大豆多肽酸奶酶解工藝的研究

楊雨 劉國濤 靳前龍

摘 要：利用三酶復合法將大豆蛋白水解，然后進行乳酸發酵，研制成新型大豆多肽酸奶。通過酶解條件的研究，確定中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶三者的最佳酶解條件，再將3種酶復合，采用正交實驗的方法，其最佳酶解工藝最終得出結論為：中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶的比例為1∶2∶4，反應溫度55℃，反應時間4h，反應pH為6.5。同時確定最佳發酵條件：溫度38℃，反應接種量4%，發酵時間5h，嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌菌種比為1∶1。確定最佳的產品配方：蔗糖6%，乳粉4%，穩定劑0.9%。

關鍵詞：大豆多肽;酶解工藝;復合蛋白酶;發酵

中圖分類號：S-3 ? ? ? 文獻標識碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20201030015

1 材料與方法

總體工藝流程[1]：挑選大豆→浸泡→脫皮→磨漿→熱處理→過濾除渣→加蛋白酶→水解→酶滅活（80℃，15min）→均質→調配→接種乳酸菌→發酵。

1.1 主要材料

大豆：安陽市農業科學院提供，顆粒飽滿，無蟲蛀和霉變。

蛋白酶：木瓜蛋白酶（80萬U·g-1）、中性蛋白酶（10萬U·g-1）、菠蘿蛋白酶（50萬U·g-1）。

全脂乳粉：市售。

蔗糖：市售，干燥潔凈，顆粒晶體狀。

穩定劑：食品級，奶味飲料穩定劑。

菌種：嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermopHillus）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）。

1.2 主要試劑

20%甲醛溶液（預先中和）分析純，標準0.05mol·L-1NaOH溶液，0.25%的NaHCO3液體，0.05mol·L-1檸檬酸，其它化學試劑均為分析純。

1.3 主要儀器

精密pH計（酸度計），意大利哈納;JM 85A型膠體磨，山東省萊州市順通膠體磨廠;DM-2100AⅢ自分渣磨漿機，河北滄州鐵獅磨漿機械有限公司;HH—6電熱恒溫水浴鍋，河南智誠科技發展公司;YB881—4電熱恒溫鼓風干燥箱，蘇州豪順自動化設備有限公司;DPH-9012/9032型電熱恒溫培養箱，上海一恒;BYC—A電子計重天平，深圳市博佳電子儀器有限公司;79-1磁力加熱攪拌器，金壇市富華儀器有限公司。1.4 試驗方法

1.4.1 水解度（DH）的測定[2]

用甲醛滴定法測定，公式：

水解度（DH%）=（打斷肽鍵的數目/總肽鍵數）×100;水解度（DH）=（水解后生成的NH2基的量/樣品總含N量）×100%

1.4.2 水解后生成的NH2基的測定

由甲醛滴定法測得，樣品總含氮量由凱氏定氮法測定。

1.4.3 酸度的測定

用指示劑法測定食品中總酸（以乳酸計）。

1.4.4 三酶復合水解條件的確定[4-7]

采用正交實驗方法，以水解度為測定指標，考察復合酶比例（A）、反應pH值（B）、反應溫度（C）和反應時間（D）4個因素對水解度的影響。實驗方案如表1。

1.4.5 乳酸菌發酵條件的確定[1，8]

采用正交實驗法，以酸度（以乳酸計）為測定指標，酸度影響產品的色、香、味和穩定性，因此能更好的反映發酵的適宜條件[3]。考察反應溫度（A）、接種量（菌種占大豆蛋白水解液百分比）（B）和反應時間（C）3因素對發酵酸度的影響。實驗方案如表2。

1.4.6 產品配方優選實驗

由5～8人組成感官評定小組，根據產品的粘稠度、清液析出狀況、色澤、酸度、甜度、香味等方面的情況進行感觀評分，采取10分制[8]。產品配方優選正交實驗因素水平表如表3。發酵酸豆乳配方優選產品感官評定標準如表4。

2 結果與討論

2.1 大豆蛋白液最佳水解條件的確定

采用單因素試驗分析方法對3種酶的可控因素進行數據分析，以水解度為測定指標，考察其各自的蛋白酶用量、反應溫度、反應時間和反應pH值4個因素對水解度的影響，確定可控因素的最佳范圍。

2.1.1 中性蛋白酶水解的單因素分析

2.1.1.1 酶用量對DH的影響

量取100mL的大豆蛋白液5份，調pH至7.0，分別加入500U·g-1、1000U·g-1、1500U·g-1、2000U·g-1、2500U·g-1中性蛋白酶，55℃下反應3h后，終止酶解反應，測定水解度。結果如圖1所示，隨酶用量的增加，DH呈上升趨勢，在酶用量為2000U·g-1時最高。這主要是因為由于酶濃度過大發生自溶（自水解）現象，導致對底物水解作用減弱[9]。因此，最適酶用量為2000U·g-1。

2.1.1.2 溫度對DH的影響

量取100mL的大豆蛋白液5份，調pH至7.0，均加入2000U·g-1中性蛋白酶，分別在以下溫度中進行反應：40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，反應時間3h，終止酶解反應，測定水解度。

結果如圖2所示，隨反應溫度的增加，在55℃時DH最高。溫度對酶促反應的影響有2個方面，溫度提高可使反應速度加快，隨著溫度的提高，酶失活速度也開始加快。因此，適宜反應溫度為55℃。

2.1.1.3 時間對DH的影響

量取100mL的大豆蛋白液5份，調pH至7.0，均加入2000U·g-1中性蛋白酶，在55℃下分別反應2h、3h、4h、5h、6h后，終止酶解反應，測定水解度。

結果如圖3所示，隨著反應時間的逐漸增加，DH呈上升趨勢，在反應4h時DH最高。隨著時間的延長，水解度的上升趨勢應該趨于平緩，而圖中顯示有下降趨勢，主要原因可能是水解液水解時間過長，多肽分子進一步分解，影響了水解度的測定[10]。綜合考慮，適宜反應時間為4h。

2.1.1.4 pH對DH的影響

量取100mL的大豆蛋白液5份，調pH分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，均加入2000U·g-1中性蛋白酶，在55℃下分別反應4h后，終止酶解反應，測定水解度。結果如圖4所示，隨pH的逐漸增加，DH呈上升趨勢，在pH至7.0時DH開始下降。這是由于酶作為一種特殊的蛋白質分子，其酶催化反應的能力與環境pH值密切相關，環境pH值會影響酶分子的構像和酶分子及底物分子的解離狀態，從而影響酶的活性和酶促反應速度，pH值過高、過低均對酶促反應不利。因此，最適pH為7.0。

2.1.2 木瓜蛋白酶水解的單因素分析

2.1.2.1 酶用量對DH的影響

量取100mL的大豆蛋白液5份，調pH至7.0，分別加入6000U·g-1、7000U·g-1、8000U·g-1、9000U·g-1、10000U·g-1木瓜蛋白酶，55℃下反應3h后，終止酶解反應，測定水解度。結果如圖5所示，隨酶用量的增加，DH呈上升趨勢，在酶用量為9000U·g-1以后增加不是很顯著。因此，適宜的酶用量為9000U·g-1。

2.1.2.2 pH對DH的影響

量取100mL的大豆蛋白液5份，調pH分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，均加入9000U·g-1木瓜蛋白酶，在55℃下分別反應3h后，終止酶解反應，測定水解度。結果如圖6所示，隨pH的增加，DH呈上升趨勢，在pH至6.5時DH開始下降。由于pH過高、過低都會影響酶促反應，水解度最大時即為最佳pH。因此，最適pH為6.5。

2.1.2.3 時間對DH的影響

量取100mL的大豆蛋白液5份，調pH至6.5，均加入9000U·g-1木瓜蛋白酶，在55℃下分別反應2h、3h、4h、5h、6h后，終止酶解反應，測定水解度。結果如圖7所示，隨反應時間的增加，DH呈上升趨勢。一般來講，加酶量相同，時間越長，水解率越高，但達到一定的時間后上升趨勢減緩，綜合考慮到能耗、生產周期及防止水解液變質等因素，適宜反應時間為3h。

2.1.2.4 溫度對DH的影響

量取100mL的大豆蛋白液5份，調pH至6.5，均加入9000U·g-1木瓜蛋白酶，分別在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃下反應3h后，終止酶解反應，測定水解度。結果如圖8所示，隨反應溫度的增加，在55℃時DH最高。溫度對酶促反應的影響主要是溫度提高反應速度加快，但溫度過高則會使酶失活加快，從而使水解度降低。因此，適宜反應溫度為55℃。

2.1.3 菠蘿蛋白酶水解的單因素分析

2.1.3.1 酶用量對DH的影響

量取100mL的大豆蛋白液5份，調pH至6.5，分別加入1000U·g-1、2000U·g-1、3000U·g-1、4000U·g-1、5000U·g-1菠蘿蛋白酶，55℃下反應4h后，終止酶解反應，測定水解度。結果如圖9所示，隨酶用量的增加，DH呈上升趨勢，在酶用量為3000U·g-1以后增加趨勢不是很顯著。從經濟效益考慮，適宜酶用量為3000U·g-1。

2.1.3.2 溫度對DH的影響

量取100mL的大豆蛋白液5份，調pH至6.5，均加入3000U·g-1菠蘿蛋白酶，分別在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃下反應4h后，終止酶解反應，測定水解度。結果如圖10所示，隨反應溫度的增加，在55℃時DH最高。隨著溫度的提高，酶促反應速率加快，但溫度升高也加快了酶失活速率。因此，適宜反應溫度為55℃。

2.1.3.3 時間對DH的影響

量取100mL的大豆蛋白液5份，調pH至6.5，均加入3000U·g-1菠蘿蛋白酶，在55℃下分別反應2h、3h、4h、5h、6h后，終止酶解反應，測定水解度。結果如圖11所示，隨反應時間的增加，DH呈上升趨勢，在反應時間為4h以后趨于平穩。一般來講，要達到同樣的水解率，水解時間同酶的用量有關，酶的用量大，水解時間可以短些。加酶量相同，時間越長，水解率越高，但達到一定的時間后上升趨勢減緩，綜合考慮到能耗、生產周期及防止水解液變質等因素，以水解時間不宜超過4h為宜。因此，適宜反應時間為4h。

2.1.3.4 pH對DH的影響

量取100mL的大豆蛋白液5份，調pH分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，均加入3000U·g-1中性蛋白酶，在55℃下分別反應4h后，終止酶解反應，測定水解度。

結果如圖12所示，隨pH的增加，DH呈上升趨勢，在pH至6.5時DH開始下降。pH影響酶的活性和酶促反應速度，pH值過高、過低均對酶促反應不利。因此，最適pH為6.5。

2.1.4 三酶復合水解條件的確定

采用正交實驗方法，以水解度為測定指標，考察復合酶比例（A），反應pH值（B），反應溫度（C）和反應時間（D）4個因素對水解度的影響。實驗數據如表5所示。

由表5可知，影響水解度的主次順序：A>C>D>B，即蛋白酶比例>反應溫度>反應時間>反應pH值;三酶復合酶解大豆蛋白的最佳水解條件是：A2B1C2D3，即中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和波蘿蛋白酶的比例為1∶2∶4，反應溫度55℃，反應時間4h，pH6.5，此條件下大豆蛋白液的水解度為42.12%。

2.2 接種乳酸菌發酵大豆蛋白水解液

2.2.1 乳酸菌發酵條件的確定

向所得的大豆蛋白水解液中接種嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌1∶1的比例進行乳酸發酵。采用正交實驗法，以酸度（以乳酸計）為測定指標。考察反應溫度（A）、接種量（菌種占大豆蛋白水解液百分比）（B）和反應時間（C）3因素對發酵酸度的影響。實驗數據如表6所示。

由表6可以看出，對乳酸發酵影響的主次順序為A>B>C，即溫度>反應接種量>反應時間。選擇最佳發酵條件是A1B2C2。即溫度38℃，接種量4%，發酵時間為5h，菌種比1∶1。此時水解液乳酸發酵的酸度（以乳酸計）為0.82%。

2.2.2 產品配方優選實驗

參考有關資料并結合乳酸菌發酵條件正交試驗的結果，選取蔗糖、乳粉、穩定劑為正交試驗的3個因素，各取3個水平，選用L9（33）正交表安排實驗。由5～8人組成感官評定小組，根據產品的粘稠度、清液析出狀況、色澤、酸度、甜度、香味等方面的情況進行感官評分，采取10分制[12]。產品配方優選正交實驗因素水平感官評定結果分析如表7所示。

根據表7中計算的各指標均值的極差（R）可以看出，各因素對產品品質影響的主次順序：A（蔗糖%）=D（穩定劑%）>B（乳粉%）。由水平均值（k）可以得出最優水平組為：A3B2C3，即蔗糖6%，乳粉4%，穩定劑0.9%。

3 結論

采用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶三酶復合，對大豆蛋白進行酶解和乳酸發酵，研制出風味良好，易消化吸收的大豆多肽酸奶新產品。最佳酶解條件是中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶的比例為1∶2∶4，反應溫度55℃，反應時間4h，反應pH值為6.5;最佳發酵條件：溫度38℃，反應接種量4%，發酵時間為5h，菌種比1∶1;最佳配方：蔗糖6%，乳粉4%，穩定劑0.9%。

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（責任編輯 李媛媛）