艾灸對IBS-D模型大鼠海馬與結腸組織中TNF-α表達的影響

王宇,儲浩然

(1.安徽中醫藥大學研究生院,合肥 230038;2.安徽中醫藥大學第二附屬醫院,合肥 230061;3.安徽省中醫藥科學院針灸臨床研究所,合肥 230038)

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)是一種以腹痛或腹部不適為主,伴有排便習慣改變和(或)大便性狀異常的功能性腸病。腹瀉型腸易激綜合征(diarrhea predominant irritable bowel syndrome,IBS-D)是 IBS最主要的分型,癥狀以腹痛伴有排便次數增多(＞3次/d),大便性狀稀溏,或帶有黏液,甚至水樣便為主,嚴重影響患者生活質量[1]。目前IBS常用的治療方法有解痙劑、止瀉藥、腸道動力調節藥、益生菌、抗抑郁藥等,療效并不滿意[2-5],而針灸對功能性胃腸疾病的防治具有良好的療效,且不良反應少[6]。

IBS發病機制尚未完全明確,其發病機制可能與腸道動力及感覺異常、炎癥與免疫、精神與心理等有關,所有這些發病因素均與腦-腸軸相關,腦腸軸功能失調是IBS-D發病的重要病機[7-8]。炎癥和免疫反應異常參與 IBS-D發病,且與腦-腸軸密切相關[9]。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)作為一種促炎細胞因子,是構成機體免疫系統的重要介質,在IBS-D免疫應答、免疫調節及炎癥反應中均具有十分重要的作用,影響IBS-D內臟高敏感性[10],是IBS-D動物模型的客觀評價指標。TNF-α也是腦-腸互動的一種重要介質,有研究發現TNF-α在IBS-D大鼠的海馬和結腸組織中均異常表達,影響腦-腸軸功能的結構基礎改變,進而導致 IBS-D的發生和發展[9]。目前,腦腸軸是IBS-D研究的熱點[11-13]。近年來,對針灸治療IBS-D調節腦腸軸和降低細胞因子表達的作用機制研究較多,但將細胞因子與腦-腸軸聯系的研究較少。所以艾灸治療 IBS-D是否是通過抑制腦-腸軸中細胞因子的表達需進一步深入探討。本研究擬觀察艾灸對IBS-D大鼠海馬與結腸組織中TNF-α蛋白和mRNA表達的變化,探討艾灸治療 IBS-D是否與抑制腦-腸軸中細胞因子的表達有關,此機制是否是通過腦-腸軸途徑調節腸道黏膜免疫功能。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用健康SD雄性大鼠24只,購于安徽醫科大學,體質量(220±30)g,動物許可證號為 SCXK(皖)2017-001。動物在安徽中醫藥大學實驗動物中心飼養,飼養條件為Ⅱ級,光照周期 12 h/12 h,室溫 22℃～25℃,相對濕度 45%～60%,自由進食、飲水。在整個實驗過程中 SD大鼠的處理方法均遵照中華人民共和國科技部2006年頒布的有關動物的使用及倫理學規定。

1.2 主要儀器和試劑

細艾條(直徑 0.5 cm,南陽宛北艾絨廠),TNF-α的PCR引物(生工生物工程股份有限公司),反轉錄試劑盒(K1622,Thermo Scientific,美國),TNF-α抗體(bs-2081R,北京博奧森生物技術有限公司),通用型二抗試劑盒(PV-6000,北京中杉金橋生物技術有限公司),DAB顯色試劑盒(ZL1-9018,北京中杉金橋生物技術有限公司),熒光定量PCR儀(Thermo Scientific,美國),番瀉葉購自安徽中醫藥大學第二附屬醫院,由安徽中醫藥大學第二附屬醫院中藥制劑室提供制劑。

1.3 造模方法

采用慢性束縛聯合番瀉葉灌胃方法造IBS-D大鼠模型。對模型組和艾灸組大鼠進行番瀉葉灌胃(將番瀉葉置入100℃沸水中浸泡30 min,并經雙層紗布過濾,最后將濾液減壓濃縮成生藥含量為 0.45 g/mL,在﹣4℃冰箱保存備用。劑量為 1 mL/100 g)。灌胃后,用粗制棉繩束縛大鼠雙后肢,以限制大鼠活動,每日 1 h。對空白組大鼠以等體積蒸餾水灌胃,連續14 d[14-15]。以模型組大鼠稀便率升高至少 50%、腹部回縮反射的最小容量閾值降低至少 1 mL,與空白組差異具有統計學意義為造模成功的標準。

1.4 分組與干預

將24只SD大鼠隨機分為空白組、模型組、艾灸組,每組 8只?？瞻捉M不做任何干預,模型組僅造模,不進行其他干預。艾灸組取穴為雙側上巨虛、天樞[16],將大鼠置于特制大鼠艾灸架上,將直徑0.5 cm細艾條固定于艾灸支架上,懸于穴位上約2 cm處,每日1次,每次每穴灸30 min,共7次。

1.5 檢測指標

1.5.1 稀便率

在治療結束后第1天,觀察6 h內各組大鼠的稀便率。稀便率(%)=稀便數/總排便粒數×100%。干稀便的區分以濾紙上有無污跡為準。

1.5.2 球囊擴張反射(CRD)容量閾值

內臟敏感性評估,即非傷害性結直腸球囊擴張反射(CRD)容量閾值測定,是在稀便率檢測結束后,對各組大鼠 CRD誘發刺激下的腹部回縮反射(AWR)進行容量閾值測定。實驗前,各組大鼠禁食不禁水 12 h。輕度麻醉后,將經甘油潤滑后8F的導尿管緩慢插入肛門,將大鼠放于透明塑料盒中。待大鼠完全蘇醒后約20 min,經球囊注入26℃～28℃的生理鹽水,觀察引起大鼠腹部回縮反射的最小容量閾值,重復3次,取3次均值作為直腸擴張引起腹部回縮反射的最小容量閾值[17-18]。

1.5.3 海馬和結腸組織中TNF-α蛋白表達檢測

采用免疫組織化學法檢測海馬和結腸組織中TNF-α蛋白表達。海馬和結腸組織經組織脫水,石蠟包埋,切片。依次過3道二甲苯,每道15 mim。依次過3道100%、95%、80%乙醇,每道5 min,自來水流水緩慢沖洗?？乖邏盒迯?。在組織上滴加 3% H2O2,室溫孵育20 min。PBS沖洗3遍,滴加一抗(1:200),4℃冰箱過夜。PBS沖洗3遍,片子甩干,加二抗,孵育20 min。PBS沖洗 3遍,甩干,加 DAB顯色劑,顯微鏡下控制顯色。顯色完全后,蒸餾水沖洗。蘇木素染色 1 min,水沖洗。1%鹽酸乙醇分化數秒,水沖洗。碳酸鋰藍化1 min,水沖洗。經過脫水、透明、封片后,顯微鏡觀察。通過數字掃描儀掃描整張片子并保存,利用數字掃描的讀片軟件(CaseViewer)進行選片,使用形態學圖像分析系統軟件(JD801)分析,計算其平均光密度值(Average Optical Density,AOD)。

1.5.4 海馬和結腸組織中TNF-α mRNA表達檢測

采用Rt-qPCR檢測海馬和結腸組織中TNF-α mRNA的表達。提取結腸組織中RNA,經RT反應后,最后熒光定量 PCR反應獲得的數據,根據擴增效率和熔解曲線分析,記錄循環閾值(Ct),并經 Relative Quantification Study分析方法和2﹣△△Ct方法計算相對表達量,△△Ct計算公式為△△Ct=(Ct目的基因－Ct內參基因)實驗組－(Ct目的基因－Ct內參基因)對照組。各基因片段擴增引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.6 統計學方法

采用SPSS24.0統計軟件處理,符合正態分布計量資料以均數±標準差表示,實驗數據采用單因素方差分析比較,方差齊時用LSD法,方差不齊時用Tamhane’s法,實驗數據不符合正態分布采用Kruskal-Wallis H秩和檢驗,以P＜0.O5為差異有統計學意義。相關性分析采用Pearson或Spearman相關系數,若兩組均服從正態分布,則使用雙變量相關分析中的Pearson相關分析;若兩組不全部服從正態分布,則使用Spearman相關分析。若P＜0.05,為兩個變量存在相關性,若相關系數為0＜r＜1之間,為呈正相關,在﹣1＜r＜0之間,為呈負相關。

2 結果

2.1 各組腹部回縮反射的最小容量閾值和稀便率比較

與空白組比較,模型組腹部回縮反射的最小容量閾值顯著下降(P＜0.01),稀便率顯著升高(P＜0.01);與模型組比較,艾灸組腹部回縮反射的最小容量閾值均顯著升高(P＜0.01),稀便率均顯著下降(P＜0.01)。詳見圖1。

2.2 各組海馬和結腸組織中TNF-α蛋白表達比較

與空白組比較,模型組大鼠海馬和結腸 TNF-α蛋白表達增高(P＜0.01);與模型組比較,艾灸組大鼠海馬和結腸TNF-α蛋白表達降低(P＜0.01)。詳見圖2-4。

圖1 各組大鼠腹部回縮反射的最小容量閾值和稀便率比較

圖2 各組大鼠結腸組織TNF-α的免疫組化(×200)

圖3 各組大鼠海馬組織TNF-α的免疫組化(×200)

圖4 各組大鼠海馬和結腸TNF-α蛋白表達比較

2.3 海馬和結腸組織中TNF-α蛋白表達相關性分析

根據散點圖初步判斷海馬和結腸組織中 TNF-α蛋白表達間存在線性關系;線性相關性分析表明,空白組、模型組和艾灸組海馬、結腸組織的 TNF-α蛋白表達量呈正相關(0＜r＜1,P＜0.05)。詳見圖5,表2。

圖5 各組大鼠海馬和結腸組織中TNF-α蛋白表達相關性的散點圖

表2 各組大鼠海馬和結腸組織中TNF-α蛋白表達相關性分析 (±s)

表2 各組大鼠海馬和結腸組織中TNF-α蛋白表達相關性分析 (±s)

組別 n 海馬組織 結腸組織 相關系數 P空白組 8 0.100±0.009 0.162±0.008 0.976 0.001模型組 8 0.293±0.011 0.523±0.008 0.881 0.04艾灸組 8 0.178±0.006 0.312±0.007 0.880 0.04

2.4 各組海馬和結腸組織中TNF-α mRNA的表達比較

與空白組比較,模型組海馬和結腸組織中TNF-α mRNA的表達顯著增加(P＜0.01);與模型組比較,艾灸組海馬和結腸組織中 TNF-α mRNA的表達顯著降低(P＜0.01)。詳見圖6。

2.5 海馬和結腸組織中TNF-α mRNA相關性分析

根據散點圖初步判斷海馬和結腸組織中TNF-α mRNA間存在線性關系;線性相關性分析表明,空白組、模型組和艾灸組海馬、結腸組織的TNF-α mRNA表達量呈正相關(0＜r＜1,P＜0.05)。詳見圖7,表3。

圖6 各組大鼠海馬和結腸TNF-α mRNA的表達比較

圖7 各組大鼠海馬和結腸組織中TNF-α mRNA相關性的散點圖

2.6 海馬和結腸組織中TNF-α mRNA與內臟敏感度和稀便率相關性分析

根據散點圖初步判斷海馬和結腸組織中TNF-α mRNA與內臟敏感度和稀便率間存在線性關系;線性相關性分析表明,空白組、模型組和艾灸組海馬、結腸組織的 TNF-α mRNA表達量與內臟敏感度呈負相關(﹣1＜r＜0,P＜0.01),空白組、模型組和艾灸組海馬、結腸組織的 TNF-α mRNA表達量與稀便率呈正相關(0＜r＜1,P＜0.01)。詳見圖8。

表3 各組大鼠海馬和結腸組織中TNF-α mRNA相關性分析 (±s)

表3 各組大鼠海馬和結腸組織中TNF-α mRNA相關性分析 (±s)

組別 n 海馬組織 結腸組織 相關系數 P空白組 8 0.99±0.10 0.98±0.11 0.7950 0.0184模型組 8 6.49±0.85 4.23±0.65 0.9262 0.0009艾灸組 8 2.69±0.26 1.41±0.24 0.8347 0.0099

圖8 大鼠海馬和結腸組織中TNF-α mRNA與內臟敏感度和稀便率相關性的散點圖(24只/組)

3 討論

腸道黏膜低度炎癥等免疫功能失調在IBS-D的致病過程中發揮著重要作用。胃腸道是人體最大的免疫系統,全身近70%的淋巴組織附于腸道黏膜。淋巴系統內含有大量免疫細胞,將外在的病原體與人體內環境隔開,起到黏膜免疫的作用[19]。IBS患者腸腔中的食物抗原、細菌等穿過腸黏膜,激活黏膜下的免疫系統,促進炎癥因子TNF-α釋放,TNF-α作用于腸道神經元和平滑肌細胞,導致腸黏膜化學感受器和機械感受器對各種刺激敏感性增加,參與腸黏膜炎癥級聯反應的發生、發展［10],引起或維持腸道持續低度炎癥反應,從而引發IBS癥狀。有研究顯示,TNF-α等炎癥因子的高表達在IBS-D疾病的發生、發展過程中發揮重要作用,它們通過神經、內分泌等途徑影響腸道動力作用于腸道黏膜層和平滑肌層的神經纖維,從而產生腹痛、腹脹及大便性狀的改變等癥狀[20]。本研究發現空白組、模型組和艾灸組海馬、結腸組織的 TNF-α mRNA表達量與內臟敏感度呈負相關,與稀便率呈正相關,提示 TNF-α的表達增加與腹痛及稀便相關。IBS-D大鼠海馬和結腸組織中TNF-α mRNA表達升高,艾灸治療后,IBS-D大鼠稀便率降低、腹部回縮反射的最小容量閾值升高,海馬和結腸組織中TNF-α mRNA表達降低,提示艾灸能調節免疫反應,有效地減輕IBS-D大鼠腸道低度炎癥。

腦-腸軸是指胃腸道和大腦間相互作用的雙向調節系統,其有機地把胃腸功能和腦功能聯系起來,是維持腸管正常生理功能的基礎,對腸道疾病發生的機制及治療方法的選擇有著重要的指導意義[21-22]。腦-腸軸可通過“腦腸互動”體現,即胃腸道活動的信息傳入到中樞神經系統,并由中樞神經系統對信息進行整合,將調控信息傳送到腸神經系統,或直接作用于胃腸效應細胞[7]。功能磁共振成像(FMRI)顯示 IBS患者存在腦部功能的變化,大腦皮層的活動性與內臟感覺以及癥狀呈現同步改變的現象,且目前 IBS患者中海馬功能的紊亂已經是很多研究達成的共識[23]。

免疫系統活化的標志之一是細胞因子的分泌,結腸中局部產生的細胞因子參與了 IBS腦腸軸的互動,通過傳入神經將炎癥信號傳遞入腦。腦中存在著一個由神經元、小膠質細胞、星形膠質細胞組成的免疫反應網絡,對外周傳入的信號做出反應。外周炎癥因子傳遞至腦內后可引起小膠質細胞的活化,進一步分泌促炎性細胞因子[24]。Zhang G等[25]研究發現,CRD可增加海馬小膠質細胞對外周疼痛傳入信號的敏感性,促使已致敏的小膠質細胞釋放炎性細胞因子,作用于周圍的神經元細胞產生神經痛,加重內臟高敏感性的發生。本研究發現,IBS-D大鼠海馬和結腸組織中TNF-α mRNA表達明顯升高,且呈正相關。艾灸治療后,IBS-D大鼠海馬和結腸組織中TNF-α mRNA表達水平明顯降低,呈正相關,提示艾灸治療 IBS-D可能與降低腦-腸軸中細胞因子TNF-α有關。

艾灸具有溫陽通脈、活血化瘀、舒經活絡之功效。天樞穴乃大腸募穴,在調理中焦、調暢氣機等方面十分有效。上巨虛為大腸下合穴,《外臺秘要》:“巨虛上廉,足陽明與大腸合,在三里下三寸,灸三壯,主飧泄大腸痛?！惫拾纳暇尢撗軌蛘{理氣血、疏通經絡,治療胃腸疾病,且能提高痛閾,抑制中樞神經和外周神經的痛覺傳導,有明顯的鎮痛作用[26]。合募配穴治療腑病,升清降濁,止瀉止痛。此為艾灸對IBS-D腦-腸軸過程的干預作用提供了理論依據。所以艾灸治療 IBS-D與降低腦-腸軸中細胞因子TNF-α mRNA有關。

綜上,艾灸天樞、上巨虛改善IBS-D大鼠腹瀉癥狀和內臟高敏感性,可能與艾灸抑制海馬和結腸組織中細胞因子 TNF-α的表達,調節腸道黏膜免疫功能有關,此機制可能是通過腦-腸軸實現,但具體作用機制尚未明確,還需進一步研究。