獸藥殘留快速檢測之試劑盒篩選研究

劉冰

（石家莊市畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測中心石家莊 050000）

1 獸藥殘留的概念

獸藥殘留是指動(dòng)物源食品中的獸藥殘留，是畜禽動(dòng)物使用藥物后致動(dòng)物性食品中可食用部分殘留了獸藥原型化合物和獸藥代謝物，包括一些代謝過程中產(chǎn)生及伴隨的雜質(zhì)物質(zhì)。

2 獸藥快速檢測方法

目前獸藥檢測中常用的篩選方法有試劑盒、試紙條和微生物法，其他方法如傳感器和蛋白芯片。試劑盒法中主要有酶聯(lián)免疫試劑盒、雙向酶聯(lián)免疫試劑盒、化學(xué)發(fā)光試劑盒和放射免疫試劑盒。常用的試紙條有膠體金試紙條、彩色乳膠試紙條和免疫熒光試紙條。微生物法可以用杯碟法、紙片法和瓊脂擴(kuò)散法等。其中酶聯(lián)免疫試劑盒中最常用的是ELISA 試劑盒，它有靈敏度高、高通量、半定量以及可以用于大量樣品快速篩選等優(yōu)點(diǎn)。

3 試劑盒評(píng)價(jià)

試劑盒評(píng)價(jià)是根據(jù)靈敏度、特異性、精密度、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性與儀器方法比對(duì)。

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線是判斷靈敏度的指標(biāo)之一，需要研究的濃度應(yīng)該在標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)，酶聯(lián)免疫的標(biāo)準(zhǔn)曲線為s 曲線，曲線中部有一段相對(duì)直線，以此為依據(jù)比較準(zhǔn)確。但是標(biāo)準(zhǔn)曲線的影響因素很多，每次測定都需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線，局限性較大，且標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍之外的數(shù)據(jù)不能用外延法定量。50%抑制濃度（IC50）是指反應(yīng)被抑制一半時(shí)藥物的濃度，即0 濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值50%處所對(duì)應(yīng)的待測物濃度，它是判斷靈敏度的重要指標(biāo)。

3.2 檢測限

檢測限也是判斷靈敏度的主要指標(biāo)之一，20 份不同來源的空白樣品測定平均值加3 倍標(biāo)準(zhǔn)差即為檢測限，檢測限以下99%以上可能為陰性。其數(shù)值差異來源為不同動(dòng)物個(gè)體，試劑盒靈敏度，不同的處理方法和不同的組織樣本。動(dòng)物個(gè)體差異很大需要用不同來源的空白試樣進(jìn)行測定，才能保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

3.3 判定限

判定限是判定檢測結(jié)果陰性陽性的分界線，是檢測結(jié)果的依據(jù)。檢測結(jié)果可以按照陽性添加的回收率折算。一般的常用藥物以最高殘留限量（MRL）為判定限，對(duì)于禁用藥物，一般由任務(wù)下達(dá)單位給出判定限且該值應(yīng)該是公認(rèn)的一個(gè)指標(biāo)。

3.4 準(zhǔn)確度

準(zhǔn)確度是用回收率表示，回收率應(yīng)≥40%，優(yōu)質(zhì)試劑盒回收率一般在70%～120%之間，回收率過低或過高都表示試劑盒抗干擾能力較差。

3.5 與儀器方法比較

用一定數(shù)量的樣品，運(yùn)用試劑盒方法和儀器方法進(jìn)行比較。儀器方法檢測為陰性的樣品，允許試劑盒有假陽性結(jié)果，儀器方法測定為陽性的結(jié)果，試劑盒不能有假陰性結(jié)果。

4 特異性

特異性是指方法在一個(gè)混合體系中對(duì)特異目標(biāo)分析物的識(shí)別能力，特異性的測定是采用與待檢藥物同類藥物、類似物、代謝物或者可能的聯(lián)合使用藥物測定IC50 來計(jì)算交叉反應(yīng)率得來。比如選擇β 興奮劑試劑盒的時(shí)，需要看藥物的交叉反應(yīng)率（表1）。

表1 交叉反應(yīng)率

假設(shè)試劑盒的IC50 都是1ppb，判定限也為1ppb，圖中試劑盒A 克倫特羅和沙丁胺醇的交叉反應(yīng)率均為100%，則兩種藥物在1ppb 都可以檢出，反之圖中試劑盒B 克倫特羅為100%，沙丁胺醇為10%，則說明克倫特羅在IC50 為1ppb 左右就可以檢出，而沙丁胺醇則需要10ppb 才可以檢出，這樣就達(dá)不到檢測要求。試劑盒C 同理。所以要根據(jù)檢測任務(wù)來選擇合適的試劑盒，才能得到滿意結(jié)果。

5 試劑盒的方法驗(yàn)證

新的檢測方法，已建立的檢測方法發(fā)生改變?nèi)缜疤幚矸椒ǜ淖?，或增加了新的檢測對(duì)象時(shí)就需要進(jìn)行試劑盒的方法驗(yàn)證。

6 試劑盒的質(zhì)量控制

6.1 儀器

儀器方面的質(zhì)量控制包括酶標(biāo)儀需要進(jìn)行計(jì)量檢定，移液器在需要計(jì)量檢定的同時(shí)還應(yīng)在檢定周期內(nèi)進(jìn)行期間核查，洗板機(jī)在使用時(shí)要注意殘留體積和加液體積是否異常，加液孔是否堵塞，如沒有洗板機(jī)也可不用。

6.2 溫度

室溫度一般為20～25℃，孵育也一般為室溫，如果孵育溫度和室溫差別較大時(shí)可出現(xiàn)邊緣效應(yīng)，試劑盒和待測樣品回溫時(shí)間要充裕。

6.3 加樣

移液器使用方法須規(guī)范，不要產(chǎn)生氣泡，加入兩種試劑必須混勻再加入，推薦使用多道移液器。

6.4 讀數(shù)

顯色受溫度影響較大，一般在40min 之內(nèi)，最高OD 值在1～2 之間測定結(jié)果比較準(zhǔn)確，酸終止后OD 值會(huì)下降，要盡快讀數(shù)。

6.5 計(jì)算

常用的數(shù)據(jù)擬合方法有半對(duì)數(shù)曲線法、logit-log 作圖法、條樣函數(shù)插值法和四參數(shù)作圖法。

7 總結(jié)

通過對(duì)獸藥檢測中的試劑盒檢測方法進(jìn)行研究分析，可以讓檢測者根據(jù)檢測任務(wù)和檢測項(xiàng)目，合理選擇所需要的檢測試劑盒，以保證獸藥檢測的準(zhǔn)確性和有效性。█