HPLC-ELSD 法同時測定康壽丸人參皂苷Rg1、Re、Rb1 的含量

黃天山，楊潔瑜，顧利紅

廣州市藥品檢驗所，國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評價重點實驗室，廣州，510160

康壽丸質(zhì)量標準目前收載于《衛(wèi)生部藥品標準》中藥成方制劑第十一冊，處方由何首烏、人參、熟地黃、地骨皮等八味藥組成，主要用于氣血兩虛，精血兩虛，精血不足導(dǎo)致的身體瘦弱，神疲乏力，眩暈健忘，失眠多夢等癥。現(xiàn)行質(zhì)量標準中僅對人參進行薄層鑒別［1］，為了更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，保證臨床療效，擬對方中人參進行含量測定研究。《中國藥典》多采用HPLC-UV 法測定人參中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re 和人參皂苷Rb1的含量，分析時間較長，效率較低［2-4］。本文建立了HPLC-ELSD 法同時測定康壽丸中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re 和人參皂苷Rb1含量的方法，為康壽丸的質(zhì)量控制提供了實驗依據(jù)。

1 儀器與試劑

萬分之一電子天平（瑞士梅特勒托利多公司）；安捷倫1260 高效液相色譜儀（配置四元泵、自動進樣器、柱溫箱和Alltech 3300 蒸發(fā)光散射檢測器），OpenLab CDS 色譜工作站。

人參皂苷Rg1對照品（批號為110703-201933，含量以93.4%計）；人參皂苷Re 對照品（批號為110754-201827，含量以93.4%計）；人參皂苷Rb1對照品（批號為110704-202028，含量以93.1%計）；均由中國食品藥品檢定研究院提供。乙腈為色譜純（德國 Merck），水為超純水，其他試劑均為分析純（廣州化學(xué)試劑廠）。康壽丸樣品共10 批，分別由企業(yè)A 和企業(yè)B 提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱：Waters CORTECS T3 C18（柱長150 mm，內(nèi)徑4.6 mm，粒徑2.7 μm），以乙腈為流動相A，水為流動相B，按下表中的規(guī)定進行梯度洗脫；采用蒸發(fā)光散射檢測器，漂移管溫度為50 ℃，載氣流速為1.6 L/min，倍增系數(shù)為4。理論板數(shù)按人參皂苷Rg1峰計算不低于10 000，與相鄰色譜峰的分離度不低于1.5。

表1 梯度洗脫程序

2.2 對照品溶液的制備取人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含人參皂苷Rg1180 μg、人參皂苷Re80 μg、人參皂苷Rb1100 μg 的混合溶液，即得。

2.3 供試品溶液及陰性對照溶液的制備取本品粉末（過四號篩）約3.5 g，精密稱定，置錐形瓶中，加乙醚50 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過，棄去乙醚液，藥渣揮干乙醚，連同濾紙移至錐形瓶中，精密加入水飽和正丁醇50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用水飽和正丁醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液25 mL，蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

按處方取不含人參的各藥味飲片，經(jīng)粉碎按處方量及制法混合制成陰性樣品，同供試品溶液的制備方法制備人參陰性對照溶液。

2.4 專屬性試驗分別精密吸取供試品溶液和人參陰性對照溶液各2 μL，人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1混合對照品溶液各5 μL，依法測定，記錄HPLC 色譜圖，見圖1。結(jié)果顯示，人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1與其他組分峰的分離度均大于1.5，人參陰性對照溶液色譜中在與人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1對照品色譜峰相應(yīng)的位置上，未見有色譜峰，說明陰性樣品無干擾，方法具有專屬性。

圖1 HPLC色譜圖

2.5 線性關(guān)系考察取人參皂苷Rg1對照品8 mg、人參皂苷Re 對照品8 mg、人參皂苷Rb1對照品10 mg，精密稱定，置10 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液①。精密吸取對照品溶液①5.0 mL 置10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液②。精密吸取對照品溶液②5.0 mL 置10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液③。精密吸取對照品溶液③5.0 mL 置10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液④。精密吸取對照品溶液④4.0 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液⑤。精密吸取對照品溶液⑤5.0 mL置10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液⑥。分別精密吸取對照品溶液①～⑥各4 μL 進樣，依法測定，以峰面積積分值A(chǔ) 對數(shù)值為縱坐標，進樣量C（μg）對數(shù)值為橫坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)，見表2。表明人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1線性關(guān)系良好。

表2 人參皂苷Rg1、Re、Rb1線性考察結(jié)果（n=6）

2.6 精密度考察精密吸取對照品溶液（濃度：人參皂苷Rg185.27 μg/mL；人參皂苷Re 78.27 μg/mL；人參皂苷Rb196.03 μg/mL），連續(xù)進樣6 次，記錄峰面積，計算RSD。結(jié)果：人參皂苷Rg1RSD為1.9%，人參皂苷Re RSD 為1.9%，人參皂苷Rb1RSD 為1.6%，說明儀器的精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗取同一批（批號：B07009）樣品，精密稱取6 份，依法制備供試液，進樣測定，結(jié)果人參皂苷Rg1平均含量為0.29 mg/g，RSD 為2.2%；人參皂苷Re 平均含量為0.33 mg/g，RSD 為1.9%；人參皂苷Rb1平均含量為0.43 mg/g，RSD 為1.1%，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗取同一份供試品溶液（批號190901），在室溫放置0、4、8、12、16、20、24 h后分別進樣，依法測定，人參皂苷Rg1含量平均值為0.138 mg/g，RSD 為1.5%；人參皂苷Re 含量平均值為0.194 mg/g，RSD 為1.9%；人參皂苷Rb1含量平均值為0.280 mg/g，RSD 為1.5%。表明供試品溶液在24 h 內(nèi)測定結(jié)果穩(wěn)定。

2.9 加樣回收試驗取已知含量（批號：B07009）的樣品6 份，每份約1.75 g，精密稱定，各精密加入混合對照品溶液（人參皂苷Rg1：0.255 3 mg/mL；人參皂苷Re：0.315 1 mg/mL；人參皂苷Rb1：0.402 8 mg/mL的混合溶液）2 mL，在水浴上揮干溶劑，自“加乙醚50 mL，”起同法制成供試品溶液，依法測定，人參皂苷Rg1、Re、Rb1的平均回收率分別為99.8%、100.9%、99.8%，RSD 分別為1.0%、1.7%、1.3%。

2.10 樣品測定取所收集的A、B 兩家企業(yè)共10批樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，依法測定，計算結(jié)果見表3。

表3 人參皂苷Rg1、Re、Rb1含量測定結(jié)果 mg/g

3 討論

康壽丸組方復(fù)雜，若選擇HPLC-UV 法，檢測波長常為203 nm，屬于紫外末端吸收，天冬、麥冬中的皂苷類成分及雜質(zhì)會產(chǎn)生干擾，不宜選擇紫外檢測器。蒸發(fā)光散射檢測器作為一款通用的檢測器，無紫外末端吸收的干擾，有廣泛的梯度和溶劑兼容性，圖譜基線平穩(wěn)［5］，適用于人參皂苷類成分的檢測［6-9］，故本實驗采用HPLC-ELSD 法對康壽丸中的人參皂苷類成分進行分析。

比較了三氯甲烷、二氯甲烷和乙醚的脫脂效果，發(fā)現(xiàn)不同溶劑脫脂后制備的供試液各液相色譜圖在目標峰（人參皂苷Rg1、Re、Rb1）附近雜質(zhì)干擾無明顯差異，乙醚毒性較小，從綠色環(huán)保考慮，采用了乙醚除脂。同時還比較了甲醇、正丁醇和水飽和的正丁醇三種溶劑的提取效果，發(fā)現(xiàn)水飽和的正丁醇提取效果最好，故選擇以水飽和的正丁醇作為提取溶劑。最后還對提取方式與時間進行了研究，發(fā)現(xiàn)回流提取比超聲提取效果好，回流60 min 能最大限度地提取完全。

本方法采用了可以在普通液相使用的微粒徑色譜柱，顯著縮短了人參皂苷類成分的分析時間，比較了樣品在不同色譜柱（Waters CORTECS T3 C18、YMC Meteoric C18、Agilent InfinityLabPoroshell SBC18）和不同柱溫（25 ℃、30 ℃、35 ℃）對分離效果和分析時間的影響，發(fā)現(xiàn)不同色譜柱和不同柱溫均能獲得良好的分離度，含量測定結(jié)果無明顯差異。

本文對收集到的兩家企業(yè)共10 批康壽丸樣品進行了人參三個皂苷成分的含量測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩家企業(yè)的人參皂苷含量差異較大，同一企業(yè)的不同批次樣品含量差異不大，表明兩個企業(yè)的投料來源比較穩(wěn)定，但人參原藥材質(zhì)量存在一定差異。