微染色體維持蛋白6高表達與肝細胞癌預后關系的研究

邵 琿，胡 志，宋 強，閆丹丹，楊龍寶

(1.西安交通大學第一附屬醫院結構性心臟病科，陜西 西安 710061；2.西安交通大學第二附屬醫院消化內科，陜西 西安 710004)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是原發性肝癌的主要類型，是全球范圍內最為常見的一種惡性腫瘤。隨著近年來分子生物學等新技術的發展，識別特定的分子生物標記物對肝癌的診治、預后有著重要的臨床意義[1]。目前多數研究重點放在針對肝癌的分子發病機制基礎上，試圖尋找新的腫瘤標記物和潛在靶向治療點[2]。微染色體維持蛋白(minichromosome maintenance protein，MCM)家族是一個新近報道的基因家族，在真核生物基因組復制過程中發揮重要作用。其家族成員包括MCM2～7，其中MCM6是由Holthoff等在突變酵母中發現并分離提取出來的。諸多研究報道，MCM蛋白在癌癥進展及預后方面發揮重要作用，其在多種惡性腫瘤中異常表達[3～6]。有研究發現，HCC患者血漿MCM6 mRNA和蛋白水平與血管浸潤、TNM分期、淋巴結轉移相關，MCM6被認為是特異性細胞增殖相關因子，血清MCM6可作為肝癌的一種獨立生物標記物[7]。本研究評估了MCM6在HCC中的表達及與HCC臨床特征的關系，探討了MCM6在HCC患者中的潛在預后意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料2008年1～12月癌癥基因組圖譜(TCGA)數據庫中376例HCC患者的臨床資料，其中MCM6表達374例，癌旁組織50例。

1.2 方法收集HCC患者的基因表達譜和臨床資料，如年齡、性別、組織學分級、病理分期及總生存率等。

1.3 統計學方法所有統計分析均采用R軟件[8]進行。采用Wilcoxon符號秩和、Kruskal-Wallis檢驗及Logistic回歸分析MCM6表達水平與臨床參數的關系。采用Kaplan-Meier法分析MCM6表達水平與患者總生存率(OS)之間的相關性。多變量Cox分析用于驗證MCM6表達與生存率以及其他臨床特征之間的相關性。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者的臨床參數376例HCC患者的臨床資料，包括年齡、性別、病理分期、組織學分級、總生存率及預后等。見表1。

表1 HCC患者的臨床參數

2.2 MCM6在HCC中的表達HCC中MCM6的表達水平明顯高于癌旁組織(P<0.05)。MCM6在50例HCC中的表達水平亦顯著高于配對的癌旁組織(P<0.05)，見圖1。

圖1 HCC中的MCM6明顯高于癌旁組織 a.癌組織與癌旁組織；b.癌組織與配對的癌旁組織

2.3 HCC患者中MCM6表達的影響因素Logistic回歸分析顯示，MCM6在<60歲HCC中的高表達風險明顯高于≥60歲HCC患者(P<0.05)，且隨著組織學分級(G3 vs G1，G4 vs G1)、病理分期(III+IV級 vs I+II級)、T分期(T2 vs T1，T3 vs T1)的分級逐漸增高，MCM6在HCC中的高表達風險亦愈高(P均<0.05)，見表2。

表2 HCC患者中MCM6表達的影響因素分析

2.4 MCM6表達對HCC患者預后的影響根據HCC患者中MCM6表達值的中位數將患者分為高表達組和低表達組。缺乏完整臨床資料的患者數據不被納入分析。Kaplan-Meier生存分析表明，與MCM6低表達組相比，MCM6高表達組的HCC患者生存期限明顯較差(P<0.05)，見圖2。多因素cox回歸分析表明，僅有MCM6表達與OS明顯獨立相關(P<0.05)，見表3。

圖2 MCM6不同表達水平的HCC患者的生存曲線

表3 HCC患者中MCM6表達與患者總生存率關系的多因素cox回歸分析

3 討論

HCC是全球范圍內普遍存在的一種惡性腫瘤，因其臨床癥狀出現較晚，癥狀出現時多數已處于中晚期，因而易錯過最佳手術時機，預后較差。目前其治療手段仍然較局限，治療效果不甚理想，復發率和死亡率較高，因此對于肝癌的早發現、早診斷、早治療就顯得尤為重要，而肝癌的治療對我們來說仍是一個巨大的挑戰[2]。肝癌的發生發展過程十分復雜，目前尚沒有完全統一明確的發病機制[9]。由于目前分子生物技術、基因組學工程等發展迅速，人們對肝癌的研究也逐漸深入，眾多學者開始致力于篩選理想的肝癌標記物，試圖從分子標記物著手，希冀發現較為特異的肝癌標記物，從而為肝癌的診治提供有利幫助。目前在肝癌的研究領域里，尚未發現任何一種肝癌分子標記物能夠較為特異的診斷肝癌。當前用于篩查HCC的常用方法是血清α-甲胎蛋白(AFP)檢測和肝臟成像，例如超聲和計算機斷層掃描，但由于AFP在某些組織學類型肝癌和部分小肝癌患者中可能表現出陰性結果，因此迫切需要開發新的生物標記物以對部分類型肝癌進行早期診斷和作為AFP陰性肝癌的補充篩查手段。有研究發現，臨床最常見的肝癌腫瘤標志物 AFP蛋白和MCM6蛋白在區分總HCC組和非HCC組方面的敏感性分別為78.7%、67.2%，而在特異性方面分別為57.6%、89.8%。在全部HCC患者中，MCM6 mRNA和蛋白與AFP蛋白水平無顯著相關性(P>0.05)[7]。因此，為了能夠在肝癌的早發現、早診斷及靶向治療方面有所突破，尋求特異性和敏感性更高的肝癌分子生物標記物迫在眉睫。

MCM6是MCM基因家族成員之一，而MCMs在DNA復制中起著至關重要的作用[10]。有研究報道MCMs只在增殖細胞和具有增殖潛能的細胞和中表達，在腫瘤細胞中的表達明顯高于正常細胞[11，12]。MCMs是細胞增殖的候選標記物，MCMs水平升高提示惡性細胞增殖。越來越多的證據表明MCMs可以預測腫瘤進展和預后。研究發現MCM6在乳腺癌中高表達，并可作為其臨床診斷及預后的一個很有意義的生物學指標[13]。在霍奇金淋巴瘤病人的活檢淋巴結中，MCM6高表達是淋巴瘤細胞的一個顯著特點[13]。同時，MCM4、MCM5、MCM6、MCM10和RECQL4 mRNA的過度表達被認為是宮頸癌預后不良的指標[5]。MCM2被證明是食管癌和膀胱癌的生物標記物[14，15]。總之，近年來越來越多研究發現，MCM6在多種惡性腫瘤中表達上調，如胃癌、子宮內膜癌、腦膠質瘤等，MCM6表達增加與腫瘤患者的低生存率明顯相關[7，9，10]。MCMs除了作為細胞增殖標記外，MCM蛋白的診斷潛力也一直是人們關注的焦點。有研究[16]通過免疫染色結果和臨床實踐證實MCM陽性細胞大多分布在惡性和癌前上皮細胞的表面，這意味著臨床細胞學標本容易獲取和復制。因此，MCMs在癌癥篩查和診斷中具有廣闊的應用前景。有研究證實，與非腫瘤標本相比，MCM2、MCM6和MCM7蛋白在HCC中的表達水平顯著增高[4]。另有學者發現，MCM2-7蛋白可作為HCC的敏感診斷標志物，其中生存分析和聯合效應分析表明，MCM2聯合MCM6可共同作為HCC的預后指標[17]。通過PCR和平行免疫染色進一步證實，MCM6在HCC中的診斷和預后優于MCM2和其他MCM[4，7]。MCMs水平的升高既有助于腫瘤的早期診斷，又能夠預測腫瘤的復發[4]。以上這些研究足夠說明MCM6在癌癥的發生、發展及預測預后中發揮關鍵作用。

在本文中，我們試圖確定MCM6表達在HCC進展中的作用，特別是作為HCC預后因素的作用。既往研究發現[18，19]，肝癌高發年齡段多集中在50～60歲，本研究將60歲設為年齡節點，結果發現MCM6在HCC組織中的表達明顯高于癌旁組織，其高表達與發病年齡、組織學分級、病理分期、T分期有關，即MCM6在<60歲患者中的表達明顯高于≥60歲患者(P<0.05)，隨著組織學分級(G3vsG1，G4vsG1)、病理分期(III+IV級vsI+II級)、T分期(T2vsT1，T3vsT1)的分級逐漸加重，MCM6表達亦隨之增加(均P<0.05)。這些結果表明，隨著MCM6表達的增加，HCC患者病情有可能進展到更晚期，腫瘤浸潤范圍可能更廣，惡性程度更高。其次，Kaplan-Meier生存分析顯示，與MCM6低表達組相比，MCM6高表達組的OS較差，進一步的多因素分析表明MCM6的表達是HCC的一個獨立預后因素，與既往研究結果[4]一致，即MCM6獨立預測了HCC患者的較差生存率，以及血清MCM6水平被報道為HCC的獨立生物標志物，特別是在AFP陰性和小肝癌患者中。

如上所述，MCM6是一種HCC較優的診斷和預后指標，可作為肝癌患者一種新型生物標志物，同時是常見腫瘤標志物AFP篩查HCC的補充手段，為以后肝癌患者的臨床診治工作提供了新的選擇和診療思路。當然，我們的研究也有一些局限性。首先，我們在本研究中分析的數據是從公共數據庫中提取出來的，這些數據庫沒有經過驗證。其次，MCM6調控HCC發生發展以及預后的機制有待進一步研究，推測其可能通過改變細胞增殖而引起肝癌的發生發展，當然同時需要更大規模的臨床試驗來證實MCM6在HCC患者中的診斷和預后價值。

綜上，本研究顯示MCM6在HCC中高表達，參與了HCC的發生發展，是預測HCC患者OS很有價值的預后因素，可作為HCC的潛在診斷和預后標志物。但需要更多的研究來驗證本研究的發現。