FMR1基因突變與自然流產及復發性流產的相關性研究

黃凌云，沈 曄，錢芳波

(南京醫科大學附屬無錫市婦幼保健院計劃生育科，江蘇 無錫 214002)

自然流產是指在孕28周前，排除人為因素導致的妊娠終止；復發性流產則是指同一位女性在短期內連續發生至少2次自然流產[1]。流產發生在12周之前稱之為早期流產，若流產發生在12周之后則稱為晚期流產[2]。在全部的自然流產中，有80%發生在早期，多與解剖、遺傳、感染、內分泌、自身免疫性疾病等諸多因素有關，其中遺傳因素中染色體異常最為常見[3]。脆性智力低下1號基因(Fragile X retardation-1，FMR1)5端非編碼區有一段以CGG為單位的三核苷酸動態重復序列，該序列長度(CGG的重復次數)在傳代過程中表現出動態變化[4]。卵巢早衰、脆性-X綜合征、脆性X相關震顫-共濟失調綜合征是與之相關的各類疾病，這些疾病的特征與該序列擴張的程度相關[5]。自然流產、復發性流產夫婦其FRM1基因CGG重復數量是否高出普通人群，目前尚未見較多相關報道證實。本研究擬檢測早期自然流產及復發性流產患者FRM1基因CGG重復序列數來了解FRM1基因與自然流產及復發性流產之間的相關性，旨在為未來自然流產與復發性流產的病因學研究提供依據?，F報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2018年6月至2019年5月在我院計劃生育科就診的早期流產與復發性流產患者144例作為試驗組，同期在我院接受常規產檢的70例既往無自然流產或復發性流產史的女性70例作為對照組，均在我院接受正常孕檢并順利分娩。納入標準：①試驗組均為有不良孕產史者，包括早期自然流產史、≥2次流產史、≥2次稽留流產史；②對照組經查無任何內科合并癥及自身免疫性疾病，既往無不良孕產史，既往無流產史；③全部入組女性對本次研究實施的方法、目的等內容均知情，并簽署知情同意書。排除標準：①合并內外科合并癥者；②既往接受腹腔手術治療史者；③心理疾病或精神障礙等無法很好的配合研究者。試驗組年齡18～40歲[(30.70±4.71)歲]；孕次1～7次[(3.24±1.15)次]；產次0～2次[(0.89±0.24)次]；對照組年齡20～40歲[(31.02±4.81)歲]；孕次1～5次[(3.14±1.21)次]；產次0～2次[(0.87±0.25)次]。兩組年齡、孕次、產次等一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，有可比性。該研究獲得我院醫學倫理委員會批準。

1.2 方法全部患者均接受FMR1基因檢測。①DNA提?。喝渴茉囌呔邮芡庵莒o脈采血2 ml，提取DNA，提取試劑盒為德國 Qiagen公司提供的全血DNA試劑盒，嚴格參照試劑盒說明書進行操作，取溶解后DNA溶液1 μl，以相同蒸餾水作為空白對照組，在紫外分光光度儀上檢測DNA純度合格，稀釋DNA濃度至20 ng/ μl備用。②檢測FMR1基因CGG重復序列數：凍寸24 h內統一快遞空運至北京大學第一醫院中心實驗室，每批次反應均設有全突變、空白對照各1例，提取基因組DNA后使用美國Asuragen公司提供的FMR1基因Amplide試劑盒經X檢測技術與熒光PCR技術，使用美國ABI公司提供的3730DNA分析儀毛細管電泳儀實施毛細管電泳，使用美國ABI公司提供的GeneMapper4.0軟件進行擴增產物分析，檢測FMR1基因CGG重復序列數。PCR反應體系包括11.45 μl、GC-Rich Amp buffer、1.5 μl 6′-FAM-FMRI引物、0.5 μl FRM1CGG引物、0.5 μl無核酸酶的水、0.05 μl高GC的多聚酶混合物、30 ng的DNA模板。

1.3 觀察指標記錄所有患者的各項資料，結合FRM1基因突變檢查結果，對有關數據及研究對象臨床資料進行對比分析。使用國內目前普遍采用的分類[6]：①正常重復范圍：n=5～44次；②中間型或灰區：n=45～54次；③前突變：n=55～200次、④全突變：n=200次。

1.4 統計學方法應用SPSS 20.0統計學軟件處理數據，計量資料以均數±標準差表示，比較采用t檢驗，計數資料以百分比表示，采用χ2檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 試驗組與對照組FMR1基因CGG重復序列分布規律比較試驗組144例患者中自然流產者84例，復發性流產者60例。自然流產組與復發性流產組患者CGG重復最大頻率等位基因n=30，其次為n=29，再次為n=36、n=31，對照組最大頻率等位基因n=30，后頻率由高至低依次為n=29、36、31，三者高度一致。自然流產組與復發性流產組檢測到不同等位基因共35種，CGG重復次數變異范圍為n=21～133，最大頻率基因為n=30，后依次為n=29、31。對照組檢測到不同等位基因25種，CGG重復次數范圍22～58，最大頻次等位基因為n=30、36、31。三組CGG重復均數分別為(29.34±5.21)次、(30.34±5.32)次、(28.78±6.41)次，組間比較差異無統計學意義(F=1.479，P=0.854)。3組FRM1基因CGG重復序列分布情況見表1。

表1 3組FRM1基因CGG重復序列分布情況比較

2.2 中間型分布情況本研究將中間型(灰色區域)的CGG重復次數擴增范圍定義在45～54，結果發現，自然流產組中間型FMR1基因檢出1例，中間型FMR1基因攜帶率為1∶84；復發性流產組中間型FMR1基因檢出1例，中間型FMR1基因攜帶率為1∶60；對照組未檢出中間型FMR1基因。3組間比較，差異無統計學意義(χ2=1.282，P=0.744)。

2.3 基因突變情況比較試驗組患者FMR1基因前突變攜帶者2例，攜帶頻率為1∶72，對照組中未檢出FMR1基因前突變者，組間比較差異無統計學意義(χ2=0.055，P=0.452)。不論是試驗組患者或是對照組女性均未檢出FMR1基因全突變。

3 討論

近來早期胚胎停育現象愈發多見，中華醫學會婦產科分會《復發性流產診治的專家共識》明確提出妊娠12周前發生的早期復發性流產多因遺傳因素導致，但該指南中僅僅提到夫妻雙方全核型分析與胚胎絨毛染色體[7]。FMR1基因位于X染色體末端Xq23.7，編碼脆性-X智力障礙基因，會引起女性卵巢儲備功能下降，誘發卵巢早衰[9]。卵巢儲備功能直接與女性生育能力及妊娠結局相關，CGG重復序列為55～200已被研究證實與卵巢早衰息息相關[10]。給予上述論證，本研究主要分析CGG重復擴增是否與自然流產及復發性流產相關。

目前，CGG重復數量變化劃分標準被國際公認的有兩個，分別由歐洲人類遺傳學會與美國醫學與遺傳學會制定[8]，后者在臨床上的應用較常見。根據CGG擴增頻率高低，會誘發不同的臨床癥狀，諸如脆性X相關原發性卵巢功能不全、脆性X綜合征及脆性X相關共濟失調等[9]。CGG重復數在5～44次的FMR1基因為被定義為正常型或未受累型，攜帶這類正?；蛘咂洳粫憩F出顯著的臨床病癥，這類人群的CGG重復數以29、30次最常見，位于這個區段的CGG重復序列不會存在子代擴增的風險；CGG重復數在45～54次的FMR1基因被定義為中間型或灰區FMR1基因，攜帶這類基因者無顯著臨床病癥，也無證據證明這個區段內CGG重復序列可能會增加子代脆性X綜合征的風險；CGG重復序列次數在55～200之間的FMR1基因被定義為FMR1前突變型基因，其擴增程度在母系遺傳中極其明顯，可能會導致后代的CGG重復數由前突變擴增至完全突變，對于這類攜帶FMR1前突變型基因的攜帶者而言，其每次懷孕均應該接受產前診斷[10～12]。目前尚無報道發現父系遺傳擴增至完全突變的案例，故父親存在FMR1基因前突變者在生育后代時可不進行產前診斷。經上述論證可以認為FMR1基因突變可能與自然流產及復發性流產相關，這可能與以下機制有關：①FMR1基因前突變型、完全突變型的CGG序列超甲基化，故有發生脆性X綜合征的風險；②女性FMR1基因前突變型攜帶者有超過20%的幾率會出現卵巢早衰及早期閉經的情況，故對生育能力產生明顯影響；③CGG重復數在200次以上的全突變型FMR1基因，其在臨床上會導致X脆性綜合征[13，14]。

本研究結果顯示，無論是自然流產組、復發性流產組還是對照組女性的CGG重復次數頻率最高的均為30、29，其次為36、31，這與國內張有成等[15]報道結果高度一致。此外，結果顯示，3組FMRI基因中間型攜帶率比較未見明顯差異，試驗組FMR1基因前突變攜帶率高于對照組，但經統計學分析后未見差異，結果可以看出，FMR1基因突變可能會增加自然流產及復發性流產風險，而在本研究中未見差異可能與本次研究納入樣本量較少有關，結果的真實性與可靠性還應在未來展開大樣本的研究加以證實。FMMR1等位基因大小在45～200，是減數分裂不穩定的，可以遺傳為減數分裂的后代，FMR1基因也經歷了異常甲基化，這些不穩定的突變可能會導致與生命不相容的缺陷，并引起流產，且前突變型FMR1基因對卵巢功能的損害現已被醫學界廣泛接受，可以猜測該基因可能通過對卵巢的影響來增加女性流產風險[16]。但上述機制均未被循證醫學所證明，也尚無相關的報道能夠給予其理論支持，這就需要檢測復發性流產患者流產物內DNA表達來證明，尋找其擴增等位基因或改變的FMR1基因。

綜上所述，FRM1基因突變可能與自然流產及復發性流產相關，檢測自然流產及復發性流產患者的FRM基因突變情況，對給予下次妊娠優生指導有著積極意義。