兩種宮腔灌注治療對薄型子宮內膜患者的療效對比觀察

龍惠東，王鳳，吳迪，鄧偉芬，黃玉群，李宇彬

(1.東莞廣濟醫院生殖中心，東莞 523000；2.中山大學附屬第一醫院，廣州 510000；3.深圳恒生醫院，深圳 518000)

隨著輔助生殖技術的快速發展，體外受精-胚胎移植術(IVF-ET)已成為治療不孕癥的重要助孕方法。除了胚胎質量外，子宮內膜因素是影響IVF-ET成功的一大重要因素，臨床上常見由于反復宮腔操作導致子宮內膜炎癥、粘連，或不明原因的內膜變薄，降低了IVF-ET的周期妊娠率。如何改善薄型子宮內膜患者的內膜厚度及臨床結局，是生殖醫學工作者所關注的熱點與難點。宮腔灌注是臨床上治療薄型子宮內膜的常用方法，主要有粒細胞集落刺激因子(G-CSF)宮腔灌注治療，以及近年來報道的富血小板血漿(PRP)宮腔灌注治療。不同的灌注物之間是否存在治療效果差異尚未有定論。本研究擬探討PRP與G-CSF宮腔灌注對薄型子宮內膜患者行IVF助孕臨床結局的效果，以選擇更優的方法用于臨床治療。

材料與方法

一、研究對象

2018年7月至2020年3月在東莞廣濟醫院生殖中心行凍融胚胎移植的薄型子宮內膜患者。

納入標準：年齡≤38歲；既往至少兩次自然排卵周期或促排卵周期卵泡成熟時內膜厚度≤7 mm，或激素替代人工周期(HRT)準備子宮內膜時，雌激素持續用藥12 d時內膜厚度≤7 mm；本次移植至少有1個為優質胚胎。

排除標準：既往有腫瘤病史；合并巨大子宮肌瘤(直徑>4 cm)；嚴重子宮腺肌病患者；對G-CSF過敏者。

共納入229例患者。患者知情同意后采取隨機數字表隨機分為3組：80例接受PRP宮腔灌注治療(PRP組)，81例接受G-CSF宮腔灌注治療(G-CSF組)，68例接受生理鹽水宮腔灌注(對照組)。

本研究經東莞廣濟醫院生殖中心醫學倫理委員會批準。

二、治療方案

1.子宮內膜準備方案及內膜測量：對月經周期規則、有正常排卵的患者選擇自然或促排卵周期方案或HRT方案；對無正常排卵患者選擇HRT方案。

HRT方案：于月經第2～3天開始口服戊酸雌二醇(補佳樂，拜耳，德國) 4～8 mg/d，并根據內膜及血激素水平調整劑量，雌激素持續用藥12～16 d及雌二醇水平>734 pmol/L時予以內膜轉化，轉化日開始給予黃體支持用藥。

胚胎移植當日檢測子宮內膜厚度及內膜血流，內膜測量值均在兩名超聲醫生的核對后得出結果。檢測到內膜和內膜下均無血流為A級內膜，僅檢測到內膜下有血流為B級內膜，內膜和內膜下均檢測到血流為C級內膜[1]。

2.PRP的制備：全程嚴格執行無菌操作，制作方法參考文獻報道[2]：抗凝管抽取患者肘靜脈血15 ml，留取1 ml全血進行血小板(PLT)計數，剩余14 ml全血進行PRP制備：將血標本放進2個離心管中，215g離心10 min；離心后的標本吸取全部上清、白膜層及以下2 mm的紅細胞層轉移到新的離心管中進行第2次離心，863g離心10 min；后棄掉3/4上清液剩余約1.0 ml吹打均勻即PRP。留取0.2 ml計數PLT，全自動血液分析儀(Siemens Advia 2120i，德國) 計數全血及 PRP中的PLT數量。

3.宮腔內灌注：自然周期或促排周期中優勢卵泡約12 mm時或HRT周期用藥第8天子宮內膜厚度≤6 mm時，在PRP組給予PRP宮腔內灌注1次，G-CSF組給予G-CSF(惠爾血，協和發酵麒麟，日本)300 μg(0.7 ml)宮腔內灌注1次，對照組予生理鹽水0.7 ml宮腔灌注；在轉化日再次給予宮腔灌注以強化治療效果。

宮腔灌注操作：常規消毒鋪巾下，患者采取膀胱截石位，用人工授精管(COOK，美國)抽吸0.8 ml患者自體PRP(PRP組)或G-CSF 300 μg(G-CSF組)或0.7 ml生理鹽水(對照組)，在腹部超聲引導下經宮頸插入宮腔，看到管尖在宮腔中部時，將灌注液在無阻力下緩慢注入宮腔，將液體全部推入宮腔后緩慢外退管芯后完成，術后患者平臥休息30 min。

4.胚胎解凍移植及黃體支持：胚胎解凍后對胚胎進行評分，移植2枚卵裂期胚胎或1枚囊胚，卵裂胚至少有1枚為優質胚胎(7～9細胞，碎片率<30%的I級或II級胚胎)。3組黃體支持方案統一為：地屈孕酮片(達芙通，蘇威制藥，荷蘭)20 mg 2次/日口服+黃體酮軟膠囊(安琪坦，Besins，比利時) 200 mg 2次/日陰道給藥。移植后14 d驗血HCG值，移植后30 d超聲下見妊娠囊定義為臨床妊娠。

三、觀察指標

患者一般資料；治療前(前次移植日)、治療后移植日內膜厚度及血流分級；平均移植胚胎數、胚胎種植率、臨床妊娠率、早期流產率。胚胎種植率=(超聲下孕囊個數/移植胚胎數)×100%，臨床妊娠率=(超聲下見孕囊例數/移植總例數)×100%，早期流產率=(孕12周前流產例數/臨床妊娠例數)×100%。

四、統計方法

結 果

一、各組患者的一般情況比較

3組患者間年齡、不孕年限、既往人流次數、體重指數(BMI)、抗苗勒管激素(AMH)、基礎卵泡刺激素(FSH)、基礎黃體生成素(LH)、基礎雌二醇(E2)、基礎孕酮(P)水平比較，差異均無統計學意義(P>0. 05)(表1)。

表1 三組患者一般情況比較 (-±s)

二、PRP組中PRP的制備情況

PRP的制備均在千級層流實驗室無菌操作下進行，宮腔灌注術后均未出現感染等不良反應。PRP中PLT濃度為全血的3.16倍[(433.83±36.76)×109/L vs. (137.17±24.94)×109/L，P<0.001)]。

三、各組子宮內膜厚度及血流分級比較

3組間既往周期移植日(表2中定義為“治療前”)的內膜厚度無顯著性差異(P>0.05)；PRP組及G-CSF組治療后移植日內膜厚度均較既往周期移植日內膜厚度顯著增厚(P<0.001)，且顯著優于對照組(P<0.001)(表2)。

灌注治療后3組的內膜血流分級比較均有顯著性差異(P<0.05)，PRP組及G-CSF組的B及C級血流患者比例顯著高于對照組(P<0.05)(表2)。

四、各組胚胎移植及妊娠結局比較

3組間移植胚胎數、胚胎種植率、臨床妊娠率、早期流產率比較差異均無統計學意義(P>0.05)(表3)。

表2 三組患者宮腔灌注治療前后移植日內膜厚度及血流分級[(-±s)，n(%)]

表3 三組間妊娠結局的比較[(-±s)，%]

討 論

在輔助生殖技術中，子宮內膜厚度及內膜血流是評估子宮內膜容受性的常用指標，成功妊娠的理想內膜厚度是9～12 mm，內膜下血流豐富者有著更高的臨床妊娠率[3]。有臨床研究發現移植日的子宮內膜厚度低于7 mm者臨床妊娠率僅有23.1%[4]，內膜菲薄一直是生殖醫生所面對的棘手問題。近年來對薄型子宮內膜的處理有很多不同方法，如宮腔灌注治療、血管活性藥物(西地那非、阿司匹林等)、生物電刺激、雌激素補充、中藥針灸及干細胞治療等，宮腔灌注的藥物可直接與內膜局部作用，是較多臨床醫生常選擇的治療手段，但不同的灌注藥物該如何選擇，不同的藥物之間是否有明顯差異值得探討。本研究提示PRP或G-CSF宮腔灌注均可以改善子宮內膜厚度及內膜血流分級。

PRP宮腔灌注是治療薄型子宮內膜近年來摸索的新方法。PRP中血小板的數目比全血中數目高3倍以上，且富含有多種生長因子，可誘導和調節細胞分裂、分化和增殖，自體PRP應用于口腔及骨關節外科，得到了良好的臨床療效[5]。PRP中高濃度的血小板被激活后能釋放血小板源性生長因子(PDGF)、轉化生長因子β(TGF-β)、表皮生長因子(EGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、成纖維細胞生長因子(FGF) 等，通過脫顆粒方式結合到細胞膜表面，促進子宮內膜組織生長[6-7]，Bertrand-Duchesne等[8]報道PRP多種生長因子中，以EGF的作用較為重要，可促進體外培養的內皮細胞增長。近年來開始將PRP應用于薄型子宮內膜的患者，探討應用PRP灌注改善IVF-ET治療中薄型子宮內膜患者的臨床結局[9-10]；國內也有報道PRP治療提高患者的內膜厚度及IVF的臨床妊娠率[11-12]。本研究結果提示PRP宮腔灌注后患者的子宮內膜厚度及內膜血流得到改善，但臨床妊娠率與對照組沒有顯著性差異，可能是樣本量不足的原因。

G-CSF是刺激骨髓造血細胞增殖分化的細胞因子，文獻報道在女性生殖方面它也參與了子宮內膜的生長、發育，在人子宮內膜和母胎界面均有G-CSF及其受體的表達[13]，為近幾年G-CSF在生殖醫學的臨床應用提供了理論依據。Gleicher等[14]首次報道應用G-CSF治療薄型子宮內膜獲得較好的妊娠結局，提示G-CSF可能具有促進子宮內膜細胞增生及刺激內膜血管網再生等作用。也有多項Meta分析指出宮腔內灌注G-CSF可促進IVF-ET周期子宮內膜生長并提高臨床妊娠率[15-18]。G-CSF除了增加子宮內膜的厚度，還可改善子宮內膜的容受性，可能與其在子宮內膜的受體表達有關系[19-20]。本研究提示G-CSF宮腔灌注可以改善薄型子宮內膜患者的子宮內膜厚度及內膜血流，但臨床妊娠率與對照組也沒有顯著性差異，可能是樣本量不足的原因，有待進一步加大樣本量深入研究。

兩種灌注方法各有優缺點。PRP制作來源于自體的血清，不會發生血源性感染和誘發胚胎變態反應等問題，安全性已得到文獻證實[5]。PRP灌注從外科應用引入到生殖科，其原理更側重于促進增殖、修復、愈合的作用，其中的多種因子在體內緩慢釋放，并且還富含纖維蛋白、纖維結合蛋白等纖維網絡，促進細胞黏附，推測PRP灌注可能更適合于宮腔粘連等內膜損傷的薄型子宮內膜患者；采血收集PRP對患者有一定的創傷性，其制作比較繁瑣而且對實驗室無菌操作有一定要求，不同實驗室操作標準的差異也可能影響其有效性。G-CSF灌注選用的是現有的成品藥物，不需要特殊制備，應用相對簡便，藥品出廠經過嚴格質控更加安全，而且對患者是無創的，但可能存在極個別患者對藥物過敏不能使用，而且理論上單一的生長因子對促進細胞增殖與修復的作用沒有多因子的復合作用強，G-CSF可能對非病理性損傷的薄型子宮內膜更合適，將來可以進一步分類研究探討。

本研究比較了PRP及G-CSF兩種宮腔灌注方法在薄型子宮內膜患者中的治療作用，為臨床治療提供了新的方法和思路。研究結果顯示兩種方法在提高薄型子宮內膜患者的內膜厚度及血流、改善臨床妊娠率方面均無顯著性差異，提示兩種方法效果相似。G-CSF宮腔灌注由于其使用上的便捷性、安全性及無創性，可接受性更強，臨床上可以推薦應用于薄型子宮內膜患者；而PRP宮腔灌注臨床使用安全有效，在缺乏G-CSF藥物時或對G-CSF過敏患者也不失為一種有效的治療手段，臨床上也可以根據患者情況和實驗室條件進行選擇。