紫外分光光度法測定烤煙揮發油溶液濃度

王柯涵 向歡 楊懿德 張永輝 曾淑華 楊民烽 郭仕平 劉雷

摘要：為建立利用紫外分光光度法測定烤煙揮發油溶液濃度方法，先用同時蒸餾萃取方法得到烤煙揮發油，再用二氯甲烷將其稀釋成梯度溶液，紫外分光光度掃描，并確定工作波長，以此建立烤煙揮發油濃度與其紫外吸光度間的線性回歸方程。結果表明，烤煙揮發油的紫外光吸收帶在225～245 nm，239 nm最適合作為測定烤煙葉揮發油溶液濃度的工作波長，線性回歸方程為y = 0.250 1 x + 0.039 3，R2=0.999 3，且有很好吸光度重復性（RSD<0.5%）;所得線性工作曲線的LOD為0.153 g/L，LOQ為0.464 g/L。

關鍵詞：烤煙;揮發油;紫外光;分光光度法;定量

中圖分類號：O69;S572? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）18-0116-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.18.023

Determination of the concentration of flue-cured tobacco

volatile oils by UV-spectrophotography

WANG Ke-han1，2，XIANG Huan1，3，YANG Yi-de4， ZHANG Yong-hui5，

ZENG Shu-hua1，YANG Min-feng6，GUO Shi-ping6，LIU Lei1

（1. Agricultural College of Sichuan Agricultural University， Chengdu 611130， China; 2.Shifang？Bureau？of？Development Reform and Sci-tech， Deyang 618400， Sichuan， China; 3.Sichuan Tobacco Corporation Deyang Branch， Deyang? 618400， Sichuan， China; 4. Sichuan Tobacco Corporation Yibin Branch， Yibin? 644000， Sichuan， China; 5.Sichuan Tobacco Corporation Luzhou? Branch， Luzhou? 646000， Sichuan， China; 6.Sichuan Provincial Tobacco Company， Chengdu? 610041， China）

Abstract： To determining the concentration of volatile oils solution extracted from flue-cured tobacco leaves， a method based on UV spectrophotometry was researched. Volatile oils were extracted by simultaneous distillation and diluted with dicholormethane to prepare a set of gradient solutions. Each solution was scanned by UV spectrophotomet. The best working wavelength was selected to establish linear regression equation between the concentration of volatile oil and its ultraviolet absorbance. Results showed that the volatile oils had a large absorption spectrum between 225～245 nm. The best analysis wavelength was 239 nm， the linear relationship was? ? ? y =0.250 1x + 0.039 3， R2=0.999 3. Its relative error of was less than 0.5%， the limit of detection （LOD） and the limit of quantification （LOQ） of the working curve were 0.153 g/L and 0.464 g/L separately.

Key words： flue-cured tobacco; volatile oils; ultraviolet light; spectrophotography; determination

煙葉油分是指煙葉組織細胞內含有的柔軟半液體或液體物質，在煙葉外觀上反映為油潤、豐滿、枯燥的程度。油分是煙葉分級工作中重要的分級因素，也是衡量煙葉品質的重要指標[1，2]?？緹熡头质且粋€概括性極強的品質因素，其中涉及的化學成分極為復雜，主要可分為揮發油組分和非揮發油組分。煙草非揮發油組分中主要有油脂、樹脂、蠟質、類脂物、甾醇以及色素等;而揮發油（Volatile oils）則是一類具有揮發性的芳香氣味油狀物質的總稱。煙葉揮發油主要包括低分子的烴類、酚類、醇類、醚類、酮類、醛類、酸類、酯類等，能隨水蒸氣蒸餾而不被破壞，在常溫下即可散發出芳香氣味[3];是體現煙葉優良商品特性的重要物質，影響著煙葉的外觀品質、感官品質和物理特性[4]。

目前，關于烤煙揮發油的研究主要關于提取方法和某些具體物質成分的定性分析、定量分析[5，6]。將烤煙揮發油作為一個整體來研究其含量測定的方法尚屬少見[7]。應用較多的揮發油定量分析方法是稱重法，即將經蒸餾萃取得到的揮發油進行除水干燥和有機溶劑揮發后稱重求出其含量[8，9]。研究表明，稱重法中蒸餾提取、溶劑揮發、物質干燥、稱重等操作過程耗時較長，并易在操作中引入測量誤差。

紫外分光光度法被廣泛應用于物質的定量分析，在植物揮發油定量分析工作中已有應用[10，11];相較于其他檢測方法如GC-MS等，其優勢在于無需昂貴的儀器設備，且具有操作簡單、高效和低成本等特點。揮發油中含有許多萜烯類物質，大多具有吸收紫外光的特性;但將此特性應用于烤煙的初烤煙葉揮發油含量測定上尚鮮見報道。本研究通過測定不同濃度烤煙揮發油溶液的紫外光吸收光譜，比較篩選出適用于測定烤煙揮發油濃度或含量的最佳工作波長，以此建立擬合度高的線性工作曲線，旨在為建立烤煙揮發油快速、準確的定量分析方法提供參考，為分析煙葉品質提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

煙葉材料：烤煙品種云煙87的初烤煙葉（C3F）。

試劑：無水硫酸鈉、二氯甲烷、氯化鈉（AR，成都市科龍化工試劑廠）。

1.2 儀器與設備

雙熱源同時蒸餾萃取器;JJ124BC型電子天平（感量0.000 1 g，深圳市朗普電子科技有限公司）;DHG-9246型烘箱（上海精宏實驗設備有限公司）;UV-2450型紫外-可見分光光度計（日本島津公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備 將煙葉置于40 ℃烘箱內烘5～6 h后去梗粉碎，過60目篩后置于密封袋內保存。

1.3.2 烤煙揮發油的提取 采用同時蒸餾萃取法提取烤煙揮發油[12]，向同時蒸餾萃取裝置的蒸餾大燒瓶（500 mL）中加入10 g樣品、150 mL去離子水和20 g氯化鈉，在萃取液富集端的小燒瓶（100 mL）中加入25 mL二氯甲烷;用兩個熱源同時加熱大、小兩只燒瓶，并保持二者微沸狀態3 h;經冷卻后將溶有烤煙揮發油的二氯甲烷回收液倒入三角瓶（100 mL）中，加入5 g 無水硫酸鈉以除去其中的水分;經過濾去除硫酸鈉晶體后將二氯甲烷回收液定容至100 mL，作為烤煙揮發油溶液的母液。

準確移取一定體積V1（30～40 mL）的揮發油母液，注入已知恒定重量（m1）、容積為50 mL的試管中，將試管置于30 ℃環境中自然通風24 h以上，待二氯甲烷揮發完全后準確稱得裝有濃縮揮發油的試管總重量（m2）。烤煙揮發油母液濃度C0=（m2- m1）/ V1。

1.3.3 紫外光譜分析 經計算后取適量的母液，并以二氯甲烷作稀釋溶劑，分別配制出濃度為母液濃度（C0）的10%、20%、40%、60%和80%的5個梯度溶液各10 mL。以二氯甲烷作為空白，用UV-2450型紫外可見分光光度計掃描后得到各梯度溶液和母液的紫外吸收光譜。

1.3.4 數據分析 用Excel軟件處理數據，以揮發油梯度溶液的吸光度為因變量、揮發油溶液的濃度為自變量進行線性回歸分析，繪制烤煙揮發油溶液濃度定量分析的工作曲線，并進行回歸模型誤差分析。

2 結果與分析

2.1 烤煙揮發油溶液的紫外光譜

烤煙揮發油中含有大量能吸收紫外光的成分，如萜類、烯類等，其在紫外光譜中必然出現吸收峰[13]。為了解烤煙揮發油溶液的紫外吸收光譜情況，經掃描得到了6個不同濃度的烤煙揮發油溶液在200～400 nm的紫外吸收光譜，結果如圖1所示。不同濃度的烤煙揮發油溶液紫外吸收光譜中都只有1個明顯的吸收帶，且都在225～245 nm范圍內;隨著揮發油溶液濃度的增加，各梯度溶液吸收峰值相應增大;但最大吸收峰的波長所在位置卻并不固定，而是隨溶液濃度的增大，最大吸收峰的波長表現出明顯的波長增大現象（即發生紅移）。

2.2 工作波長的選擇

通常采用分光光度法進行物質定量分析時是以待測物的最大吸收波長作為工作波長，并以被測物含量（濃度）為自變量、最大的吸收波長的吸光度為因變量，從而建立計算被測物含量（濃度）的回歸模型[14]。本研究中6個不同濃度的烤煙揮發油溶液在225～245 nm的吸光度及最大吸收波長變動的情況見表1所示。隨著烤煙揮發油梯度溶液由母液濃度（C0）的10%逐漸增大到100%，6個溶液的最大紫外吸收波長也由230 nm逐漸增大、最后移動到233 nm處。鑒于最大吸收波長的不穩定狀態不宜將其作為工作波長。有研究表明，可以利用非最大吸收波長處的吸光度建立待測物質的定量標準曲線[15]。回歸方程的決定系數（R2）反映了回歸方程對各觀測點擬合程度，R2越高擬合度越好[16];根據擬合線性方程的R2高低可篩選出最佳工作波長。為探索最大波長以外是否有恰當的波長位置可以選為工作波長，本研究求出了烤煙揮發油梯度溶液與其在225～245 nm每個波長下吸光度的線性回歸方程決定系數，結果見表1。在236～241 nm范圍內二者的線性回歸方程決定系數都在0.999以上;其中239 nm處的吸光度與其濃度間的線性回歸方程決定系數最高，達到0.999 29，可見烤煙揮發油溶液在239 nm處的吸光度的變化最能準確地反映其濃度，從而確定239 nm為最佳工作波長。

2.3 重復性分析

為檢測不同濃度的烤煙揮發油溶液在239 nm處吸光度的重復性，測定了其在239 nm處的吸光度，每個梯度溶液的樣品被重復測6次。結果表明，不同濃度梯度溶液吸光度的相對標準偏差（RSD）均較小，為0.079%～0.468%（表2）;說明不同濃度的烤煙揮發油溶液在239 nm處吸光度有較好的重復性。

2.4 定量工作曲線的建立

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