葛根淀粉生產水中葛根素的富集純化工藝優化

徐夢瑋 肖力 李漪錦 董新榮 劉德明 朱池明

摘要：研究了大孔吸附樹脂富集純化葛根淀粉生產排放水中葛根素的方法，并考察了15種型號的樹脂對葛根總異黃酮的動態吸附容量及乙醇的洗脫效果。結果表明，HPD-300樹脂對葛根總異黃酮的動態吸附容量可達到39.41 mg/mL，吸附后的樹脂以70%乙醇1.0 BV/h流速進行梯度洗脫的洗脫率可達到91.42%。從3 L排放水中可回收總異黃酮樣品4.7 g，總異黃酮含量（UV比色法）可達到61.67%，葛根素含量（HPLC法）可達31.80%。總異黃酮粗品經5%鹽酸水解及重結晶，得到了96.37%高純度的葛根素樣品，相對總異黃酮粗品的回收率為15.91%。以上方法為從葛根淀粉生產排放水中富集純化葛根素的最佳優化工藝條件。

關鍵詞：葛根;葛根素;分離純化;大孔吸附樹脂;總異黃酮

中圖分類號：R282? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）18-0107-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.18.021 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Optimization of enrichment and purification process of

puerarin in the production of pueraria starch

XU Meng-wei1a， XIAO Li1a， LI Yi-jin1a，DONG Xin-rong1a， LIU De-ming1b， ZHU Chi-ming2

（1a. College of Science， 1b. Center of Analytic Service， Hunan Agricultural University， Changsha? 410128，China;

2. Zhangjiangjie Pure Natural Agricultural Products Development Co. Ltd.， Zhangjiajie? 427200，Hunan，China）

Abstract： The method of puerarin enrichment and purification from water discharged by producing pueraria starch using macroporous resin as adsorption material was studied. The saturated capacity of dynamic adsorption （SCD） and elution rate （ER） of fifteen type of resin for total isoflavones of pueraria was investigated. The results indicated that the SCD for total isoflavones of pueraria was 39.41 mg/mL resin and the ER of resin was 91.42% eluted by 70% ethanol aqueous at 1.0 BV/h flow rate. And 4.7 g of crude isoflavones with the content of total isoflavones of 61.67% （UV spectrophotometry） and the content of puerarin of 31.80% （HPLC） could be recovered from? ? 3 L discharge water. A high purity sample which contained 96.37% puerarin was obtained by 5% HCl hydrolysis and recrystallization， and recovery of puerarin was 15.91%. This was the best process optimization for puerarin enrichment and purification from water extracted pueraria starch.

Key words： pueraria; puerarin; enrichment and purification; macroporous adsorbent resin; total isoflavones

葛根是國家衛生部批準的藥食兩用植物。葛根藥用始載于《神農本草經》[1]，中國藥典亦有收錄 [2]。葛根的主要活性成分為異黃酮類化合物 [3，4]。目前，從葛根中分離鑒定的異黃酮類化合物多達幾十種，主要有葛根素、大豆素、大豆苷、染料木素、芒柄花素等。葛根異黃酮具有植物雌激素、擴張冠脈血管等作用，以及抗腫瘤、降血糖、降血脂及抗氧化等活性[5-10]。葛根素則為葛根中特有的一種異黃酮，在臨床上已被廣泛應用于心腦血管系統疾病、糖尿病、眼底疾病及腫瘤的治療[11-13]。

葛根淀粉在中國民間食用的歷史悠久。近年來，葛根淀粉生產開始出現規模化的加工企業，但一般采用傳統的加工工藝[14，15]。在淀粉生產過程中存在用水量較大、葛根異黃酮隨水排放流失導致環境污染的問題。本研究旨在建立葛根淀粉生產排放水中葛根素的富集純化工藝條件，為葛根資源的綜合利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 葛根素（批號：110752-201615）購自中國食品藥品檢定研究院。葛根淀粉生產排放水由張家界越天然農產品開發有限公司提供。大孔樹脂 HPD-300、HPD -400、HPD-100、HPD-700、HPD-722、HPD-826、HPD-750、HPD-500、HPD-450，購自滄州寶恩吸附材料科技有限公司;D101、AB-8購自天津市光復精細化工研究所;LSA-40、ADS-7、LSA-21、DM-301購自鄭州勤實科技有限公司。乙醇為食用級，甲醇為分析純，水為去離子水。

1.1.2 儀器與設備 UV-2450紫外可見分光光度計、島津LC-20AT高效液相色譜儀、ATY124萬分之一電子天平購自日本島津公司;TP-520A電子天平購自湘儀天平儀器設備有限公司;TG16-WS高速離心機購自長沙湘智離心機儀器有限公司;KQ-300DE型數控超聲波清洗器購自昆山市超聲儀器有限公司;旋轉蒸發器RE-52C購自鞏義市予華儀器有限責任公司;SHA-C恒溫振蕩器購自常州智博瑞儀器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分析方法

1）總異黃酮含量測定。葛根素標準曲線的繪制：準確稱取 6.0 mg葛根素標樣于100 mL燒杯中，加適量甲醇溶解，將其定量轉移至25 mL容量瓶中，定容，搖勻。分別移取 0.10、0.20、0.40、0.60、0.80 mL儲備液于10 mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻。在250 nm下測定吸光度，以吸光度對葛根素濃度繪制標準曲線。樣品分析：準確稱取10 mg分離樣品于100 mL燒杯中，加適量甲醇溶解，定量轉移至25 mL容量瓶中，定容搖勻。在波長250 nm下測定吸光度，計算測定溶液中總異黃酮的濃度C1，按公式（1）計算樣品中總異黃酮的含量。

[總異黃酮含量=C1×f×V×10-6m0×100%] （1）

式中，C1為待測液中總異黃酮的濃度（mg/L）;? ?f為稀釋倍數;V為待測液體積（mL）;m0為鮮葛根的質量（g）。

2）葛根素含量測定。HPLC條件：InertSustain-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。流動相A為水;流動相B為甲醇。梯度洗脫條件：0～25.00 min，30%～70%B;25.00～25.10 min，70%～100% B;25.10～27.00 min，100% B;27.00～27.10 min，30% B;27.10～34.00 min，30% B。流速為0.80 mL/min。柱溫35 ℃。檢測波長250 nm。進樣量10 μL。

標準曲線：配制葛根素濃度為1.747～57.576 mg/L的系列標準品溶液，按色譜條件測定并繪制標準曲線。

樣品測定：準確稱取10 mg樣品于25 mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻。按上述色譜條件測定，以標準曲線計算樣品溶液中葛根素的濃度，并按公式（2）計算葛根素含量。

[葛根素含量=C2×f×V×10-6m0×100%] （2）

式中，C2為待測液中葛根素的濃度（mg/L）;f為稀釋倍數;V為待測液體積（mL）;m0樣品質量（g）。

1.2.2 葛根淀粉生產排放水的前處理 將葛根淀粉生產排放水靜置48 h，取上層清液于9 000 r/min下離心5 min，收集離心液，備用。

1.2.3 大孔樹脂的靜態篩選 量取5 mL經預處理的大孔樹脂于250 mL的錐形瓶中，加入上述預處理的水溶液100 mL，于25 ℃水浴的振搖器中以100 r/min速度振搖3 h，然后室溫靜置吸附18 h。取適量上清液測定吸光度。過濾，用適量去離子水清洗樹脂。然后將吸附葛根總異黃酮的樹脂置于錐形瓶中，加入95%的乙醇45 mL，按上述方法于恒溫振搖器中振搖1 h。過濾，收集濾液，定容至50 mL，測定吸光度并計算總異黃酮的濃度。計算樹脂的飽和吸附量及洗脫率。

對飽和吸附容量較大、洗脫率較高的6種樹脂重復篩選。洗脫時采用30%、50%、70%、95%的乙醇溶液進行梯度洗脫，其余方法同上。

[Qe=（C0-Ce）×Vm×100%]? ? ? （3）

式中，Qe為飽和吸附容量（mg/g）;C0、Ce為吸附前、平衡后溶液濃度（mg/mL）;V為溶液體積（mL）;m為樹脂的質量（g）。

[洗脫率=Cx×Vxme×100%]? ? ? （4）

式中，Cx為洗脫液濃度（mg/mL）;Vx為洗脫液體積（mL），me為樹脂飽和吸附量（mg）。

1.2.4 大孔樹脂的動態吸附與洗脫

1）大孔樹脂的動態吸附篩選。取30 mL預處理好的HPD-300、HPD-100、D101，分別裝入直徑2.0 cm，柱高10.0 cm的色譜柱中。然后以總異黃酮含量為0.967 5 mg/mL的預處理液連續上樣至飽和吸附（流出液的吸光度約等于上樣液的吸光度后繼續上樣約10%體積的上樣液）。然后先以2 BV的純水洗滌樹脂柱，再用6 BV的70%乙醇溶液洗脫，收集洗脫液。測定洗脫液吸光度，按式（3）、（4）分別計算樹脂的動態飽和吸附容量及動態洗脫率。

2）大孔樹脂動態吸附與洗脫條件。取30 mL預處理的HPD-300大孔樹脂，裝入直徑2.0 cm，柱高10.0 cm的色譜柱中。考察上樣液中總異黃酮濃度、上樣流速對樹脂吸附的影響。間隔收集流出液，測定吸光度，繪制總異黃酮在樹脂上的動態吸附曲線。

吸附總異黃酮的樹脂柱先以2 BV的去離子水洗滌，再依次用6 BV的30%、50%、70%乙醇進行梯度洗脫。考察乙醇體積分數對洗脫效果的影響。測定洗脫液吸光度，按式（4）計算樹脂乙醇梯度的洗脫率，繪制總異黃酮的動態洗脫曲線。進一步用? ? 6 BV 70%乙醇以不同的流速洗脫吸附在樹脂上的總異黃酮計算洗脫率，考察洗脫流速對樹脂上總異黃酮洗脫率的影響。

1.2.5 葛根素的純化 稱取2 g的葛根總異黃酮粗品于圓底燒瓶中，加入5% HCl溶液80 mL，加熱回流4 h。趁熱過濾，收集濾液。待濾液冷卻后，用NaCO3調節pH到4～5。以等體積的乙酸乙酯分3次萃取，收集水相。用旋轉蒸發儀濃縮后至原體積的1/10左右，冷卻過夜;過濾，收集固體。將固體用CH3COOH-H2O（1∶9，V/V）重結晶，過濾，得到高純度的葛根素樣品。

2 結果與分析

2.1 大孔樹脂的靜態篩選

對15種大孔樹脂進行初步篩選，在此基礎上進一步對HPD-300、HPD-100、HPD-500、D101、LSA-40、ADS-8 6種樹脂的吸附與洗脫效果進行比較，并對吸附了葛根總異黃酮的樹脂依次以30%、50%、70%、95%的乙醇溶液進行梯度洗脫，其靜態吸附和解吸附的結果如表1所示。

由表1結果可知，葛根總異黃酮在2個非極性的HPD大孔樹脂上的靜態吸附效果均較好。從解吸附的結果上來看，吸附在樹脂上的葛根總異黃酮用30%、50%乙醇洗脫，解析率在76.65%～86.78%，而且HPD系列的非極性樹脂及D101的洗脫效果均很好。因此，進一步選取HPD-300、HPD-100、D101進行動態吸附與洗脫的效果比較。

2.2 大孔樹脂的動態吸附

2.2.1 動態篩選 在靜態篩選的基礎上，對3種大孔樹脂（HPD-300、HPD-100、D101）進行動態飽和吸附與洗脫的篩選。它們的動態飽和吸附量及70%乙醇動態洗脫的結果如表2所示。由表2可知，HPD-300樹脂對葛根總異黃酮的飽和吸附容量較大。從解吸附效果來看，70%乙醇對吸附在3種樹脂上的總異黃酮的洗脫率接近;從含量分析來看，HPD-100樹脂解吸所得樣品中葛根總異黃酮的含量較HPD-300稍低。因此，選用HPD-300進行下一步試驗。

2.2.2 HPD-300樹脂的飽和吸附曲線 在30 mL樹脂（柱高10.0 cm）柱上，以總異黃酮濃度為0.80 mg/mL水溶液1.0、2.0 BV/h的流速上樣，HPD-300樹脂的動態吸附曲線如圖1所示。在大孔樹脂的動態吸附研究中，一般認為流出液的濃度為上樣液濃度的1/10時對應的流出液體積為該濃度下的泄露曲線的泄漏點[16]。樹脂HPD-300在2個流速條件下的泄露點時所對應的體積分別為1 050 mL（1.0 BV/h）和500 mL（2.0 BV/h），此時樹脂的動態吸附量分別為每毫升樹脂28.00、13.33 mg。此后，樹脂對總異黃酮的吸附速度減小，流出液中總異黃酮的量以較快的速度增加。當流出液中總異黃酮的濃度接近上樣液濃度時停止上樣，此時樹脂在2個流速下的吸附量分別為每毫升樹脂37.15、35.34 mg。

2.3 HPD-300樹脂的動態洗脫

2.3.1 乙醇體積分數對總異黃酮洗脫的影響 將動態吸附達飽和的樹脂依次用6 BV的 30%、50%、70%乙醇，以1.0 BV/h流速進行梯度洗脫，結果如圖2所示。由圖2可知，30%的乙醇對吸附在HPD-300樹脂上的葛根總異黃酮的洗脫具有很好的效果。實際上，30%、50%及70%乙醇梯度洗脫時所得溶液中總異黃酮的總量分別為 795.9、227.0、29.4 mg，分別占洗脫總量的75.64%、21.57%、2.79%。根據總異黃酮在樹脂上的吸附總量計算，30%、50%及70%乙醇的洗脫率分別為70.42%、18.37%、2.63%。結果表明，吸附在樹脂上的總異黃酮可由50%乙醇洗脫下來，洗脫率可達到88.79%。

2.3.2 洗脫流速對樹脂上總異黃酮洗脫率的影響 進一步用6 BV 70%乙醇以不同的流速洗脫吸附在樹脂上的總異黃酮，結果如圖3所示。由圖3可知，洗脫流速較慢時，用70%乙醇洗脫使用量較少時可達到較好的洗脫效果。以6 BV的70%乙醇基本可將總異黃酮洗脫下來。計算結果表明，樹脂分別以1.0、1.5、2.0 BV/h流速洗脫時，總異黃酮的洗脫率分別可達到91.42%、82.44%、81.06%。將洗脫液減壓回收乙醇，可得到葛根總異黃酮樣品。

2.4 分離樣品的分析

2.4.1 總異黃酮 用紫外可見分光光度法在250 nm處測定葛根素標準溶液的吸光度，葛根素的濃度在2.4～19.2 mg/L范圍時其濃度與吸光度具有線性關系，線性方程為Y=0.016 2+59.048 96X，（R = 0.999 8，n = 5）。

將HPD-300樹脂吸附的洗脫液回收乙醇至干燥，可得到葛根總異黃酮樣品。對樣品中總異黃酮用比色法進行分析。用6 BV 70%乙醇以1.0、1.5、2.0 BV/h流速洗脫吸附樹脂時，從HPD-300樹脂富集所得樣品的總異黃酮含量分別可達到61.67%、60.11%、56.51%。

2.4.2 葛根素 按“1.2.1”中的色譜條件，得到色譜圖如圖4A所示，葛根素濃度在1.747～57.576 mg/L范圍內，濃度與積分面積具有良好線性關系，y =? ? 29 348.4x - 841.565，R2 = 0.999 6（n=7）。

進一步對大孔樹脂分離所得總異黃酮樣品及酸水解純化的葛根素樣品進行HPLC分析，分析了葛根素的含量，HPLC圖譜如圖4所示。

按標準曲線計算，葛根淀粉生產排放水以大孔樹脂吸附富集，再以70%乙醇1 BV/h流速洗脫所得到總異黃酮樣品中葛根素的含量為31.80%。總異黃酮樣品經酸水解、重結晶等步驟純化后得到的樣品中葛根素純度達到了96.37%。

3 小結與討論

本研究以葛根淀粉生產企業的排放水為原料，以HPD-300大孔樹脂吸附總異黃酮，以6 BV的70%乙醇洗脫，可實現排放水中總異黃酮的回收。洗脫液回收乙醇、減壓干燥后即可得到固體總異黃酮樣品（3 L排放水中可回收異黃酮樣品4.7 g）。以1.0 BV流速的70%乙醇洗脫時所得樣品中總異黃酮含量（UV比色法）可達到61.67%，葛根素含量（HPLC法）可達到31.80%。進一步經5%鹽酸水解及重結晶，得到了純度為96.37%的葛根素樣品（葛根素樣品相對總異黃酮粗品的收率為15.91%）。

葛根為傳統的藥食兩用植物，其塊狀根中淀粉含量較高，對生長的環境要求不高，耐貧瘠、耐干旱，適合邊遠山區種植。近年來，很多地方的葛根種植與生產加工已經成為貧困山區農民脫貧致富的引擎。但是大部分葛根產區小型淀粉加工廠較多，在技術上僅提取和利用了葛根淀粉。這不僅造成了葛根總異黃酮的資源浪費，而且含總異黃酮的水直接排放會對環境造成較大的影響。葛根藥用價值的主要活性成分為葛根素等異黃酮類化合物，葛根素在臨床上用于治療心腦血管等疾病。從葛根淀粉加工廠排放水中富集回收葛根總異黃酮，并進一步經鹽酸水解及重結晶等步驟純化得到96.37%高純度的葛根素，這一優化后的工藝不僅綜合利用了資源，從生產源頭上防止了環境污染，而且還可以為葛根生產企業增加經濟收益。

參考文獻：

[1] 馬繼興. 神農本草經輯注 [M]. 北京： 人民衛生出版社， 1995.194.

[2] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典（一部）[S].

[3] 石 勇， 吳正奇. 葛根和葛根保健品的國內外研究進展[J].湖北工學院學報， 2000，15（1）：52-55.

[4] 張 雁， 張孝祺， 吳偉琪， 等. 葛根資源的開發利用[J].中國野生植物資源，2000，19（6）：26-29.

[5] 李天星， 李新民. 中藥葛根的研究進展[J].湖南中醫雜志， 2013，29（8）：151-153.

[6] 陳荔炟， 陳樹和，劉焱文.葛根資源化學成分和藥理作用研究概況[J].時珍國醫國藥，2006，17（11）：2305-2306.

[7] 裴月湖， 婁紅祥. 天然藥物化學（第7版）[M].北京：人民衛生出版社，2016.183.

[8] BOUE S M，WIESE T E，NEHLS S，et al. Evaluation of the estrogenic effects of legume extracts containing phytoestrogens[J]. J Agric Food Chem，2003，51：2193-2199.

[9] 鄭高利， 張信岳， 鄭經偉. 葛根和葛根總異黃酮的雌激素樣活性[J].中藥材， 2002， 25（8）：566-568.

[10] 劉 葵， 張恩娟. 大豆異黃酮的藥理作用及臨床應用研究進展[J].中國藥房， 2006， 17（1）：67-69.

[11] 劉 新， 林 於. 愈風寧心片體外溶出度比較[J].中國中藥雜志， 2001， 26（2）：132-133.

[12] 趙曉莉， 崔小兵. HPLC法測定葛根素葡萄糖注射液中葛根素及3'-甲氧基葛根素含量[J].中國中藥雜志， 2000， 25（7）：413-415.

[13] 王 靖， 吉 民， 華維一， 等.葛根素研究進展[J].藥學進展， 2003， 27（2）：70-73.

[14] 常 虹， 周家華， 蘭彥平， 等. 葛根淀粉提取工藝研究[J].現代食品科技， 2009， 25（5）：523 -526.

[15] 孫慶杰， 楊明毅. 葛根淀粉連續化生產工藝的研究[J].食品科學， 2002， 23（4）： 93-94.

[16] 李 俠，臧學麗，徐祎博，等. AB-8大孔樹脂純化綠豆皮黃酮工藝優化及純化前后抗氧化能力比較[J]. 食品科學，2018， 39（10）：283-290.