替莫唑胺聚合物前藥及納米組裝體的性質研究

李仲琪，葛 穎，李玉玲

(1.江蘇師范大學 化學與材料科學學院，江蘇 徐州 221116;2.上海協和雙語高級中學，上海 201103)

1 引言

癌癥是一種致死率極高的疾病，當前人類正面臨著癌癥的嚴重威脅。臨床上治療癌癥常見的方法包括化學藥物療法(化療)、放射療法和外科手術，這3種療法可以單獨使用或組合使用，其中化療是臨床上治療癌癥的首選療法[1]，但由于化療中使用的抗癌藥物一般缺乏選擇性，對正常的組織器官具有很高的毒副作用，并且無法在腫瘤部位累積，使得化療效果不佳[2]。

替莫唑胺(TMZ)是臨床上治療腦部腫瘤的一線藥物，具有親脂性、酸穩定性等優良性質，毒副作用較小，并且能穿透血腦屏障(BBB)[3，4]。作為小分子前藥，TMZ在生理pH值(7.4)下發生水解，釋放出一種正離子-甲基重氮陽離子(CH3N2+)，然后通過DNA的腺嘌呤和鳥嘌呤核堿基的甲基化，引發抗腫瘤活性[5]。但是，TMZ的這種作用機制也同樣意味著其在人體環境條件下不穩定，易降解，導致其血漿溶液中半衰期小于2 h[6]，因此在臨床上需要頻繁給藥來維持TMZ的有效濃度，達到對癌細胞的抑制作用。這一方面造成藥物的利用率低，另一方面也導致其對正常細胞組織造成嚴重損傷[7]。因此，如何增強TMZ的穩定性引起了人們的廣泛關注。

聚合物前藥是將小分子藥物連接到聚合物上得到的一種聚合物-藥物結合物，能增強疏水藥物的水溶性、減弱藥物的毒副作用，并延長其在體內環境中的循環時間，進而增加藥物在腫瘤細胞處的積累，有效增強小分子化學治療劑的抗腫瘤功效，增強其抗腫瘤活性[8]。聚合物前藥可改善藥物的藥代動力學特性，由聚合物前藥所進一步發展的納米載藥體系，可有效遞送各種抗癌藥物及治療試劑，在今后的癌癥治療方面有著非常大的前景[9]。將抗癌藥物TMZ與聚合物通過化學鍵鍵合，制備TMZ的聚合物前藥可以增加TMZ穩定性，延長TMZ的半衰期，有效解決TMZ水溶性差等缺點[10,11]。

葡聚糖(Dextran)是一種天然多糖，它來源廣泛，具有良好的水溶性和生物相容性，已廣泛用于醫藥工業中[12]。

本文設計的是葡聚糖-替莫唑胺結合物(Dex-TMZ)，通過將疏水性藥物TMZ的衍生物(TMZ-COOH)通過簡單的酯化反應連接到親水性的葡聚糖側鏈上，得到兩親性聚合物，這種兩親性聚合物能夠在水中通過自組裝作用而形成一種納米組裝體-納米粒子(圖1)。通過激光動態光散射(DLS)對這種兩親性聚合物納米粒子進行表征，測定其粒徑分布及表面電荷，通過熒光分析儀測定納米組裝體的臨界聚集濃度(CAC)，通過紫外分光光度計研究納米粒子在磷酸鹽緩沖溶液(PB)中的降解行為。

圖1 葡聚糖-替莫唑胺結合物 (Dex-TMZ)的合成路線

2 材料與方法

2.1 試劑與儀器

2.1.1 試劑

替莫唑胺(TMZ) (99%)購于武漢東康源科技有限。葡聚糖購自Sigma公司。甲苯，二甲基亞砜(DMSO)，亞硝酸鈉，4-二甲基氨基吡啶(DMAP)，二環己基碳酰亞胺(DCC)，乙醇購于國藥集團化學試劑有限公司。其中甲苯和二甲基亞砜經過無水處理后使用，其它試劑均直接使用。

2.1.2 儀器

聚合物的核磁共振氫譜(1HNMR)通過布魯克公司的Bruker-400測試，使用的溶劑為氘代二甲亞楓(DMSO-d6)。納米組裝體的尺寸，分布及Zeta電位通過馬爾文公司的激光動態光散射儀(ZS 90)測試。TMZ的紫外吸收通過紫外分光光度計(TU-1950)測定。納米組裝體的臨界聚集濃度通過日本日立公司的熒光分光光譜儀(F-4600)測定后計算得到。

2.2 實驗方法

2.2.1 葡聚糖-替莫唑胺結合物的制備 (Dex-TMZ)

向溶解在19 mL DMSO中的葡聚糖溶液(0.5 g，3.10 mmol)中依次加入DMAP(0.19 g，1.55 mmol)，DCC(0.32 g，1.55 mmol)，替莫唑胺羧酸(0.30 g，1.55 mmol)。調節反應溫度為30 ℃，保持溫度反應48 h。反應結束后將溶液滴加到乙醇中，過濾收集沉淀，并用乙醇洗滌3次，真空干燥48 h，產率：61 %。

2.2.2 Dex-TMZ納米粒子的制備

將葡聚糖-替莫唑胺結合物(1.0 mg)溶解于1 mL DMSO中，攪拌過夜，然后在劇烈攪拌下向溶液中緩慢滴加1.5 mL超純水，將混合液超聲30 min后轉移到截留分子量為3500的透析袋中，透析24 h后得到Dex-TMZ納米粒子溶液，測量溶液的體積，計算Dex-TMZ納米粒子濃度。

2.2.3 聚合物Dex-TMZ納米粒子的粒徑及電位的測定

Dex-TMZ納米粒子的各種性質是在溫度為25 ℃，通過ZS 90測定。測試前使用0.45 μm的濾頭過濾，倒入樣品池中(1.0 mL)，放入儀器中測試，記錄納米粒子粒度分布及電位，共測試3次。

2.2.4 臨界聚集濃度(CAC)測定

在一系列濃度的Dex-TMZ納米粒子溶液中(0.00001～0.1 mg/mL)加入30 μL芘溶液(8×10-5M)。搖勻后使用熒光分光光度計(F-4600)進行測試，激發波長為330 nm，以納米粒子溶液濃度的對數(log C)為橫坐標，兩個波長373 nm和384 nm處的熒光強度比(I373/I384)為縱坐標，作圖計算得到臨界聚集濃度CAC。

2.2.5 TMZ的降解

通過磷酸鹽緩沖溶液(PB，pH值7.4)模擬人體體液環境，測試聚合物前藥Dex-TMZ中TMZ的降解，測試其相對于游離藥物的半衰期(t1 / 2)變化。具體是：將2.0 mL Dex-TMZ納米粒子溶液的 pH值調節至7.4，置于具塞玻璃比色皿中，調節恒溫振蕩器的速度為200 r/min，溫度為37 ℃，連續振蕩12 h，在預定時間點(0,1,2,4,8,24 h)測溶液的紫外吸收，以波長為橫坐標，納米粒子溶液的紫外吸收為縱坐標，作圖計算聚合物前藥中TMZ的半衰期。

3 結果與討論

3.1 聚合物前藥Dex-TMZ結合物的合成

聚合物前藥Dex-TMZ是通過葡聚糖的羥基和替莫唑胺衍生物的羧基之間的酯化反應制備。通過1HNMR表征Dex-TMZ(圖2)，圖2中同時出現了葡聚糖和替莫唑胺中氫的信號，在化學位移4.80×10-6，4.53×10-6，4.30×10-6，3.70×10-6，3.47×10-6處出現的是葡聚糖上氫的信號，替莫唑胺分子中氫的化學位移出現在3.69和7.95×10-6處：3.69×10-6是與四氮唑環連接的甲基氫(a)，7.95×10-6處為咪唑環上的雙鍵氫(b)。根據葡聚糖和替莫唑胺中氫的比例可以計算出每100個葡聚糖單元上連有41個替莫唑胺藥物分子，即TMZ的取代度為41，1HNM結果證明成功得到了疏水藥物TMZ的聚合物前藥：TMZ連接的葡聚糖Dex-TMZ。

圖2 Dex-TMZ 的核磁共振氫譜圖

3.2 聚合物Dex-TMZ納米粒子粒徑的測定

兩親性聚合物在水中由于微相分離，能夠進行自組裝形成納米組裝體[18]。制備的Dex-TMZ聚合物納米粒子的濃度為0.26 mg/mL。通過激光動態光散射可以測定納米組裝體的粒徑及分布(表1，圖3)。圖3表明Dex-TMZ聚合物納米粒子的粒徑大小為152 nm，為正態分布(PDI為0.22)，zeta電位為-10.6 mV，以上結果證明聚合物Dex-TMZ在水溶液中能自組裝形成納米粒子，這種納米粒子中疏水的TMZ藥物分子在里面，親水的葡聚糖在外面，使得TMZ能夠穩定存在。

圖3 Dex-TMZ納米粒子的粒徑分布

表1 Dex-TMZ納米粒子的粒徑、分布及電荷

3.3 臨界聚集濃度(CAC)測定

臨界聚集濃度是聚合物能夠自組裝成納米聚集體時需要達到的最小濃度，是納米組裝體作為藥物載體非常重要的性質。臨界聚集濃度可以通過使用芘及其衍生物作為疏水熒光探針，通過測定其熒光光譜得到。本實驗中，以Dex-TMZ納米粒子的濃度對數(log C)為X軸，熒光強度比值(I373/I384)為Y軸(I373為373 nm處的熒光強度，I384為384 nm處的熒光強度)作圖求得CAC(圖4)。Dex-TMZ納米粒子的CAC為9.45 mg/L。一般來說，納米組裝體的CAC值越小，納米粒子的穩定性越好，因此，制備的Dex-TMZ納米粒子具有非常好的穩定性。

圖4 添加芘的不同濃度Dex-TMZ納米粒子溶液的熒光強度比(I373/I384)

3.4 TMZ的降解

TMZ在生理環境下容易發生降解，通過測定TMZ水溶液的紫外光譜，發現TMZ在328～330 nm具有明顯的紫外吸收峰，發生降解后，TMZ峰的強度逐漸變小。TMZ連接到聚合物葡聚糖側鏈以后形成的Dex-TMZ納米粒子中，TMZ在納米粒子內部，處于疏水環境，能夠降低TMZ的降解程度。圖5是在pH值為7.4的條件下，Dex-TMZ納米粒子溶液在不同時間的紫外光譜。可以看到，溶液在328 nm左右的吸光度值隨著時間延長而逐漸變小，表明Dex-TMZ納米粒子中TMZ發生降解，但與游離TMZ比較，降解速度變慢，半衰期(t1/2)為5.6 h，遠遠高于游離TMZ的t1/2(1.8 h)，證明聚合物前藥Dex-TMZ延長了TMZ的半衰期。

圖5 Dex-TMZ納米粒子的紫外-可見吸收隨時間變化

4 結論

本論文將抗癌藥物替莫唑胺TMZ連接到天然多糖葡聚糖側鏈上，制備了TMZ取代度為41的兩親性聚合物前藥Dex-TMZ，反應步驟簡單，利用其兩親性通過自組裝的方法制備納米粒子，該納米粒子粒徑為152 nm，PDI為0.22，具有比較小的臨界聚集濃度CAC(9.45 mg/L)，聚合物前藥Dex-TMZ能夠增加Z的穩定性，有效延長TMZ的半衰期，可以作為納米藥物載體進一步應用。