組蛋白去乙酰化酶抑制劑對核移植胚胎體外發(fā)育效果影響的研究進(jìn)展

呂玲燕 吳永紹 張家慶 孫如玉 汪燕玲 潘天彪 陳寶劍 謝炳坤

摘要：組蛋白去乙酰化酶抑制劑（HDACi）是一類化合物，通過干擾組蛋白去乙酰化酶來控制DNA纏繞于組蛋白的松緊程度從而發(fā)揮作用，它可以通過增加細(xì)胞內(nèi)組蛋白的乙酰化程度提高乙酰化相關(guān)基因的表達(dá)水平。近年來，關(guān)于HDACi促進(jìn)供體細(xì)胞及核移植重構(gòu)胚的表觀遺傳重編程以及調(diào)控高等動物機(jī)體基因的表達(dá)等相關(guān)研究備受關(guān)注。主要闡述了HDACi對核移植胚胎體外發(fā)育效果的影響，旨在為提高克隆胚胎的生產(chǎn)效率提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：組蛋白去乙酰化酶抑制劑;核移植;胚胎;發(fā)育效果

中圖分類號：Q132.4? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）18-0005-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.18.001

Research progress on the effects of histone deacetylase inhibitors on in vitro

developmental competence of nuclear transfer embryos

LYU Ling-yan1， WU Yong-shao1， ZHANG Jia-qing2， SUN Ru-yu1，WANG Yan-ling1，

PAN Tian-biao1， CHEN Bao-jian1， XIE Bing-kun1

（1. Guangxi Key Laboratory of Livestock Genetic Improvement/Guangxi Institute of Animal Sciences， Nanning? 530001，China;

2. Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science， Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou? 450002， China）

Abstract： Histone deacetylase inhibitor （HDACi） is a class of compounds that can interfere with histone deacetylase to control the tightness of DNA binding to histones and play a role， which can increase the degree of histones acetylation in cells and improve the expression level of acetylated genes. In recent years， the researches on HDACi promoting epigenetic reprogramming of donor cells and nucleartransfer embryos and regulating the genes expression in higher animals have attracted much attention. The effects of HDACi on the in vitro developmental competence of nuclear transfer embryos are mainly described， in order to provide reference for improving the production efficiency of cloned embryos.

Key words： histone deacetylase inhibitors; nuclear？transfer; embryos; developmental competence

體細(xì)胞核移植（SCNT）對于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物[1]和保護(hù)種質(zhì)資源[2]是一種普通但非常重要的技術(shù)手段。因此，使用體細(xì)胞核移植技術(shù)進(jìn)行動物克隆被認(rèn)為是一項尖端的革命性技術(shù)。盡管一些哺乳動物物種已經(jīng)被成功克隆[3]，但克隆動物生產(chǎn)效率仍然較低，其中的一個根本問題就是在核移植胚胎發(fā)育過程中，胚胎染色體進(jìn)行錯誤的或者不完全表觀遺傳重編程[4]，從而使發(fā)育過程中具有重要作用的基因發(fā)生異常表達(dá)。表觀遺傳修飾如DNA甲基化和組蛋白乙酰化等已被證實能調(diào)控高等動物機(jī)體基因的表達(dá)[5]。組蛋白乙酰化是哺乳動物胚胎發(fā)育和后天生長中研究最多也是最具代表性的表觀遺傳修飾之一，是相對穩(wěn)定的修飾機(jī)制。在供體細(xì)胞和核移植胚胎中組蛋白高乙酰化水平可以進(jìn)一步提高其發(fā)育能力[6，7]。因此，科學(xué)家們使用了多種與表觀遺傳修飾相關(guān)的組蛋白酶抑制劑（HDACi）去改善核移植胚胎發(fā)育過程中的組蛋白乙酰化水平，從而提高克隆胚胎體外發(fā)育能力[8-11]。Cao等[12]研究表明，使用HDACi處理核移植供體細(xì)胞，使其G0/G1期比例提高，有利于核移植胚胎體外發(fā)育，并且能使H4K12、H3K9乙酰化水平提高。Sun等[13]研究表明，使用HDACi處理克隆重構(gòu)胚胎，可提高H4K8乙酰化表達(dá)水平，并且促進(jìn)克隆胚胎體外發(fā)育。Li等[14]研究表明，使用HDACi處理核移植供體細(xì)胞，能夠提高多能性基因的表達(dá)，并且可影響組蛋白甲基化H3K4me3、H3K9me2位點的表達(dá)，從而促進(jìn)克隆胚胎發(fā)育。本研究主要針對HDACi對SCNT胚胎體外發(fā)育效果的影響進(jìn)行綜述，為提高體細(xì)胞克隆胚胎生產(chǎn)效率提供參考依據(jù)。

1 HDACi的作用及分類

HDACi通過控制DNA纏繞于組蛋白的松緊程度來發(fā)揮作用，可以通過增加細(xì)胞內(nèi)組蛋白的乙酰化程度、提高p21等基因的表達(dá)水平等途徑，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡。HDACi按其結(jié)構(gòu)不同，可分為四類：第一類為脂肪酸，如丁酸鹽、丁酸苯酯和丙戊酸，其中丙戊酸被用作抗癲癇藥物;第二類為氧肟酸鹽，如TSA是被發(fā)現(xiàn)的第一個能抑制HDACs的天然氧肟酸; 第三類為環(huán)肽，如天然產(chǎn)物縮酚酸肽FK-228和環(huán)氧肟酸;第四類為苯酰胺類，如MS-275、MGCD0103;有些HDACi如TSA、SAHA屬非選擇性，可同時抑制Ⅰ類及Ⅱ類 HDACs;有些 HDACi屬于選擇性的，如 MS-275對Ⅰ類HDACs的抑制作用強(qiáng)于Ⅲ類HDACs，而對HDAC6、 HDAC8幾乎沒有影響。在SCNT上應(yīng)用最多的HDACi主要為TSA、VPA、Scriptaid以及SAHA。

2 HDACi對體細(xì)胞的影響

供體細(xì)胞的細(xì)胞周期對體細(xì)胞克隆的成敗至關(guān)重要。王張凡[15]研究表明，用0.1 μmol/L FK228單獨處理供體細(xì)胞24 h，供體細(xì)胞形態(tài)變化不明顯，存活數(shù)最多，且細(xì)胞染色體數(shù)目正常率無顯著變化，也有助于促進(jìn)豬體細(xì)胞克隆胚胎體外發(fā)育。道日諾[16]研究表明，用低于0.40 μmol/L的TSA處理牛胎兒成纖維細(xì)胞，不影響其形態(tài)，而以高于0.40 μmol/L的TSA處理牛胎兒成纖維細(xì)胞時，隨TSA濃度增大、處理時間延長，脫壁的死細(xì)胞數(shù)目逐漸增加;低于0.80 μmol/L的TSA處理牛胎兒成纖維細(xì)胞24、48、72 h后，均使G0/G1期細(xì)胞比例顯著增高，S期和G2/M期細(xì)胞比例顯著降低，G0/G1期細(xì)胞比例增高，有利于供體細(xì)胞在核移植時進(jìn)行重編程。阮秋燕等[17]研究表明，0、250、500、750 nmol/L? 4組濃度Scriptaid處理水牛胎兒成纖維細(xì)胞（BFF），其對BFF細(xì)胞形態(tài)和存活率影響不大，且能顯著提高BFF的acH4K18組蛋白乙酰化水平，有利于供體細(xì)胞進(jìn)行核移植。高川等[18]研究表明，用適宜濃度的Scriptaid處理牦牛胎兒成纖維細(xì)胞24 h后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了改變，細(xì)胞增殖受到明顯抑制，大量細(xì)胞被阻滯在G0/G1期，隨著Scriptaid處理濃度的增加，細(xì)胞組蛋白H3K9ac乙酰化水平逐漸提高，其研究初步證實，Scriptaid是通過提高成纖維細(xì)胞的乙酰化水平來促進(jìn)核的重編程。肖剛峰等[19]研究表明，用組蛋白去乙酰化酶抑制劑SAHA處理小鼠T淋巴瘤細(xì)胞EL4，能夠恢復(fù)或提高小鼠T淋巴瘤細(xì)胞EL4中miR-150表達(dá)并抑制T淋巴瘤細(xì)胞EL4細(xì)胞增殖。魏麗曉等[20]研究表明，采用不同濃度SAHA處理山羊胎兒成纖維細(xì)胞（Goat embryonic fibroblasts，GEFs），2.5 μmol/L SAHA處理濃度即可顯著提高GEFs組蛋白H3K9的乙酰化水平，提高體細(xì)胞核移植效率。白力[21]研究表明，采用0.25、0.50、1.00、2.00和4.00 mmol/L 4種濃度VPA處理牛體細(xì)胞24 h后，隨著處理濃度的升高G0/G1期和G2/M期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，表明VPA具有將細(xì)胞阻滯在G0/G1期的作用，且隨著VPA濃度和時間的增加，VPA的周期阻滯作用愈加明顯，G0/G1期細(xì)胞比例增加，而且牛胎兒成纖維細(xì)胞H3K9和H4K5組蛋白乙酰化水平顯著提高，有利于進(jìn)行體細(xì)胞核移植。以上研究結(jié)果表明，HDACi可通過調(diào)節(jié)供體細(xì)胞周期提高克隆效率;HDACi能促進(jìn)供體細(xì)胞不同組蛋白位點呈現(xiàn)高水平的乙酰化狀態(tài)，有助于核移植后重編程，促進(jìn)胚胎發(fā)育;HDACi能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡。

3 HDACi對SCNT重構(gòu)胚胎發(fā)育的影響

利用HDACi處理供體細(xì)胞后，能對SCNT重構(gòu)胚胎早期發(fā)育產(chǎn)生影響。第一次被應(yīng)用在SCNT中的HDACi是TSA。Luo等[22]研究表明，用0.15、0.3 μmol/L TSA處理牛供體細(xì)胞48 h可顯著提高SCNT胚胎的卵裂率和囊胚率。Wei等[23]研究表明，使用TSA處理可提高H3K14、H4K12乙酰化水平，從而促進(jìn)SCNT胚胎體外發(fā)育率。然而，TSA本身有一定的副作用即細(xì)胞毒性較強(qiáng)，所以不同物種體細(xì)胞的耐受性決定了TSA重編程效率的高低，同時決定了核移植胚胎的體外發(fā)育能力[24]。VPA毒性較TSA低，且具有較高的組蛋白乙酰化活性。Miyoshi等[25]研究表明，使用VPA處理豬SCNT胚胎，可顯著提高胚胎體外發(fā)育率的同時提高多能性基因的表達(dá)。Xu等[26]研究表明，使用VPA處理牛SCNT胚胎，可顯著提高牛胚胎體外發(fā)育率，同時顯著增加組蛋白H3K9的乙酰化水平。Isaji等[27]研究表明，相比TSA而言，VPA可以更加高效地提升重構(gòu)胚的發(fā)育能力，并且可以改善小鼠克隆胚胎中H3K27me3的分布以及多能性基因的表達(dá)水平。相比TSA、VPA而言，Scriptaid是一種毒性更低的人工合成的HDACi，Van Thuan等[28]研究表明，用250 nmol/L Scriptaid處理SCNT胚胎10 h后，不僅顯著提高了重構(gòu)胚胎體外發(fā)育能力，同時也獲得了克隆小鼠。以上研究結(jié)果表明，由于物種體細(xì)胞的耐受性差異，不同HDACi處理供體細(xì)胞、重構(gòu)胚胎，對于提高SCNT胚胎體外發(fā)育率各不相同;HDACi有利于SCNT胚胎的早期發(fā)育，可用于提高其體外生產(chǎn)效率。

4 HDACi對SCNT胚胎早期發(fā)育機(jī)制的影響

表觀遺傳修飾主要發(fā)生在胚胎發(fā)育的早期階段，并與其發(fā)育潛能有關(guān)，因此這些表觀遺傳標(biāo)記可用來預(yù)測SCNT效率。組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶（HAT）和組蛋白去乙酰化酶（HDAC）可以通過修飾N-末端保守的賴氨酸殘基部位來調(diào)控組蛋白的乙酰化模式。組蛋白乙酰化可以促進(jìn)轉(zhuǎn)錄，這是因為高的乙酰化水平可以影響染色體中組蛋白和染色質(zhì)之間的相互作用，這一過程促進(jìn)了轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合、調(diào)節(jié)了蛋白質(zhì)和組蛋白N-末端的作用[29]。Selokar等[30]研究表明，使用2.5～10.0 mmol/L VPA處理牛供體細(xì)胞24 h后，其克隆囊胚中H3K9me3水平顯著低于未經(jīng)處理的克隆胚胎，并使表觀遺傳狀態(tài)更接近IVF胚胎。Bui等[31]研究表明，在豬的SCNT過程中，H3K16、H3K14、H3K9 3個位點的乙酰化水平先下降，之后恢復(fù)到與孤雌激活胚胎乙酰化水平相似程度。Wang等[32]研究表明，在小鼠的SCNT過程中，H3K14和H3K9的超乙酰化發(fā)生在SCNT之后，然而組蛋白乙酰化修飾程度的下降是發(fā)生在核質(zhì)重構(gòu)之后。

HDACi能促進(jìn)組蛋白乙酰化，間接導(dǎo)致染色質(zhì)構(gòu)型的改變，染色質(zhì)重塑對基因表達(dá)十分重要，疏松型染色質(zhì)可以促進(jìn)基因的表達(dá)。在哺乳動物早期胚胎重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子中，多能性基因OCT4、NANOG、CDX2和SOX2在胚胎發(fā)育早期起關(guān)鍵作用。魏麗曉等[20]研究發(fā)現(xiàn)，2.5 μmol/L SAHA處理山羊胎兒成纖維細(xì)胞24 h 后，克隆胚胎中囊胚的Oct4、Sox2、Nanog表達(dá)水平均顯著高于未處理囊胚。Lager等[33]研究發(fā)現(xiàn)，使用50 nmol/L TSA處理牛重構(gòu)胚13 h后，Nanog和Cdx2表達(dá)量顯著上調(diào)，且高于IVF胚胎。

在SCNT胚胎中，細(xì)胞凋亡是影響胚胎質(zhì)量的關(guān)鍵因素。Cui等[34]研究發(fā)現(xiàn)，用0.05 μmol/L TSA處理牛重構(gòu)胚10 h后可上調(diào)抗凋亡基因Bcl-xL的表達(dá)，下調(diào)促凋亡基因Bax的表達(dá)，并且用TSA處理后，可影響重構(gòu)胚中miRNA的表達(dá)，SCNT胚胎中miRNA-21表達(dá)量低于IVF胚胎，而TSA處理可使其表達(dá)量增加，增強(qiáng)細(xì)胞的抗凋亡能力，從而促進(jìn)牛克隆胚胎的發(fā)育。

以上研究結(jié)果表明，不完全的組蛋白乙酰化的重編程都會發(fā)生在不同物種的SCNT胚胎中;HDACi在一定程度上對SCNT胚胎的表觀遺傳重編程異常有修復(fù)作用，可使SCNT胚胎的表觀遺傳修飾水平更接近IVF胚胎;HDACi能使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重塑并對多潛能基因的表達(dá)有顯著影響;HDACi處理可抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)胚胎的進(jìn)一步發(fā)育。

5 小結(jié)

HDACi作為一類組蛋白去乙酰化酶抑制劑，在克隆胚胎的表觀遺傳修飾及發(fā)育方面具有積極的促進(jìn)作用。但由于HDACi種類繁多及處理效果受動物物種種類、時間、濃度等多種因素影響，因此，開發(fā)高效、低毒副作用的HDACi和優(yōu)化處理條件對提高重編程效率、促進(jìn)胚胎發(fā)育至關(guān)重要。此外，HDACi的具體作用機(jī)制及克隆胚胎移植后出生胎兒能否正常生長、發(fā)育仍需要進(jìn)一步研究。

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