生育三烯酚通過激活Wnt/β-catenin信號減少激素誘導骨質疏松大鼠骨量流失

陳光華 黃貴芝 林瀚 吳新誘 譚小艷 陳周韜

廣東醫科大學附屬醫院，廣東 湛江 524001

骨質疏松是一種以骨量減少、骨微結構受損、骨脆性增加、骨折風險增加為特征的代謝性骨病。據估計，在全世界老年婦女中，與骨質疏松有關的骨折發病率約為40%，在男子中約為13%[1]。糖皮質激素由于其抗炎和免疫抑制作用，在臨床上得到了廣泛的應用。激素治療期間骨保護素與核因子受體激活劑κB配體比值的變化導致前3～6個月骨吸收增加，出現骨質疏松的不良反應，骨折風險也明顯增加[2]。糖皮質激素引起的骨質疏松(glucocorticoid induced osteoporosis，GIOP)在繼發性骨質疏松中居首位。有一些證據顯示氧化應激與絕經后骨密度喪失之間的相關性；絕經期雌激素缺乏會增加氧化應激和骨質流失[3]。生育三烯酚 (tocotrienols，TTS)是維生素E的一個亞組，具有4種異構體α、β、γ和δ，在過去的10年中，由于其強大的抗氧化和抗炎特性[4]，在包括骨質疏松癥在內的慢性病的治療上獲得了極大的關注[5]。有研究表明抗氧化劑對降低大鼠氧化應激和血管細胞黏附分子-1的生成，進一步研究發現抗氧化劑的抗氧化能力可以有效降低氧化應激[6]。由于氧化應激在OP中發揮重要作用，抗氧化劑具有抗氧化作用，然而，其對GIOP的研究目前有限。因此，本研究旨在探討生育三烯酚對GIOP誘導的骨質疏松大鼠的影響并探索可能的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和試劑

12周齡雌性SD大鼠30只，體質量(230±15) g，購自上海實驗動物中心。生育三烯酚(維克奇；批號： 20190021)。抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)、Ⅰ型膠原交聯羧基末端肽(CTX-I)、堿性磷酸酶(ALP)檢測試劑盒和骨鈣素(OC)酶聯免疫吸附分析(ELISA)試劑盒購自中國上海源業生物技術有限公司。

1.2 實驗分組和治療

動物分組造模，自適應喂養雄性SD大鼠1周。將大鼠隨機分為3組，每組10只：對照組(CON組)，肌肉注射生理鹽水0.1 mL；地塞米松組(DEX組)10只，肌肉注射地塞米松溶液0.1 mL，1 mg/kg(每周2次)；連續干預3個月建立GIOP大鼠模型[7]。地塞米松+生育三烯酚組(DEX+TTS組)10例，給予地塞米松溶液0.1 mL，每周2次；同時給予2 mg生育三烯酚灌胃，而其他組給予相同劑量的生理鹽水灌胃治療，直至實驗結束。處死前集外周血清和雙側股骨。雙側股骨用生理鹽水紗布包裹，置于-20 ℃的冰箱中。

1.3 檢測指標

將左側股骨在室溫下解凍并固定在樣品架中，使用SCANCOuCT80進行微計算機斷層掃描(micro computed tomography，Micro-CT)掃描。該掃描儀的電壓為50 kvp，電流為200μA，分辨率為15 μm/像素。骨微結構參數包括骨密度(BMD)、組織骨密度(TMD)、骨小梁數目(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨體積/總體積(BV/TV)、相對骨表面(BS/TV)、骨小梁分離度(TBsp)和連接密度(Conn.D)，通過使用內置軟件進行定量分析來確定連接密度(connection density，Conn.D)。

待影像學檢測完畢后，進行三點彎曲實驗。在進行測試時，股骨水平放置在機器的表面上，探頭慢慢地放下。加載方向垂直于實驗臺，作用在骨的中心軸上，加載速度為2 mm/min。通過與試驗機連接的計算機專用軟件自動記錄載荷-位移曲線，得到最大載荷和彈性模量。

將股骨均勻液氮中冷凍并在RIPA緩沖液裂解，然后等份裝載(20 mg蛋白質)，使用SDS-PAGE(4%堆積，12%流動凝膠在120 V時90～110 min)分離蛋白質。將蛋白質在100 V下轉移至0.2 mm的聚偏二氟乙烯膜(目錄號162e0177，Bio-Rad實驗室，赫拉克勒斯，加利福尼亞)上60 min。使用了以下一抗： BMP-2(1∶2000，Cell Signalling)，b-catenin(1∶750，Santa Cruz BT)，OPG(1∶500，Santa Cruz BT)和RANKL(1∶500，Santa Cruz BT)，然后進行適當處理二抗。化學發光HRP底物檢測抗原抗體復合物，并使用LI-COR C-Digit印跡掃描儀進行可視化，并使用相關的Image Studio 5.2軟件(LI-COR Biosciences，NE，美國)進行光密度分析。Ponceau S(Biorad)用于控制總蛋白含量，β-actin作內部對照。

隨后使用試劑盒檢測大鼠血清TRACP、CTX-I、ALP和OC水平，并嚴格按照生產廠家在試劑盒上的說明進行操作。ELISA試劑盒檢測血清TRACP、CTX-I、ALP和OC水平。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 大鼠體重

實驗期間未發現大鼠死亡；治療12周后，大鼠的體重發生變化，DEX組大鼠體重[(436.11±7.87) g]明顯低于CON組[(356.44±8.98) g](P<0.05)；而DEX+TTS組[(371.29±8.66) g]與DEX組相比，體重無顯著差異(P>0.05)。

2.2 Micro-CT分析結果

股骨的二維矢狀位圖像見圖1，股骨的微觀參數見表1。DEX組左側股骨BMD、TMD、Conn.D、Tb.N、Tb.Th、Tb.p、BS/TV較對照組明顯降低(P<0.05)。DEX+TTS組左側股骨BMD、Conn.D、Tb.Th均明顯高于DEX組(P<0.05)，DEX+TTS組左側股骨BMD、Conn.D、Tb.Th明顯高于DEX組(P<0.05)。

圖1 各組大鼠治療12周后左股骨的Micro-CT二維矢狀位圖 A：CON組，B：DEX組，C：DEX +TTS組Fig.1 Two-dimensional sagittal images of the left femur in micro-CT after 12 weeks of treatment in each group of rats. A: Con group, B: DEX group, C: DEX+TTS group.

表1 各組大鼠左股骨的Micro-CT檢測結果Table 1 Micro-CT results of the left femur of rats in each group

2.3 股骨的生物力學變化

股骨三點彎曲試驗表明，DEX+TTS組的最大載荷和彈性模量均高于DEX組，兩組間差異有統計學意義(P<0.05)(表2)，DEX+TTS組的最大載荷和彈性模量均高于DEX組(P<0.05)。

表2 各組大鼠右股骨的三點彎曲試驗結果

2.4 血清ALP、OC、TRACP和CTX-I的變化

與CON組比較，DEX組血清骨形成指標(ALP、OC)顯著降低(P<0.05)，骨吸收指標TRACP、CTX-I顯著升高(P<0.05)。與DEX組比較，DEX+TTS組血清骨形成指標ALP和OC顯著升高(P<0.05)，骨吸收指標TRACP和CTX-I顯著降低(P<0.05)。DEX+TTS組血清ALP和OC顯著高于DEX組(P<0.05)，而骨吸收指標TRACP和CTX-I則顯著低于DEX組(P<0.05)，詳見表3。

表3 各組大鼠的ALP、CTX-1、OC和ACP結果Table 3 Results of ALP, CTX-I, OC, and ACP of rats in each group

2.5 WB檢測結果

股骨BMP-2、OPG和RANKL的表達如圖2所示，和CON比較，DEX組大鼠的BMP-2和OPG顯著降低，而RANKL表達明顯增加；經過TTS干預后，DEX+TTS組大鼠BMP-2和OPG顯著增加，而RANKL表達明顯降低，比較差異有統計學意義(P<0.05)。

圖2 蛋白質印跡定量檢測BMP-2、OPG和RANKL蛋白的表達Fig.2 The protein expressions of BMP-2, OPG, and RANKL with quantitative Western blotting.注：與CON組比較，*P<0.05；與DEX組比較，#P<0.05。

3 討論

骨質疏松癥是一種發病率較高的骨代謝性疾病。GIOP在繼發性骨質疏松中首位。研究表明，糖皮質激素治療開始3個月內，脊椎骨折的風險顯著增加，12個月時達到高峰。在連續接受GCS治療的患者中，骨折風險與每日口服GCS劑量密切相關[8]。因此，骨質疏松癥越來越受到研究者的關注。

越來越多的證據表明，過多的氧化應激對骨代謝(骨形成<骨吸收)[9]、微結構退變和骨丟失有不利影響，顯著增加了骨脆性和骨折易感性[10]。一半的絕經后婦女將經歷骨質疏松癥導致的骨折[10]。根據世界衛生組織，估計在美國大約有2 200萬婦女出現低骨量(稱為骨量減少癥)和800萬婦女有嚴重的骨質丟失(稱為骨質疏松癥)[11]。盡管抗骨質疏松癥療法(例如激素療法、雙膦酸鹽、甲狀旁腺激素)的使用已經被廣泛接受，它們在長期使用后的遺傳副作用引起了一些關注[11]。因此，尋找替代的天然化合物來緩解絕經后婦女骨惡化和骨丟失的進展已成為一個高度公共衛生優先事項。研究表明，TTS保護成骨細胞免受脂質過氧化和抑制破骨細胞分化，破骨細胞成熟和骨吸收活性通過抑制核因子κB(NF-kB)和細胞外信號調節激酶的激活[12]。這些結果表明TTS可能在抗骨質疏松癥領域有著獨特的影響。

本研究中使用GCs制備骨質疏松模型，而GCs對大鼠骨量的影響依賴于大鼠的年齡[13]和GC給藥的劑量方案[14]。本研究發現DEX組大鼠的體重顯著低于CON組。本研究結果與先前研究[14-15]的結果類似，已知用地塞米松治療成年雌性大鼠(大約3個月)可在治療期間誘導體重和食物攝入顯著減少。在本研究中，使用Micro-CT發現DEX組大鼠股骨的骨密度顯著下降，表明建模是成功的。用TTS治療GIOP大鼠后，BV/TV、Tb.N、Tb.Th和Conn.D與DEX組相比呈增加趨勢，表明骨小梁的微觀結構得到改善。骨生物力學中的骨結構力學指標測試是了解骨質疏松性骨折風險的最直接方法，它也是骨強度、骨骼結構和骨量的綜合表現。然而，觀察骨組織形態學和單獨測量骨密度不能完全反映骨質量。使用機械性質的干預效果的評估是治療骨質疏松癥的其他方法不可替代的。在本研究中，三點彎曲試驗表明，DEX組的最大載荷和彈性模量顯著低于對照組，TTS治療可顯著提高大鼠骨組織的抗折強度。這些發現與先前研究的結果相似，即缺乏GLP-1受體的大鼠的骨生物力學指標顯著下降[16]。血清CTX-I是骨骼中I型膠原的降解產物，檢測血清CTX-I含量可以特異性地反映破骨細胞的吸收活性。TRACP主要由破骨細胞釋放的非膠原蛋白產生，破骨細胞與膠原代謝物一起分泌在細胞外。因此，TRACP和CTX-1水平與骨吸收呈正相關。成骨細胞可以分泌骨特異性ALP，ALP是總ALP的重要組成部分，可以反映骨形成的狀態。OC是骨基質中最豐富的標志物，其由成骨細胞釋放到細胞外，反映骨形成的狀態。此外，骨形成標志物包括OC、ALP和膠原蛋白1的表達也顯著增加。本研究的結果表明TTS可增加成骨細胞活性來促進GIOP大鼠的骨形成來保護骨組織。

經典的Wnt/β-catenin信號傳導途徑是眾所周知的合成代謝級聯反應，可促進成骨細胞的增殖，成骨細胞的分化以及成骨細胞產生骨保護素(OPG)的作用[17]。OPG是核因子κB配體(RANKL)受體激活劑的誘餌受體，RANKL是破骨細胞生成的關鍵激活劑[17]。因此，激活經典的Wnt/β-catenin信號傳導途徑可導致骨骼中OPG/RANKL比率增加，并使平衡朝成骨細胞生成傾斜，最終轉移骨骼更新，有利于骨骼形成而不是骨骼吸收[17]。本研究通過WB檢測骨組織BMP-2、OPG和RANKL的表達，結果發現TTS治療后的大鼠骨組織BMP-2和OPG表達顯著增加，而RANKL的表達顯著降低，這表明TTS治療后可以激活Wnt/β-catenin信號來促進成骨；OC、ALP和膠原蛋白1水平顯著增加更好地體現這點。

本研究有其局限性，首先本研究TTS劑量比較單一，需要考慮劑量對結果的影響；其次，本研究使用的激素誘導的骨質疏松模型，是否適合其他因素誘導的骨質疏松癥模型就不得而知；最后就是研究設計的時間較短，大鼠數量也較少。

總之，TTS可以通過減少骨吸收和促進骨形成及激活Wnt/β-catenin信號來改善骨密度、骨微觀結構和骨強度以及治療GIOP。