血紅鉚釘菇多糖超聲微波聯合提取工藝優化及其抗氧化活性

岳崢嶸,趙 博,張國財,呂明帥,張方明(東北林業大學林學院,黑龍江哈爾濱 150040)

血紅鉚釘菇[Chroogomphusrutilus(Schaeff.)O.K. Mill.]屬牛肝菌目(Boletales)鉚釘菇科(Gomphidiaceae)色釘菇屬(Chroogomphus),是一種松屬針葉樹木外生大型菌根真菌[1-2],亦是我國珍貴的傳統食藥用菌之一[3]。研究表明,血紅鉚釘菇富含蛋白質[4]、多糖[5]、黃酮[6]、香豆素[7]及甾醇[8]等多種活性物質,具有極高的食用和藥用價值。

多糖作為食用菌重要的活性成分[9],具有抗腫瘤[10]、抗氧化[11]、抗疲勞[12]、免疫調節[13]等諸多藥理作用。然而,迄今關于血紅鉚釘菇多糖開發的研究較少,對其提取工藝進行系統研究亦鮮有報道。Wang等[11]以傳統水提法提取血紅鉚釘菇子實體粗多糖,提取時間2.5 h得率僅為6.02%±0.15%。超聲微波聯合提取法具有提取時間短[14]、對活性物質影響較小[15]、得率高[16]等優點,目前已在多種食藥用菌多糖提取研究中得到應用[17-19]。

因此,本文采用響應面法對超聲微波聯合提取血紅鉚釘菇多糖工藝進行優化,并與超聲波提取法和傳統水提法的提取效果和抗氧化活性進行比較分析,旨在提供高效血紅鉚釘菇多糖提取工藝,為其進一步研發和應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

JY92-IIN型超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司;MDS-6型微波快速制樣系統 上海新儀微波化學科技有限公司;DID-S14型電熱恒溫水浴鍋 上海森信實驗儀器有限公司;SHB-CIA型循環水式真空泵 鄭州長城科工貿有限公司;Ultrospec 5300pro型紫外分光光度計 美國通用電氣醫療集團;Thermo Heraeus BIOFUG型高速冷凍離心機 賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取工藝 將新鮮的血紅鉚釘菇子實體置于烘箱中,45 ℃條件下鼓風干燥至恒重,將烘干后的樣品粉碎過80目篩,備用。以蒸餾水為提取液,在不同提取條件下,按照先超聲后微波的操作順序,以超聲微波聯合提取法提取血紅鉚釘菇多糖,抽濾除去殘渣,取濾液以四倍量無水乙醇醇沉過夜,9000 r/min條件下離心20 min,取沉淀以Sevag法[20]除去蛋白。將除去蛋白的樣品用四倍量無水乙醇醇沉過夜,次日離心后分別用乙醇、丙酮、乙醚洗滌沉淀,將樣品溶解后,在截流量3500 Da條件下透析48 h,濃縮透析液后進行冷凍干燥,得血紅鉚釘菇粗多糖粉末。

1.2.2 單因素實驗 以血紅鉚釘菇粉末為原料,以超聲微波聯合提取法進行多糖提取,研究超聲時間(5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 min)、超聲功率(390、455、520、585、650 W)、微波時間(2、5、8、11、14 min)、微波溫度(60、70、80、90、100 ℃)及液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 mL/g)對血紅鉚釘菇多糖得率的影響。固定提取條件為:超聲時間7.5 min,超聲功率520 W,微波時間8 min,微波溫度90 ℃、液料比30∶1 mL/g,以多糖得率作為指標評價提取效果。

1.2.3 響應面試驗設計 根據單因素實驗所得結果,選取對多糖得率影響較大的四個因素(超聲時間、微波時間、微波溫度、液料比),選用Box-Behnken模型,對以上因素進行4因素3水平響應面設計,以多糖得率為響應值對多糖提取工藝進行優化,試驗因素與水平設計見表1。各處理組重復3次,取平均值。

表1 響應面試驗設計Table 1 Response surface design

1.2.4 多糖含量測定及得率計算方法 采用苯酚-硫酸法[21]進行測定。線性回歸方程為:y=15.33x+0.2439(y為吸光值;x為多糖質量濃度),R2=0.9975。根據標準曲線計算多糖含量,按公式(1)計算得多糖得率:

式(1)

式中,mt為樣品所含多糖質量(g);mp為樣品原料粉末質量(g)。

1.3 數據處理

采用Design-Expert 8.0.6軟件選用Box-Behnken模型進行響應面試驗設計,試驗所得數據使用SPSS 17.0軟件處理并進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

由圖1a可知,在研究超聲時間對多糖得率影響的實驗中,得率隨超聲時間的增加呈先上升后下降趨勢,且不同超聲時間下多糖得率差異極顯著(P<0.01)。當超聲時間為7.5 min時,多糖得率最高為7.61%±0.13%。

由圖1b可知,在研究超聲功率對多糖得率影響的實驗中,得率受超聲功率影響變化的幅度不大,除390和520 W兩組間存在顯著差異外(P<0.05),其余各組間差異不顯著(P>0.05)。當超聲功率為520 W時,多糖得率最高為7.37%±0.22%。

由圖1c可知,在研究微波時間對多糖得率影響的實驗中,得率隨微波時間的增加呈先上升后下降趨勢,各組之間差異極顯著(P<0.01)。當微波時間為5 min時,多糖得率最高為8.43%±0.11%。

由圖1d可知,在研究微波溫度對多糖得率影響的實驗中,得率隨微波溫度的升高呈先上升后平穩趨勢,各組之間差異極顯著(P<0.01)。當微波溫度為90 ℃時,多糖得率最高為7.17%±0.10%。

由圖1e可知,在研究液料比對多糖得率影響的實驗中,得率隨液料比的提高呈先上升后下降趨勢,不同液料比對多糖得率影響極顯著(P<0.01)。當液料比為30∶1 mL/g時,多糖得率最高為7.20%±0.11%。

圖1 超聲時間(a)、超聲功率(b)、微波時間(c)、微波溫度(d)及液料比(e)對多糖得率的影響Fig.1 Effects of ultrasonication time(a),ultrasonic power(b),microwave time(c),microwave temperature(d)and liquor to solid ratio(e)on polysaccharides yield注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05);不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01);字母相同表示差異不顯著(P>0.05)。

方差分析結果表明,超聲時間、微波時間、微波溫度、液料比對多糖得率的影響均為極顯著(P<0.01),相比之下,超聲功率對多糖得率影響較弱,因而選用超聲時間5 min、微波時間5 min、微波溫度90 ℃、液料比30∶1 mL/g、超聲功率520 W作為提取條件較為適合。分析可知,隨著超聲時間、微波時間的提高,在一定范圍內得率會出現下降情況,長時間的超聲波機械作用或微波熱效應過強可導致部分多糖發生降解[24];而液料比在一定范圍內得率也會下降,原因可能是提取液的增加對血紅鉚釘菇細胞內其他活性物質的溶出效果顯著高于多糖,細胞內外滲透壓發生變化,從而限制到多糖的溶出。

2.2 響應面優化試驗結果

2.2.1 響應面試驗結果 根據單因素實驗結果,選取超聲時間、微波時間、微波溫度、液料比四個因素,采用四因素三水平進行設計,響應面試驗方案及結果見表2。

表2 響應面試驗結果Table 2 Response surface design experimental results

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of varfance for the fitted quadratic polynomial model

2.2.3 各因素交互作用分析 由圖2和表3可知,超聲時間、微波時間、微波溫度和液料比4個單獨因素對多糖得率均有高度顯著影響(P<0.001);交互作用方面,AB、AC、AD和CD響應面交互作用高度顯著(P<0.001),BC響應面交互作用極顯著(P<0.01),BD響應面交互作用不顯著(P>0.05)。

圖2 各因素交互作用下血紅鉚釘菇多糖得率Fig.2 Response surface plots showing the interactive effects of four extraction parameters on extraction polysaccharides

2.2.4 優化提取工藝參數驗證 對回歸方程進行分析可知,經優化所得血紅鉚釘菇多糖最佳提取工藝條件為:超聲時間7.74 min、微波時間5.64 min、微波溫度91.95 ℃、液料比28.58∶1 mL/g,得率預測值為8.77%。為便于實際操作,選取超聲時間8 min、微波時間6 min、微波溫度92 ℃、液料比29∶1 mL/g對提取工藝進行驗證,在此條件下,重復3次試驗,得到血紅鉚釘菇多糖得率為8.69%±0.19%,與預測值相近,說明模型預測較為準確。

2.3 不同提取方法的血紅鉚釘菇多糖體外抗氧化能力比較

2.3.1 血紅鉚釘菇多糖對總還原力的影響 由圖3a可知,在0.5～5.0 mg/mL濃度梯度下,由三種方法提取的血紅鉚釘菇多糖均具有還原能力,OD值均隨著多糖濃度的提高而增大,其中,超聲微波聯合提取法獲得多糖的還原力最強,超聲提取法次之,傳統水提法所得多糖還原力最弱。在多糖濃度為5 mg/mL條件下,三者吸光值分別為1.24、0.71和0.40,且三種提取方法對血紅鉚釘菇多糖還原力影響差異顯著(P<0.05)。

2.3.2 血紅鉚釘菇多糖對·OH清除率的影響 由圖3b可知,在0.5～6.0 mg/mL濃度梯度下,超聲提取法及超聲微波聯合提取法所得多糖對·OH清除率的影響隨多糖濃度的上升呈先上升后趨于平穩變化,水提法所得多糖清除率始終呈緩慢上升趨勢。在選取濃度范圍內,超聲微波聯合提取法所得多糖對·OH清除效果最好,超聲提取法次之,傳統水提法所得多糖對·OH清除效果最弱,IC50依次為1.62、2.37和5.43 mg/mL,且三種提取方法所得多糖對·OH清除率影響均呈顯著差異(P<0.05)。

2.3.3 血紅鉚釘菇多糖對DPPH自由基清除率的影響 由圖3c可知,在0.1～0.8 mg/mL濃度梯度下,三種方法所得多糖對DPPH清除率的影響均隨多糖濃度的上升呈逐漸上升趨勢,且具有較強清除能力,超聲微波聯合提取法所得多糖在0.7 mg/mL濃度條件下,清除率達82.26%,其余兩種提取方法所得多糖在0.5 mg/mL濃度條件下,清除率也均超過50%,清除效果由強至弱依次為超聲微波聯合提取法、超聲提取法、傳統水提法,DPPH清除率IC50值分別為0.29、0.38和0.48 mg/mL,且對DPPH清除率影響呈顯著差異(P<0.05)。

2.3.4 血紅鉚釘菇多糖對ABTS自由基清除率的影響 由圖3d可知,三種方法所得多糖對ABTS清除率亦呈現隨多糖濃度上升逐漸提高的規律,與DPPH相比,所得多糖對ABTS清除能力相對較弱,在3～21 mg/mL濃度梯度下,清除效果由強至弱依次為超聲微波聯合提取法、超聲提取法、傳統水提法,ABTS清除率IC50值分別為10.28、12.92和17.59 mg/mL,且不同提取方法對ABTS清除率差異顯著(P<0.05)。

圖3 不同提取方法所得血紅鉚釘菇多糖體外抗氧化能力Fig.3 Antioxidant activity in vitro of polysaccharides from Chroogomphus rutilus by different extraction techniques注:a. 總還原力;b. ·OH清除能力;c. DPPH自由基清除能力;d. ABTS自由基清除能力;清除能力。

2.4 不同提取方法差異比較

表4 不同提取方法提取效果比較分析Table 4 Comparative analysis of extraction effects of different extraction methods

3 結論