基于16SrRNA基因測序技術分析痰證糖耐量減低患者的腸道菌群特點*

杜含光 陳霞波 顧穎杰 周 開 張 業 謝莉莎

1 寧波市中醫院 浙江 寧波 315010

2 浙江中醫藥大學 浙江 杭州 310053

糖耐量異常(impaired glucose tolerance，IGT)主要表現為糖耐量減低，此類患者發生糖尿病的風險顯著高于正常人，飲食運動干預雖經濟、安全，但臨床不少患者依從性差，腸道菌群調節劑逐漸成為防治IGT的新靶點[1-2]。16SrRNA基因是細菌上編碼rRNA相對應的DNA序列，存在于所有細菌的基因組中。本研究擬通過16SrRNA基因測序技術檢測痰證IGT患者與健康人群的腸道菌群，分析腸道菌群基因組成結構及多樣性的差異，探討腸道菌群與IGT痰證的相關性及規律，旨在通過保持腸道的菌群平衡來預防IGT的發病，為中醫藥證候研究提供新的研究思路和方法。

1 資料與方法

1.1 研究對象：40例患者均來自寧波市中醫院的IGT患者，經院倫理委員會批準且自愿簽署知情同意書。其中男22例，女18例，年齡28～70歲，平均45.16±6.23歲。

1.2 IGT診斷標準：空腹血糖＜7.0mmol/L；葡萄糖耐量試驗(OGTT)即口服75g葡萄糖2h后血糖7.8～11.1mmol/L。（以上為靜脈血漿測值）

1.3 證素辨證：具體方法參照朱文鋒《證素辨證學》。以“常見癥狀的辨證意義”為依據，制定全面、規范化采集表進行證素評分，確定證素是否存在及輕重程度。如積分＜70分，歸為0級，說明基本無病理變化；70分≤積分＜100分，歸為1級，說明該證素存在輕度病變；100分≤積分＜150分歸為2級，說明存在中度病變；積分≥150分，歸為3級，說明存在重度病變。臨床出現的兼夾證分別計入與之相應的證素。

1.4 納入標準：①符合以上診斷標準者；②患者依從性好，配合調查。

1.5 排除標準：①年齡＜30歲或＞70歲；②Ⅰ型、2型糖尿病和妊娠糖尿病者、繼發性高血壓、繼發性高脂血癥者；③有嚴重的心、肝、腎等并發癥；④精神病者；⑤孕婦及哺乳期婦女⑥半年前有使用抗生素史。

1.6 健康對照人群：在健康體檢人群中篩選。剔除標準：有糖尿病、高血壓、高血脂、冠心病、腦血管病、惡性腫瘤及慢性感染病史；有明顯的血糖、血脂、血常規及肝腎功能異常者。

1.7 四診資料采集：根據《中華人民共和國國家標準·中醫臨床診療術語》，制定規范量表，做到四診資料規范化。由2名（內分泌科主治或主治以上的醫師）經過嚴格培訓且合格中醫專業人員按規范的方法收集四診資料。

1.8 證的要素提?。罕狙芯恐袣馓撎禎嶙C組是指痰和氣虛的病理積分同時≥100分者；而非氣虛痰濁證組是指患者可能存在一定程度的痰的病理變化，但尚未構成真正意義的痰證，具體地說，即痰和氣虛的病理積分＜100分者。每一癥狀的輕重，以中等程度為準，若該癥狀重時，其定量診斷值乘1.5，若該癥狀輕時，乘0.7。

1.9 糞便樣本DNA抽提和檢測：樣本中微生物DNA的提取采用QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒（QIAGEN，Hilden，Germany）。提取方法按照試劑盒說明書進行。利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA的完整性。

1.10 細菌16SrDNA序列擴增和MiSeq測序：選取16S rDNA的 V4-V5區序列進行高通量測序分析。采用兩步PCR擴增方法進行文庫構建。將純化的DNA作為模板，利用 16SrDNA V4-V5區通用引物 515F(5’-GTGCCAGC‐MGCCGCGG-3’)和926R（5’-CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3’）PCR擴增目的片段16S rDNA V4-V5區。

1.11 統計學分析：所有數據均用SPSS 22.0軟件進行統計分析。使用t檢驗對不同分組間基本資料進行差異分析。分類學分析采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析。檢測組間物種顯著豐度差異采用Kruskal-wilcox非參數檢驗。計量資料采用t檢驗，數據以平均值±標準差（±s）表示，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 菌群物種注釋分析：在97%相似水平下對OTU進行標準聚類，得到579個OTU，根據序列繪制聚類韋恩圖，其中痰證組（A1）與健康組（C）標本包含的數目分別為570、385個，2種標本共有的OTU數目為376個（圖1）。

圖1 OTU韋恩圖

2.2 菌群結構組成分析：對兩組研究對象樣本進行菌群結構組成分析，圖2為兩組標本分別在門、綱、目、科、屬、種分類等級的物種相對豐度柱狀圖。圖3為群落在各分類水平上的Heatmap圖。門水平上IGT痰證患者（A1）與健康人（C）腸道中菌群優勢物種極其相似，痰證組與健康組的優勢菌群中軟壁菌門的相對豐度差異較大，痰證組軟壁菌門的相對豐度顯著高于健康組（見圖3A）。綱水平上以擬桿菌綱、梭菌綱、γ-變形菌綱、Nneg‐ativicute為優勢菌群；痰證組（A1）與健康組（C）腸道中優勢菌所占比例不同（圖2B）：痰證組與健康組中梭菌綱、桿狀菌綱、α-變形菌綱、梭桿菌綱的相對豐度差異明顯，痰證組桿狀菌綱、α-變形菌綱、梭桿菌綱的相對豐度高于健康組（見圖3B）。圖2C為兩組標本分別在目分類等級的物種相對豐度柱狀圖，痰證組與健康組中梭菌目、乳桿菌目、梭桿菌目的相對豐度差異較大，痰證組中梭菌目的相對豐度明顯低于健康人，乳桿菌目、梭桿菌目的相對豐度明顯較健康人高（圖3C）?？扑缴咸底C組（A1）與健康組（C）的優勢菌群存在差異，圖2D為兩組標本分別在科分類等級的物種相對豐度柱狀圖。痰證組與健康組中乳桿菌科、普雷沃氏菌科、梭桿菌科的相對豐度差異較大，均高于健康組（圖3D）。圖2E為兩組標本分別在屬分類等級的物種相對豐度柱狀圖，其中乳桿菌屬、普雷沃氏菌屬、梭桿菌屬、腸球菌屬的相對豐度痰證組較健康組高，雙歧桿菌屬、瘤胃球菌屬、罕見小球菌屬痰證組較健康組低（圖3E）

圖2 IGT痰證組與健康組菌群在各分類水平上的豐度柱狀圖

2.3 菌群物種差異分析：為檢測兩組微生物群落在各個分類水平中表現出的豐度差異，并用柱形圖展示出來（圖3）。在屬水平上，痰證組普雷沃氏菌、梭桿菌的豐度顯著高于健康組，罕見小球菌屬、勞特氏菌屬、副薩特氏等屬的豐度顯著低于健康組（圖3E）；種水平上，痰證組普雷沃氏菌、乳桿菌、加德納菌、韋榮氏球菌豐度顯著高于健康組（圖3F）。

圖3 IGT痰證組與健康組菌群在各分類水平上 Heatmap的圖

2.4 群落多樣性分析：以shannon指數來評價腸道微生物的多樣性，shannon指數越大表明群落多樣性越強，將兩組樣本的shannon指數通過秩和檢驗得出兩組樣本的shannon指數的P值為0.043，其差異具有統計學意義（P＜0.05）（圖4），IGT痰證患者腸道菌群群落的多樣性顯著低于健康人。

圖4 痰證組與健康組shannon指數線箱圖

3 討論

在IGT發病過程中，胰島素抵抗（insulin resis‐tance，IR）被認為是始動和中心環節。越來越多的證據顯示，腸道微生態的改變在IGT和2型糖尿病發病中起著重要作用。[3-5]本研究通過高通量測序技術對樣本腸道菌群的16S rRNA V4-V5區進行測序分析，兩組人群的腸道菌群的組成結構差別主要體現在某些具體種類的菌群其數量占比的改變以及相對豐度的改變。本研究中觀察組的普氏菌相對豐度明顯要高于對照組，Ruminococ‐caceae（瘤胃菌）的相對豐度較正常組顯著下降，既往研究發現普氏菌與腸道的通透性相關，具有抵御病原菌防止炎癥的發生和調節血糖的重要作用[6-7]。國外最新一項研究探討了腸道菌群代謝組與胰島素抗性之間的關系，發現在胰島素抗性個體中脂多糖和支鏈氨基酸(BCAA)生物合成的潛力增大。這表明，由腸道菌群失調的血清代謝組變化有可能導致糖尿病的發生發展。普氏菌和普通擬桿菌參與經證實腸道細菌生物合成BCAA，為了在機制上測試腸道細菌是否真的導致胰島素耐受性，研究人員小鼠喂食人體普氏菌。喂食人體普氏菌的小鼠血中BCAA明顯升高，而且產生胰島素耐受性和葡萄糖不耐受性。研究人員還發現，瘤胃菌科的微生物家族與血管硬化關系密切，瘤胃菌的多樣性低，血管硬度水平高[8]。

綜上，我們認為痰證是導致代謝綜合征、IGT等多種代謝疾病的一種病理因素，此次研究我們初步推測，痰證IGT患者普氏菌豐度的增加以及瘤胃菌科豐度值下降，可能是導致IGT痰證的潛在因素。補充和調節瘤胃菌、普氏菌的豐度值可能是靶向治療和預防IGT痰證患者的有效途徑之一，但由于本文中16SrRNA基因測序技術的局限性以及納入的研究對象數量有限，后續研究可考慮應用宏基因組測序技術并增大研究樣本量，找出差異基因，以進一步探討普氏菌和瘤胃菌科相互作用于IGT的內在機制。