低了攜帶結核桿菌表位的MHC-II復合體的形成，破壞針對結核桿菌的CD4 T細胞應答.自噬（autophagy）和MHC- II遞呈胞內蛋白質的肽段有關.結核桿菌抑制被感染細胞自噬，限制產生MHC-II遞呈的表位.自噬確實可以增強小鼠樹突狀細胞遞呈分枝桿菌肽，提高卡介苗免疫效果.19kDa 脂蛋白抗原LpqH是結核桿菌分泌的三酰基化細胞壁蛋白（triacylated exported cell wall protein），也是 TLR2 配體，可以降低結核桿菌感染的巨噬細胞表面的MHC -II分子數量.TLR2 信號過度或者傳遞時間延長，都可以降低MHC-II 轉錄反式激活因子（MHC class II transcriptional transactivator，CIITA）的活性［62-63］，干擾IFN-γ信號傳遞.19kDa脂蛋白依賴TLR2 刺激巨噬細胞，誘導負責阻遏CIITA 轉錄的轉錄因子C/EBP的異構體的表達.TLR2 也激活MAPK（mitogen activated protein kinase），MAPK進而磷酸化C/EBP 異構體.磷酸化 C/EBP 異構體與 CIITA 啟動子 I和IV區的結合親和力增加，抑制CIITA 表達.體外培養細胞中，19kDa 脂蛋白可以降低MHC -II的表達，但是體內是否如此則有待實驗研究.體內，TLR2 缺失或者完全的骨髓嵌合細胞，MHC -II 的表達無顯著區別.19kDa脂蛋白下調MHC -II表達為何局限在被感染的細胞？可能是該蛋白不穩定，半衰期短，自分泌或者在吞噬體腔內分泌.19kDa脂蛋白只是結核桿菌的多個TLR2配體之一.其他配體如 LprA、LprG （Rv1411c）、38kDa 脂蛋白（PstS -1、phoS或者 phoS1）、ESAT -6、LAM 家族復雜糖脂.Mtb LprE通過TLR2 依賴p38 -MAPK-CYP27B1 -VDR途徑，上調依賴維生素D3 -應答的組織蛋白酶，抑制吞噬體-溶酶體融合，下調IL -12 和IL -22［64］.干擾組織蛋白酶（cathepsin）［65-66］或者堿化（alkalinization）胞內環境，都可以改變 MHC -II 分子胞內運輸.組織蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶（cysteine protease），負責 MHC - II 相關恒定鏈（MHC class II-associated invariant chain，Ii）的加工.這一步也是肽荷載（peptide loading）和細胞表面表達MHC-II 分子所必需的.組織蛋白酶S（cathepsin S，CatS）可能是該家族中最重要甚至唯一的負責切割Ii，產生MHC-II 分子的成員.結核桿菌感染誘導抑制性細胞因子IL-10，降低CatS 表達和活性.MHC-II分子滯留胞內，細胞表面荷載肽的MHC-II的表達降低.抗IL -10 抗體可以逆轉該效應，恢復CatS 表達，將成熟MHC -II 分子運輸到被感染細胞表面.分泌CatS 的重組BCG 可以恢復宿主細胞表面MHC -II 的表達水平.脲酶C 水解尿素為二氧化碳和氨.吞噬體內表達的分枝桿菌脲酶C（urease C）可以破壞 MHC -II 運輸［67-68］，使其滯留在胞內.脲酶防止MHC-II加工和裝載空間的酸化，抑制組織蛋白酶如CatS 的活性.其他組織蛋白酶如cathepsins L和D 的表達和活性也被抑制，破壞被結核桿菌感染的細胞中依賴MHC -II 的抗原加工和遞呈.Mtb 抑制CIITA 啟動子處的組蛋白乙酰化，干擾γ -IFN 處理的巨噬細胞的CIITA 過量表達.組蛋白去乙酰化酶抑制劑（histone deacetylase inhibitor，HDACi）丁酸鈉（sodium butyrate）可以逆轉上述效應.另外一個HDACi分子丙戊酸（valproic acid，VPA）不能逆轉結核桿菌或者其19kDa蛋白導致的CIITA表達抑制.但是，VPA或者γ-IFN處理都可以明顯降低巨噬細胞內的結核桿菌［69］.除此以外，結核桿菌還通過甲基化調控MHC -II 和CIITA的表達［70］.結核桿菌基因組編碼23 個ESAT-6 家族毒力因子.M. tuberculosis和M. bovis bacillus Calmette- Guerin 感染誘導 H3K9me2/3 甲基化增加，下調CIITA/MHC-II表達.M. tuberculosis ESAT-6 家族蛋白質EsxL（Rv1198）是該效應的激發分子［70］.但是這篇關于 EsxL 的論文2019 年撤稿［71］，具體原因未知.EsxL誘導表達一氧化氮合成酶、產生NO，以及p38 MAPK，并導致組蛋白賴氨酸N甲基轉移酶（histone -lysine N - methyltransferase 2，G9a）表達增加.如果抑制一氧化氮合成酶、p38 MAPK和G9a，則不會有 H3K9me2/3，CIITA 表達增加.下調CIITA及抗原遞呈主要與CIITA 啟動子IV 區的高度甲基化（hypermethylation）有關.表達 EsxL 的重組M. smegmatis也可以下調巨噬細胞或者小鼠脾臟細胞的與T 細胞增殖相關的IL -2. EsxL 增強CIITA 啟動子處的 H3K9me2/3，通過 NO 和 p38 MAPK激活，阻遏CIITA表達，抑制抗原遞呈.

iNOS/NO/KLF4 控制被感染巨噬細胞中分枝桿菌抑制CIITA/MHC-II-介導的抗原遞呈，逃避免 疫 監 視 （immune surveillance）. NOTCH/PKC/MAPK-激發的信號通路之間的相互作用對于產生iNOS/NO至關重要.NO 應答性招募雙功能轉錄因子KLF4 到CIITA啟動子處，對于 M. bovis BCG 感染過程中，組蛋白甲基轉移酶（histone methyltransferase）EZH2 或 miR -150 介導的表觀遺傳修飾（epigenetic modification）的協調非常關鍵，進而校準CIITA/MHC-II的表達.依賴 NO 的 KLF4 調控被感染巨噬細胞加工和遞呈卵清蛋白（ovalbumin）給應答性 T 細胞［72］.

3.7 結核桿菌影響MHC -I 抗原遞呈MHC -I遞呈抗原給 CD8+細胞裂解性 T 細胞.過去認為MHC-I分子遞呈靶細胞的細胞漿蛋白抗原的表位.但是，結核桿菌及其抗原主要位于內吞體或者胞外，似乎不被胞漿的MHC -I 遞呈.現已證明：在小鼠巨噬細胞、人單核細胞衍生的巨噬細胞，人單核細胞衍生的樹突狀細胞中，結核桿菌都可以直接進入被感染細胞的細胞漿.抗原交叉遞呈可以使MHC-I 加工和遞呈內吞的抗原. MHC -I 交叉遞呈吞噬體或者吞噬溶酶體腔中分枝桿菌蛋白的途徑涉及轉位到細胞漿.這涉及吞噬體膜上稱為dislocon的轉運蛋白.這樣運輸到細胞漿的分枝桿菌抗原可能在細胞漿中進行加工.抗原加工涉及多泛素化（polyubiquitination）、蛋白酶體介導的蛋白質水解，以及抗原加工相關轉運蛋白（transporter associated with antigen processing，TAP）運輸到內質網腔，與新MHC -I分子高效結合.dislocon 的性質仍然有爭議，有可能是ER 膜上的蛋白質運輸復合體如Sec61，負責把蛋白質轉運到 ER 腔，或者 AAA ATPase p97 負責將蛋白質從ER 轉運出，是內質網相關降解（ER -associated degradation，ERAD）途徑的一部分.吞噬體蛋白質組中具有Sec61 和AAA -ATPase p97.但未排除吞噬體制備中可能的ER 污染.結核桿菌感染可能導致吞噬體膜滲漏，細菌蛋白質得以進入細胞漿加工途徑.結核桿菌分泌蛋白ESAT-6 及其分子伴侶CFP-10 可以破壞細胞膜，在吞噬體內產生這些分子可能負責滲透進入細胞漿.結核桿菌感染的細胞有助于MHC -I 遞呈內吞體卵清蛋白（ovalbumin）.卵清蛋白的遞呈需要活菌.結核桿菌逃入細胞漿也需要編碼分泌蛋白ESAT-6 及其分子伴侶CFP -10 的RD1 位點及其分泌機器.MHC-I 抗原交叉遞呈提示CD8+T 細胞參與結核桿菌應答.這也稱為迂回途徑（detour pathway），需要未被感染的抗原遞呈細胞攝取來自凋亡的被感染細胞的致病菌抗原（脂類、肽類）.當然，其他途徑如來自被結核桿菌感染巨噬細胞的凋亡小泡也可以刺激CD8 T細胞.引流淋巴結的DCs細胞歸巢對于交叉遞呈非常關鍵.受體DC細胞中，小泡相關抗原的命運取決于內吞體，蛋白酶體加工途徑則占次要地位.小泡加工依賴皂素分子（saposin）解離凋亡小泡膜.凋亡小泡刺激TLR 受體，具有很強的佐劑效應.被感染細胞的小泡免疫，也具有保護效果［73］.MHC -I遞呈依賴 TAP 途徑，激發CD8+T細胞. CD1 分子攝取脂類抗原也與迂回途徑有關，但是不涉及MHC -II.這可以解釋為何結核桿菌某些抗原，如負責將超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SodA）運出胞外的編碼毒力相關分泌系統組分的secA2（Rv1821），等可以抑制宿主細胞凋亡［74］.SodA 抑制凋亡，控制 ROS 產生.分枝桿菌膜上的nuoG（Rv3151）編碼大亞基、質子外排I型NADH 脫氫酶復合體（type I NADH dehydrogenase complex），具有抗凋亡功能［75］.secA2 缺失的結核桿菌不能抑制巨噬細胞凋亡，顯著激活CD8+T細胞.重組BCG如果誘導的巨噬細胞凋亡多，則小鼠中保護性免疫更強.阻斷凋亡、誘導壞死可能是結核桿菌逃避或者滯后MHC -I 抗原遞呈的主要策略.結核桿菌感染時，PE_PGRS 家族分子阻遏MHC-I抗原遞呈給CD8+T細胞.轉染PE_PGRS -16和PE_PGRS -62 的哺乳動物細胞中，依賴泛素的蛋白酶體降解被抑制，減少了供MHC -I 遞呈的抗原肽段.PE_PGRS 蛋白存在移碼突變和讀框內突變，多數突變位于PGRS 重復區域，這可能與快速抗原變異，逃避CD8+T 細胞或者其他適應性免疫有關.

3.8 結核桿菌影響CD1 遞呈脂類抗原結核桿菌細胞壁富含脂類.CD1 分子遞呈的脂類可能參與T細胞介導的免疫.巨噬細胞一般不表達CD1 分子（CD1a、CD1b和CD1c）.脂類從被感染細胞轉移到未被感染的樹突狀細胞可能是CD1 遞呈脂類抗原的關鍵.脂類轉移可能通過迂回途徑，類似MHC -I交叉遞呈，與被感染巨噬細胞凋亡有關.結核桿菌阻斷被感染細胞凋亡與逃避CD1 脂類抗原遞呈有關.巨噬細胞產生的載脂蛋白E（apolipoprotein E）將脂類從被感染細胞轉移至樹突狀細胞.結核桿菌強毒株感染降低人單核細胞衍生的樹突狀細胞的CD1 分子表達，CD1a、CD1b 和 CD1c 表達降低主要體現在mRNA水平，結核桿菌的阻斷發生在轉錄水平.結核桿菌感染抑制CD1 轉錄也阻止單核細胞分化為樹突狀細胞.NKT細胞（natural killer T cell）識別CD1d分子遞呈的脂類抗原.激活的NKT細胞大量產生防御致病菌的一線分子IFN -γ.結核桿菌感染的小鼠，NKT細胞被糖脂α -半乳糖神經酰胺（α -galactosylceramide）激活，延緩發病.將 NKT 細胞轉入小鼠可以提高其抵抗結核桿菌的能力.CD1d缺失小鼠（CD1d-/-）或者 NKT 細胞 TCR Jα片段缺失小鼠（Jα18-/-mice）雖然缺失了 NKT 細胞，但是對結核桿菌的易感性無改變.這提示結核桿菌感染可能下調CD1d遞呈或者其他有待發現的激活NKT細胞的因子.也有研究發現，CD1d -介導的免疫應答，內吞體融合與結核桿菌存活，都與恒定鏈（invariant chain，Ii）有關. Ii 調控內吞體的停靠、融合控制內吞體運輸，包括MHC -II 和CD1d胞內運輸. CD1d 分子在Ii-/-巨噬細胞中缺陷，CD1d -限制性 iNKT 細胞不能阻遏結核桿菌復制［76］.

4 未來研究方向

4.1 訓練免疫（trained immunity）與效應分子有些（大約50%）卡介苗接種的個體，即使大劑量接觸結核桿菌，也不會形成活動性結核病或者潛伏感染.先天免疫細胞如單核細胞、巨噬細胞的表觀遺傳（epigenetic）改變，或者代謝重編程（metabolic reprogramming）可能參與早期清除和賦予保護性免疫［77］.但是，參與訓練免疫的效應分子，以及這些效應分子的具體作用機制，還需要研究.

4.2 免疫代謝（immunometabolism）是結核病病理研究的新方向［78］.免疫細胞的免疫功能和代謝功能，對于結核桿菌感染結局非常關鍵.感染結核桿菌的巨噬細胞產生極化，形成類似M1 表型：產生更多促炎癥細胞因子，主要通過好氧糖酵解（也稱瓦堡效應，Warburg effect）和戊糖磷酸途徑滿足能量和代謝需求，氧化磷酸化和脂肪酸氧化減弱.上調氧化和抗氧化防御應答，精氨酸代謝、合成生物活性的脂類［79］.未被感染的M2 型巨噬細胞，則具有抗炎活性，能量主要來自氧化磷酸化和脂肪酸氧化.其他吞噬細胞如樹突狀細胞、嗜中性粒細胞，在吞噬結核桿菌后，代謝適應也類似.吞噬細胞的效應功能如產生細胞因子、趨化因子、抗菌反應都會改變，最終決定了肉芽腫內結核桿菌的命運.目前已知參與這些細胞代謝重編程的因子有：低氧誘導因子 -1（hypoxia -inducible factor -1），哺乳動物雷帕霉素靶標（mammalian target of rapamycin），骨髓組織細胞增生（myelocytomatosis），過氧化物酶體增殖激活因子受體（peroxisome proliferator -activator receptor），sirtuins，精氨酸酶（arginase）、誘導性硝酸合成酶（inducible nitric acid synthase）和鞘磷脂（sphingolipid）.結核病患者的T細胞免疫并非最優也涉及免疫代謝. M. tuberculosis（Mtb）和M.bovis BCG 感染導致肺部CD8+T 細胞代謝通路改變，效應功能改變.首先是線粒體代謝退化，加強炎癥性細胞因子產生依賴糖酵解.隨后，細胞的能量缺陷，形成代謝靜止（quiescence）態.線粒體功能失調，表達抑制性受體.卡介苗感染缺乏這些現象.二甲雙胍（metformin）可以逆轉結核菌感染造成的T細胞能量缺陷［80］.結核桿菌也利用宿主脂類作為持留的主要碳源和能源［81］.宿主細胞的脂類被轉化為甘油三酯（triglycerides，TAG），貯存在細菌細胞漿，作為長期能源，因為分子量比糖原等小.結核桿菌細胞壁中TAG 含量高.結核桿菌TAG 和成途徑也是未來抗生素靶標.結核桿菌具有一系列底物偏好各異的酯酶.比如酯酶LipE（Rv3775）偏好中長鏈底物如己酸鹽（hexanoate）［82］.免疫代謝過程中，宿主和結核桿菌如何爭奪底物，如何劫持對方信號通路，則是未來需要重點關注的方向之一.