HPLC 法測定血竭含量的不確定度評定

黃志業(yè)，張家樂，袁煥合

廣東省藥品檢驗(yàn)所，廣州 510000

測量不確定度是表征合理地賦予被測量之值的分散性，與測量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)，是測量系統(tǒng)最基本、最重要的特性指標(biāo)［1］。血竭是《中國藥典》2015 年版第一增補(bǔ)本收載品種［2］，具有是活血定痛，化瘀止血，生肌斂瘡之功效，用于跌打損傷，心腹瘀痛，外傷出血，瘡瘍不斂。本文根據(jù)《測量不確定度的評定與表示》并參考相關(guān)文獻(xiàn)［3］，對高效液相色譜（HPLC）法測定血竭含量的不確定度進(jìn)行分析，找出影響不確定度的因素，對不確定度進(jìn)行評估，給出擴(kuò)展不確定度，如實(shí)反映測量的可信度和準(zhǔn)確性，為評價(jià)血竭含量測定結(jié)果提供科學(xué)依據(jù)［4］。

1 儀器與試劑

高效液相色譜儀（安捷倫1260 infinity Ⅱ）；XS205DU 電子天平（梅特勒）；5 mL、10 mL 容量瓶和1 mL、10 mL 移液管均檢定為A 級(jí)。

血竭素高氯酸鹽對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110811-201707，含量：96.3%）；血竭（廣東省醫(yī)藥進(jìn)出口有限公司，批號(hào)：JY20180077）；甲醇，乙腈為色譜純；磷酸二氫鈉為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：InfinityLab Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.05 mol/L 磷酸二氫鈉溶液（45∶55），流速：1.0 mL/min；檢測波長：440 nm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量10 μL，理論塔板數(shù)按血竭素峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取血竭素高氯酸鹽對照品約10 mg，置于50 mL 容量瓶中，加3%磷酸甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取1 mL 于5 mL 棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取本品適量，研細(xì)，取0.1 g，精密稱定，置具塞試管中。精密加入10 mL 3%磷酸甲醇溶液，密塞，振搖3 min，濾過，精密取續(xù)濾液1 mL，置5 mL 棕色容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

2.4 樣品測定

分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀測定，記錄色譜峰，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量。

2.5 測量結(jié)果

表1 樣品中血竭素的含量

2.6 測量不確定度評定

2.6.1 測量模型本例采用液相色譜外標(biāo)法測定樣品血竭的含量，公式如下：

式中：

X—供試品中血竭的百分含量，%；A樣—供試品的峰面積，RA-s；

m對—對照品取樣量，g；P對—對照品純度，%；V對—對照品溶液最終定容體積，mL；

A對—對照品峰面積，RA-s；V樣—供試品溶液最終定容體積，mL；m樣—樣品取樣量，g；

考慮樣品測量重復(fù)性的不確定度后，測量模型為：

式中：

X′—考慮重復(fù)性影響后的血竭素的百分含量，%；X—供試品中血竭素的百分含量，%；R—X 的測量重復(fù)性，%；

2.6.2 不確定度分量來源分析考慮測量重復(fù)性后，不確定度來源用因果圖表示，見圖1。

圖1 血竭含量X′的測量不確定度來源因果圖

2.6.3 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度表達(dá)式

2.6.3.1 確定u（X′）表達(dá)式式（2）為輸入量不相關(guān)的線性模型，由不確定度傳播率得

式中：

u（X′）—合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度，%；u（X）—血竭含量X 的標(biāo)準(zhǔn)不確定度，%；

u（R）—X 的測量重復(fù)性的標(biāo)準(zhǔn)不確定度，%；2.6.3.2 確定u（X） 表達(dá)式 由式（1），根據(jù)JJF1135-2005《化學(xué)分析測量不確定度評定》，忽略相關(guān)性，有：

式中：

urel（X）—X 的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度；urel2（m對）—對照品稱樣量m 對的相對方差；

urel2（P對）—對照品純度P 對的相對方差；urel2（V對）—對照品最終定容體積V 對的相對方差；urel2（A樣）—樣品峰面積A 樣的相對方差；urel2（A對）—對照品峰面積A對的相對方差；urel2（V樣）—樣品最終定容體積V樣的相對方差；urel2（m樣）—樣品稱樣量m樣的相對方差。

2.6.4 測量不確定度分量的量化分析

2.6.4.1 對照品溶液濃度C 對的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（C對） 對照品純度的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（C對）屬于B類測量不確定度。血竭素高氯酸鹽對照品來源中國食品藥品檢定研究院，純度為96.3%。未給出其不確定度等相關(guān)信息，假定其分布區(qū)間為±0.05%，按矩形分布計(jì)算，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

對照品稱量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（m對）有2 個(gè)來源，均屬于B類測量不確定度。（1）天平示值允差的不確定分析：m對由電子天平采用去皮重法直接測量，m對=0.009 89 g，由于稱量船質(zhì)量為9.604 5 g，此時(shí)天平的總載荷則為9.6 g，應(yīng)取此稱樣量響應(yīng)的量程段的最大允許誤差計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)不確定度。查天平檢定證書和計(jì)量檢定規(guī)程，使用81 g量程檔，量程為5 g～20 g 的允許誤差絕對值為0.10 mg，認(rèn)為服從矩形分布，則：u重復(fù)性（m對）=0.10=5.77×10-2mg。（2）天平稱量重復(fù)性的不確定分析：天平檢定證書給出的重復(fù)性誤差為0.15 mg，認(rèn)為服從矩形分布，則：u重復(fù)性（m對）=0.15=8.66×10-2mg，因稱量過程使用減量法，故其不確定度u（m對）==1.47×10-1mg，對照品稱樣量為9.89 mg，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（m對）=1.47×10-1mg/9.89 mg=1.49×10-2。

對照品溶液稀釋的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（V對）有2 個(gè)來源，分別為校準(zhǔn)和溫度，均屬于B類測量不確定度。對照品稀釋過程使用到50 mL 單標(biāo)線容量瓶（A 級(jí)）、5 mL 單標(biāo)線容量瓶（A 級(jí)）和1 mL單標(biāo)線吸量管（A 級(jí)）。

查JJG196-2006 常用玻璃量具檢定規(guī)程，50 mL 單標(biāo)線容量瓶允許誤差為±0.05，認(rèn)為服從矩形分布，則：=2.89×10-2mL，定容時(shí)溫度為26 ℃，50 mL 單標(biāo)線容量瓶定標(biāo)溫度為20 ℃，由于液體的體積膨脹明顯大于移液器本身的體積膨脹，可只考慮液體的體積膨脹，認(rèn)為對照品溶液的體積膨脹系數(shù)與甲醇相近，甲醇的體積膨脹系數(shù)為0.001 18 ℃-1，因此產(chǎn)生的體積增量為50×0.001 18×（26-20）=0.354 mL，因?yàn)橛?jì)算檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)不做體積修正，此處將體積變化作為不確定度處理，假設(shè)體積變化為矩形分布，則=2.04×10-1mL。由以上兩項(xiàng)合成相對不確定度：urel（V對50）=；同理，1 mL 單標(biāo)線吸量管和5 mL 容量瓶引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度結(jié)果見表2；則由對照品儲(chǔ)備液稀釋過程產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

表2 對照品溶液定容體積引入的相對不確定度

2.6.4.2 樣品溶液峰面積A 樣的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（A供） 查高效液相色譜儀（自編號(hào)T0320）檢定證書，得高效液相色譜儀測量重復(fù)性為0.1%，是相對標(biāo)準(zhǔn)差的形式。因此，可直接得出urel（A樣）=0.1%=1.00×10-3。

2.6.4.3 對照品溶液峰面積A 對的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（A對） 與2.6.3.2 的分析相同，可得urel（A對）=0.1%=1.00×10-3。

2.6.4.4 樣品溶液最終定容體積V樣的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（V樣） 樣品稀釋倍數(shù)的不確定度由10 mL單標(biāo)線吸量管（A 級(jí)）、1 mL 單標(biāo)線吸量管（A 級(jí)）、5 mL 單標(biāo)線容量瓶（A 級(jí)）引入，不確定度來源主要考慮容量允許誤差和溫度影響線性疊加，均屬于B類測量不確定度。分析與2.6.3.1.3 相同，結(jié)果見表3。則由樣品定容體積引起的相對不確定度為：

表3 樣品溶液定容體積引入的相對不確定度

2.6.4.5 樣品取樣量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（m樣）樣品稱樣量m樣（約0.1 g）的不確定度由天平引入，天平的不確定度來源主要考慮兩項(xiàng)為允許誤差和重復(fù)性限線性疊加，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為u允差（m樣）和u重復(fù)性（m樣）。m 樣由電子天平采用去皮重法直接測量，m樣≈0.1 g，但由于稱量船質(zhì)量為9.604 5 g，此時(shí)天平的總載荷則約為9.7 g，應(yīng)取此稱樣量響應(yīng)的量程段的最大允許誤差計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)不確定度。查天平檢定證書和計(jì)量檢定規(guī)程，使用220 g 量程檔，量程為0 g～50 g 范圍的允許誤差絕對值為0.5 mg，重復(fù)性允差絕對值為1.0 mg，均認(rèn)為服從矩形分布，則：

故其不確定度u（m樣）=6.45×10-1mg=6.45×10-4g，樣品稱樣量為0.1 g，其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（m樣）=0.000 645 g/0.1 g=6.45×10-3。

2.6.4.6 計(jì)算合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（X）含量測定的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

則含量測定的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.6.4.7 計(jì)算測量重復(fù)性R 的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（R）測量重復(fù)性R 的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（R）屬于A類不確定度。按正常檢驗(yàn)時(shí)，制作兩份平行樣，以平均值作為測得值。為評定重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)不確定度，樣品平行操作12 份，數(shù)據(jù)見表1。用貝塞爾公式計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差：

正常檢驗(yàn)時(shí)，血竭含量測得值取兩次測量的平均值，故測量血竭含量的重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：u

2.6.5 計(jì)算合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度數(shù)值u（X′）

2.7 評定擴(kuò)展不確定度

取包含因子k=2，擴(kuò)展不確定度為：U=u（X′）×2=0.033 4%×2=0.07%

2.8 報(bào)告測量結(jié)果

本次測量中藥材血竭含量為：（1.29±0.07）%，第二項(xiàng)為擴(kuò)展不確定度U 的值，k=2。

表4 不確定度一覽表

（續(xù)表）

3 討論

本文通過對HPLC 法測定血竭含量的測量不確定度評定，分析了各測量不確定度分量。根據(jù)分析結(jié)果，影響測定的不確定度來源有對照品自身與其配制過程、儀器的測量性能、樣品處理過程與方法測量重復(fù)性等。其中，對照品的稱樣量和樣品測量重復(fù)性引起的不確定度比較大，其次是對照品和樣品的稀釋體積。因此在實(shí)際操作過程中，操作人員可適當(dāng)增加對照品的稱樣量，選用精度符合檢驗(yàn)要求并經(jīng)計(jì)量校正合格的電子天平，定期進(jìn)行儀器維護(hù)保養(yǎng)以提高儀器的靈敏度，使用經(jīng)過計(jì)量校正合格的容量儀器進(jìn)行稀釋定容，增加平行樣品的測定，提高操作人員操作水平，進(jìn)一步降低樣品測定重復(fù)性引入的不確定度，從而提高測量結(jié)果的準(zhǔn)確度。