羥氯喹對IgA腎病大鼠腎臟病理和Toll樣受體4表達的影響

李優，姜紅，李維

（中國醫科大學附屬第一醫院兒科，沈陽 110001）

IgA腎病 （IgA nephropathy，IgAN） 是最常見的原發性腎小球疾病之一，不同國家患病率有很大的差異。13個歐洲國家的腎臟疾病數據顯示，22%的腎臟病患者確診為IgAN，在日本和泰國IgAN的發病率為39%，而在中國原發性腎小球腎病患者中超過40%確診為IgAN，并且患病年齡趨于年輕化［1-3］。目前IgAN的發病機制尚不十分清楚，亦無明確有效的治療方法。IgAN的臨床治療一般采用糖皮質激素作為基礎治療，根據患者病情使用免疫抑制劑，如環磷酰胺與霉酚酸酯等，但藥物相關不良反應較重，且IgAN仍是終末期腎病的主要病因之一。因此，明確IgAN發病機制、尋找有效的治療方法仍是目前急需解決的熱點問題。

羥氯喹是臨床常用的的抗瘧藥物，已被用于系統性紅斑狼瘡和類風濕性關節炎等自身免疫性疾病的臨床治療中，可通過抑制炎癥信號通路、減少炎性細胞因子來調節機體免疫反應。IgAN是以IgA沉積為主的免疫相關性腎小球疾病，本研究通過觀察IgAN大鼠在羥氯喹治療前后腎臟病理和Toll樣受體4 （Toll-like receptor 4，TLR4） 表達水平的變化，探討羥氯喹對IgAN的免疫治療作用，為IgAN的治療提供新的治療措施。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

24只SPF級雄性Wistar大鼠，體質量 （150±10）g，購自并飼養于中國醫科大學實驗動物部。所有實驗均符合實驗動物使用的倫理學要求，并獲得中國醫科大學動物倫理委員會的批準 （批準編號：2018046）。

1.2 方法

1.2.1 IgAN大鼠模型的制備和分組：將24只大鼠隨機分為3組：對照組、IgAN組、羥氯喹治療組 （HCQ組），每組8只。IgAN組和HCQ組：先制備IgAN模型，給予400 mg·kg-1·d-1牛血清白蛋白 （1 ∶10，美國Sigma公司） 隔天灌胃，共8周，同時每周1次皮下注射蓖麻油 （0.3 mL，大連美侖生物科技有限公司） 和CCl4（0.1 mL，遼寧新星試劑有限公司），共9周，分別在第6周初和第9周初，經尾靜脈注射0.05 mg脂多糖（美國Sigma公司） 0.2 mL。對照組：0.4 mL蒸餾水灌胃，0.4 mL生理鹽水皮下注射，0.2 mL生理鹽水尾靜脈注射。第9周末，每組隨機處死1只大鼠，取腎組織行免疫熒光染色，鑒定IgAN造模成功。

1.2.2 羥氯喹干預治療：HCQ組大鼠給予54 mg·kg-1·d-1羥氯喹灌胃 （上海上藥中西制藥有限公司），對照組和IgAN組大鼠給予4 mL·kg-1·d-1蒸餾水灌胃，持續8周。第17周末，給予大鼠10%水合氯醛腹腔麻醉后處死，摘除腎臟，取部分腎皮質，置于標準固定液中，常規石蠟包埋。

1.2.3 蘇木素-伊紅染色：按照蘇木素-伊紅試劑盒 （北京索萊寶試劑有限公司） 說明書進行操作。常規脫水、透明、中性樹膠封片，在光鏡視野下觀察拍攝。

1.2.4 Masson染色：按照Masson染色試劑盒 （福州邁鑫生物科技發展有限公司） 說明書進行操作。常規脫水、透明、中性樹膠封片，在光鏡視野下觀察拍攝，應用ImageJ軟件分析膠原纖維面積百分比。

1.2.5 直接免疫熒光染色：大鼠腎組織石蠟切片，經檸檬酸鹽緩沖液高壓修復，滴加FITC標記的IgA熒光抗體 （美國Abcam公司，ab97184），4 ℃避光過夜。滴加抗熒光淬滅劑，中性樹膠封片。在熒光顯微鏡視野下觀察拍攝，應用ImageJ軟件分析IgA沉積熒光強度，按照國內外通用的5級半定量法（-～++++）判定。

1.2.6 免疫組織化學染色：大鼠腎組織石蠟切片，經檸檬酸鹽緩沖液高壓修復，滴加抗TLR4/MD2復合物抗體 （1 ∶100，美國Abcam公司，ab95562） 約50～100 μL，4 ℃避光過夜。二抗孵育30 min，DAB染色，常規脫水、透明、中性樹膠封片。在光鏡視野下觀察拍攝，應用Image-Pro Plus 6.0軟件分析TLR4表達情況。

1.3 統計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。所有結果均以表示。Masson染色和直接免疫熒光染色數據呈正態分布及方差齊，采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗，免疫組織化學染色數據方差不齊，組間比較采用Dunnett T3檢驗。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般情況

對照組：大鼠毛發順滑有光澤，進食正常，體質量勻速增長，平均每周增長14.5 g，精神狀態良好。IgAN組：大鼠毛發蓬亂晦暗、無光澤，進食減少，體質量增長慢，平均每周增長10.6 g，精神狀態萎靡。HCQ組：大鼠毛發整齊略晦暗、進食正常，體質量增長稍慢，平均每周增長11.0 g，精神狀態適中。

2.2 腎組織病理改變

2.2.1 HE染色觀察腎臟形態學改變：光鏡下觀察，對照組腎小球和腎小管正常，腎小球間質未見炎癥細胞浸潤；IgAN組腎小球萎縮，彌漫性腎小球系膜區增寬，腎小管上皮細胞腫脹脫落，間質炎癥細胞浸潤；HCQ組腎小球系膜區輕度增寬，腎小管上皮細胞脫落，炎癥細胞浸潤至腎間質。與IgAN組相比，HCQ組大鼠腎組織炎癥細胞浸潤和系膜細胞增生情況明顯改善；與對照組相比，HCQ組腎臟病理損傷仍比較明顯。見圖1。

圖1 腎組織HE染色分析 ×400Fig.1 HE staining of the kidney tissue ×400

2.2.2 Masson染色觀察腎臟纖維化程度：光鏡下觀察，與對照組相比，IgAN組和HCQ組大鼠腎內藍色膠原蛋白沉積明顯增多；與IgAN組相比，HCQ組腎內藍色膠原蛋白沉積明顯減少。結果顯示，IgAN組大鼠腎組織纖維化面積比例［（2.469±0.312） %］顯著高于對照組［（0.624±0.173） %］和HCQ組［（1.494±0.315） %］，HCQ組大鼠腎組織纖維化面積比例明顯高于對照組，差異均有統計學意義 （P＜ 0.05）。見圖2。

2.3 直接免疫熒光染色法檢測系膜區IgA沉積

圖2 腎組織Masson染色分析 ×200Fig.2 Masson’s staining of the kidney tissue ×200

熒光顯微鏡下觀察，對照組系膜區無明顯IgA熒光沉積，熒光強度為（-）；IgAN組可見系膜區強的綠色IgA熒光沉積，熒光強度為（++～+++）；HCQ組可見系膜區較弱的綠色IgA熒光沉積，熒光強度為（-～++）。統計分析結果顯示，與對照組［（0.000±0.000）ng/L］相比，IgAN組［（577.293±168.973） ng/L］和HCQ組［（136.750±54.373） ng/L］IgA沉積密度明顯增加（P＜ 0.05） ；與IgAN組相比，HCQ組IgA沉積密度明顯降低 （P＜ 0.05）。見圖3。

2.4 免疫組織化學染色檢測TLR4表達

光鏡下觀察，對照組大鼠腎內無褐色顆粒沉積，IgAN組大鼠腎內可見明顯增多的褐色物質。與IgAN組相比，HCQ組褐色物質沉積明顯減少。結果顯示，與對照組［（0.098±0.023） %］相比，IgAN組［（0.754±0.166） %］和HCQ組［（0.299±0.073） %］腎組織內TLR4陽性表達率均明顯升高 （P＜ 0.05） ；與IgAN組相比，HCQ組腎組織內TLR4陽性表達率明顯降低 （P＜ 0.05）。見圖4。

3 討論

IgAN病理特征為腎小球系膜區IgA （低糖基化的IgA1為主） 沉積或伴有C3沉積，腎小球系膜細胞增生與細胞外基質增加，是影響IgAN腎功能進展的重要危險因素［4-5］。本研究中，IgAN大鼠腎內出現大量炎癥細胞浸潤、系膜細胞增生和腎纖維化，系膜區有大量IgA沉積，表明大鼠腎組織損害嚴重，一般狀態亦明顯下降。目前IgAN的發病機制尚不清楚，近年研究發現，TLR4參與IgAN的發生、發展過程。

圖3 IgA沉積的直接免疫熒光分析 ×400Fig.3 IgA deposition analyzed by direct immunofluorescence assay ×400

圖4 TLR4表達的免疫組織化學分析 ×400Fig.4 TLR4 expression analyzed by immunohistochemical staining ×400

TLR4廣泛存在于哺乳動物的先天免疫系統中，介導一種緊密集成的信號轉導，識別病原體相關的分子模式，通過MyD88依賴通路和MyD88獨立通路共同調節促炎性細胞因子和趨化因子的表達，產生有效的促炎癥和纖維化的介質。越來越多的研究表明，TLR4是調節腎臟免疫炎癥反應的關鍵細胞因子。LI等［6］發現，抑制TLR4介導的核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）/絲裂原活化蛋白激酶 （mitogen activated protein kinases，MAPK） 信號通路，能夠減輕炎癥反應，減少細胞外基質的積累，并改善單側輸尿管阻塞小鼠的腎纖維化程度。目前，對于TLR4參與IgAN的致病機制也逐漸明確，隨著IgAN患者外周血單核細胞中TLR4mRNA轉錄和表達增多，血清中單核細胞趨化因子-1和白細胞介素（interleukin，IL） -6的表達也相應增加［7］。本研究發現，與對照組相比，IgAN組大鼠TLR4表達明顯增多，腎臟炎癥反應和腎纖維化程度均顯著增強，IgA沉積增多，證實TLR4參與IgAN大鼠腎內炎癥反應發生，并提示TLR4的表達與腎內IgA沉積相關。

近年來，羥氯喹作為免疫抑制劑對調節自身免疫反應有顯著作用，能夠降低α干擾素、IL-6和腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α）等細胞因子的產生，口服后易分布在皮膚、肝、腎等器官，易通過細胞膜，生物利用率高，也能夠通過胎盤發揮作用，維持較高的血藥濃度。WU等［8］提出，羥氯喹能降低類風濕性關節炎患者繼發性慢性腎臟病的發生風險。近來研究發現，羥氯喹作為免疫抑制劑，治療IgAN的效果也越來越明顯。在氯沙坦和腎素-血管緊張素-醛固酮抑制劑治療IgAN的基礎上加用羥氯喹，能加強對IgAN患者腎臟的保護作用，明顯降低IgAN患者蛋白尿水平［9-11］。為了進一步明確羥氯喹對IgAN的病理改善作用，本研究給予IgAN大鼠羥氯喹治療，發現3組大鼠腎臟病理改變有明顯差異，與IgAN組大鼠相比，HCQ組大鼠腎小球系膜細胞增生程度減弱，炎癥細胞浸潤減少，纖維化程度、IgA沉積密度和TLR4陽性表達率均顯著下降 （P＜ 0.05），表明羥氯喹能夠通過抑制免疫炎癥反應減輕腎損傷。

BAI等［12］發現羥氯喹能夠抑制NF-κB、IL等相關炎性細胞因子的釋放，減輕炎癥反應，改善IgAN大鼠腎臟功能。還有研究［13］證實，TLR4在調節NF-κB、IL和TNF-α等炎性細胞因子的表達過程中起重要作用。目前，羥氯喹治療IgAN過程中TLR4的作用機制尚未明確。本研究發現，相比于IgAN組大鼠，HCQ組大鼠腎內TLR4表達明顯被抑制，炎癥細胞減少，證明羥氯喹可通過抑制TLR4的表達發揮抗炎作用，減少腎纖維化形成、系膜區IgA沉積。

綜上所述，羥氯喹能夠通過抑制TLR4的表達，減輕大鼠腎臟病理損傷，對IgAN大鼠腎臟有保護作用。但羥氯喹對抑制系膜細胞增生的作用機制仍需進一步研究，而且本研究基于大鼠實驗，觀察時間較短，應同時結合臨床患者的病例研究，進一步明確羥氯喹對IgAN患者的臨床治療意義。