丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)大鼠腸缺血再灌注肺損傷的作用及機(jī)制研究

王敏，王俊帥，占大錢，鄭鵬，劉旭東，明曉青，周代星，馮俊

腸缺血再灌注(intestinal ischemia/reperfusion,II/R)常見(jiàn)于腸道手術(shù)、嚴(yán)重失血性休克、嚴(yán)重多發(fā)傷等危重患者。II/R破壞腸黏膜屏障，導(dǎo)致腸內(nèi)細(xì)菌及內(nèi)毒素等有害物質(zhì)迅速移位，介導(dǎo)多種炎性細(xì)胞因子及炎性介質(zhì)的釋放，誘導(dǎo)全身炎性反應(yīng)綜合征(SIRS)進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體器官功能障礙[1]。其中，急性肺損傷(ALI)是常見(jiàn)的II/R所致的靶器官損傷[2]。目前臨床上對(duì)II/R所致急性肺損傷的治療手段有限，因此，研究有效的藥物對(duì)該病的治療極為重要。丹參酮ⅡA作為傳統(tǒng)中藥丹參酮的主要成分，其藥理功效多樣，具有抗炎、抗腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗心肌肥厚、改善臟器纖維化等作用[3-4]。研究表明，丹參酮ⅡA在多種肺損傷模型中如膿毒癥肺損傷、重癥胰腺炎肺損傷、爆震傷肺損傷中均有明確的肺保護(hù)作用[5-7]。但丹參酮ⅡA在II/R所致肺損傷中的作用目前尚無(wú)報(bào)道。因此，本研究從II/R所致急性肺損傷著手，觀察丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)II/R所致急性肺損傷的療效，并研究其作用機(jī)制，以期為臨床治療II/R所致急性肺損傷提供一種新的備選藥物，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1) 動(dòng)物：30只SD 雄性大鼠，體質(zhì)量180～220 g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，飼養(yǎng)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)溫度22℃、濕度55%，各組大鼠術(shù)前禁食不禁水。本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合動(dòng)物倫理委員會(huì)的要求。(2) 藥品與試劑：丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液(上海第一生化藥業(yè)有限公司)；大鼠IL-6、TNF-α ELISA試劑盒(武漢博士德有限公司)，大鼠IL-1β ELISA試劑盒(武漢艾美捷科技有限公司)；NF-κB p65及磷酸化NF-κB p65(pSer536)抗體 (Abcam公司，USA)，GAPDH、TLR4抗體(Cell Signaling Technology，USA)；細(xì)胞總蛋白提取試劑盒(武漢艾美捷科技有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(碧云天公司)。(3)儀器設(shè)備：動(dòng)物血?dú)夥治鰞x(Premier3000型，美國(guó)GEM公司生產(chǎn))；顯微鏡(Olympus IX71 型，日本 OLYMPUS 生產(chǎn)); 電泳儀(EPS-300型，上海天能科技有限公司生產(chǎn))；離心機(jī)(Avanti J-15R型，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司生產(chǎn))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)于2019年1—12月在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院進(jìn)行。(1)模型制備：30只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)+NS組(Sham組)，腸缺血再灌注+NS組(II/R 組)，腸缺血再灌注+丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液組(Tanshinone ⅡA組)，每組10只。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3.5 ml/kg)麻醉后固定，Sham組大鼠僅打開(kāi)腹腔，不行腸缺血再灌注手術(shù)處理，另外2組打開(kāi)腹腔并鈍性分離腸系膜上動(dòng)脈，通過(guò)手術(shù)夾閉SD大鼠腸系膜上動(dòng)脈90 min，再予以灌注6 h的方法構(gòu)建大鼠腸缺血再灌注肺損傷模型。Tanshinone ⅡA組大鼠在手術(shù)前2 h通過(guò)尾靜脈注射丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液(20 mg/kg), II/R組大鼠及Sham組大鼠分別于手術(shù)前2 h通過(guò)尾靜脈注射等量的生理鹽水。(2)標(biāo)本收集與保存：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠，充分暴露氣管和肺組織，用16G靜脈留置針進(jìn)行氣管插管，結(jié)扎右側(cè)主支氣管，用1.0 ml PBS行單側(cè)肺泡灌洗1 min ,抽取灌洗液0.7～0.8 ml，反復(fù)3次，收集肺泡灌洗液以3 000×g離心15 min,回收上清于-80℃冰箱保存。取右肺上葉，經(jīng)4%多聚甲醛充分固定后用于制作病理切片。取右肺中葉用于濕/干(W/D)比值檢測(cè)，取右肺下葉立刻放入液氮罐冷凍后-80℃冰箱保存進(jìn)行Western-blot檢測(cè)。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 肺組織病理改變的評(píng)定： 取大鼠右肺上葉肺組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h后常規(guī)石蠟包埋、脫蠟后行HE染色，染色后的切片經(jīng)脫水、透明、封片后采用顯微鏡進(jìn)行拍照，通過(guò)對(duì)圖片進(jìn)行評(píng)分觀察其病理狀態(tài)的改變。參照孟志鵬等[8]使用的方法從中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡間隔增寬、肺泡腔內(nèi)出血及滲出四個(gè)方面進(jìn)行大鼠肺組織急性肺損傷評(píng)分。

1.3.2 肺動(dòng)脈氧分壓(PaO2)的測(cè)定及肺組織W/D比值測(cè)定：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取血，各組大鼠左心室取血1 ml，全自動(dòng)血?dú)夥治鰞x測(cè)定各組大鼠PaO2；取大鼠右肺中葉，吸水紙充分擦吸完表面水分后稱其濕重，之后置于60℃恒溫烤箱中連續(xù)烘烤24 h后再稱干重，計(jì)算W/D比值。

1.3.3 肺泡灌洗液(BALF)蛋白、炎性細(xì)胞因子檢測(cè)：將存于-80℃冰箱中的肺泡灌洗液室溫解凍后，按照BCA試劑盒的操作步驟檢測(cè)BALF蛋白濃度，依據(jù)檢測(cè)說(shuō)明書按步驟采用ELISA法檢測(cè)BALF中IL-6、 TNF-α及 IL-1β的濃度。

1.3.4 肺組織TLR4、pNF-κB p65蛋白表達(dá)的測(cè)定：將存于-80℃冰箱中的肺組織取出解凍，充分研磨制成勻漿后冰上裂解30 min，之后離心15 min獲取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度。制作10%凝膠后，蛋白上樣每孔30 μg，電泳后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h ,加入TLR4一抗(1∶1 000 稀釋)、GAPDH一抗(1∶1 000稀釋)、NF-κB p65和磷酸化NF-κB p65(pSer536)一抗(1∶1 000稀釋),4℃孵育過(guò)夜，用TBST洗滌3次，10 min/次，加入羊抗兔二抗(稀釋度1∶2 000)，室溫孵育1 h，ECL顯影液顯色后曝光成像，采用Image-pro Plus 5.1圖像分析軟件測(cè)定光密度值，以磷酸化NF-κB p65(pSer536)與NF-κB p65的比值反映NF-κB p65磷酸化水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肺組織病理學(xué)變化 成功構(gòu)建大鼠腸缺血再灌注肺損傷模型，HE染色示：Sham組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整，無(wú)明顯病理改變；II/R組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，肺間質(zhì)水腫、肺泡壁增厚明顯，較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；Tanshinone ⅡA組大鼠肺泡增厚及間質(zhì)水腫程度明顯減輕，僅有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖1。

2.2 各組大鼠急性肺損傷評(píng)分、PaO2比較 各組大鼠急性肺損傷評(píng)分：與Sham 組比較，II/R組大鼠急性肺損傷評(píng)分明顯升高；與II/R組比較，Tanshinone ⅡA組大鼠急性肺損傷評(píng)分明顯降低 (P均<0.01)。各組大鼠PaO2比較:與Sham組比較，II/R組大鼠PaO2明顯減低；與II/R組比較，Tanshinone ⅡA組大鼠PaO2明顯升高(P均<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠急性肺損傷評(píng)分、PaO2比較

2.3 各組大鼠肺組織W/D、BALF蛋白濃度比較 與Sham 組比較，II/R組肺組織W/D、BALF蛋白濃度明顯升高；與II/R組比較，Tanshinone ⅡA組肺組織W/D、BALF蛋白濃度明顯降低(P均<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠肺組織W/D、BALF蛋白濃度比較

2.4 各組大鼠BALF中炎性細(xì)胞因子的變化比較 與Sham 組比較，II/R組大鼠BALF中炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6及TNF-α水平明顯升高；與II/R組比較，Tanshinone ⅡA組上述指標(biāo)均明顯降低(P均<0.01)，見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠BALF炎性細(xì)胞因子水平比較

2.5 各組大鼠肺組織TLR4、pNF-κB p65蛋白的表達(dá)比較 與Sham 組比較，II/R組肺組織TLR4、pNF-κB p65蛋白的表達(dá)水平明顯升高；與II/R組比較， Tanshinone ⅡA組肺組織TLR4、pNF-κB p65蛋白的表達(dá)水平明顯降低(P均<0.01)，見(jiàn)表4。

圖1 各組大鼠肺組織病理變化比較(HE染色，×200)

表4 各組大鼠肺組織TLR4、pNF-κB p65蛋白表達(dá)比較

3 討 論

腸缺血再灌注可引起腸道局部的一系列病理生理改變，如氧自由基的產(chǎn)生、細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、炎性細(xì)胞聚集、內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、凋亡及壞死等，導(dǎo)致腸黏膜屏障破壞及腸道內(nèi)毒素和細(xì)菌等有害物質(zhì)進(jìn)入體循環(huán)，進(jìn)而激活單核/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，介導(dǎo)炎性介質(zhì)及細(xì)胞因子的大量釋放，從而誘導(dǎo)全身炎性反應(yīng)綜合征，導(dǎo)致多器官功能損傷[9-10]。其中，急性肺損傷是常見(jiàn)的II/R所致的靶器官損傷，其發(fā)病率高、病死率高[11]。

丹參酮ⅡA是傳統(tǒng)中藥丹參主要成分，丹參酮ⅡA磺酸鈉是丹參酮ⅡA的水溶性衍生物，其功效多樣[12]。本研究結(jié)果顯示，丹參酮ⅡA磺酸鈉處理后II/R 大鼠肺組織急性肺損傷評(píng)分降低、動(dòng)脈血PaO2水平增加，提示丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)II/R 大鼠急性肺損傷具有明顯保護(hù)作用。多項(xiàng)研究表明，急性肺損傷時(shí)，肺血管內(nèi)皮屏障破壞，肺血管通透性增加，肺泡內(nèi)蛋白濃度升高，炎性介質(zhì)及炎性細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6、IL-1β大量釋放[13-16]。本研究結(jié)果表明，丹參酮ⅡA磺酸鈉處理后II/R 大鼠W/D 比值降低、肺泡灌洗液中的蛋白濃度降低，提示丹參酮ⅡA磺酸鈉能夠顯著降低II/R大鼠肺血管通透性。此外，本研究結(jié)果表明,丹參酮ⅡA磺酸鈉處理后II/R大鼠肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞因子 TNF-α、IL-6、IL-1β的表達(dá)水平顯著降低。上述結(jié)果表明, 丹參酮ⅡA磺酸鈉可通過(guò)減輕II/R大鼠肺血管通透性、減輕炎性細(xì)胞因子的表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用, 對(duì)II/R所致肺損傷起到保護(hù)作用。

Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)屬于模式識(shí)別受體，TLR4是其中重要的一員，多項(xiàng)研究表明，在包括腸缺血再灌注肺損傷在內(nèi)的各種肺損傷模型中，TLR4發(fā)揮著重要的作用。TLR4能識(shí)別細(xì)菌來(lái)源的LPS及透明質(zhì)酸、熱休克蛋白、硫酸乙酰肝素等內(nèi)源性配體，進(jìn)而激活下游的信號(hào)通路，發(fā)揮抗炎性反應(yīng)、抗氧化作用[17-19]。其中NF-κB是其下游最重要的信號(hào)通路之一，在炎性反應(yīng)中起到關(guān)鍵作用。 NF-κB由多肽鏈 p65 和 p50 蛋白亞基構(gòu)成，生理靜息狀態(tài)下，NF-κB的 p65 亞基與 IκB 蛋白結(jié)合，使 NF-κB 位于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到各種內(nèi)、外界因素刺激時(shí)，IκB 磷酸化后被降解，NF-κB p65亞基磷酸化后得以激活并進(jìn)入細(xì)胞核，介導(dǎo)多種炎性細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，進(jìn)而激活并放大炎性反應(yīng)[20-24]。多項(xiàng)研究表明，TLR4/NF-κB 的活化在多種肺損傷的動(dòng)物模型中發(fā)揮明顯作用[25-29]。本研究結(jié)果表明,經(jīng)丹參酮ⅡA磺酸鈉處理后，II/R組大鼠肺組織TLR4、pNF-κB p65表達(dá)明顯降低，提示丹參酮ⅡA磺酸鈉能夠抑制II/R大鼠肺組織TLR4/NF-κB的活化。丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)II/R 所致肺損傷的保護(hù)作用可能與其抑制TLR4/NF-κB的活化、減輕肺部炎性反應(yīng)有關(guān)。

綜上所述，丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)II/R 所致肺損傷具有明顯的保護(hù)作用，其保護(hù)作用可能與抑制TLR4/NF-κB 的活化進(jìn)而抑制肺部炎性反應(yīng)有關(guān)，丹參酮ⅡA磺酸鈉是潛在的治療II/R 所致肺損傷的候選藥物。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

王敏: 設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過(guò)程及論文撰寫；王俊帥、占大錢:提出研究思路，分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)；鄭鵬、劉旭東、明曉青：實(shí)施研究過(guò)程，資料收集整理；周代星、馮俊：實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，論文修改及論文審核