流式細胞術檢測精液細胞異質性與精子質量的相關性研究

王家雄，劉彩釗，韓慕天，邢時雨，沈麗燕，馬勇，李紅，楊慎敏

(南京醫科大學附屬蘇州醫院生殖與遺傳中心，蘇州 215002)

男性不育一直困擾著許多育齡家庭，臨床上對男性生育力的檢測指標多種多樣，但諸多指標仍然存在不確定性[1]。目前臨床上最常見的評價精液質量的參數是精子濃度分析、精子活動力分析與精子形態分析等。進行精子濃度與活動力分析時，無論是采用計算機輔助精液分析系統(CASA)還是人工計數，都無法看到一份精液中精子的全貌；同理，精子形態觀察時亦只能取部分視野觀察幾百條精子，雖然可以有效體現精子特異性畸形，但也難以概括精子的全貌。流式細胞術由于其高通量和重復性好的優勢，可以在短時間內分析成千上萬個細胞，配合特異抗體時還可以捕獲每個細胞的多方面特征，因此流式細胞術在精液質量分析中的應用越來越廣泛[2]；且流式細胞術可以在單一細胞水平進行分析，可以克服目前大多數技術僅提供整體精液平均值的弊端，但是流式細胞術的檢測價格不菲[3]，增大了醫療成本。

目前，流式細胞術在男科臨床檢驗中主要用于檢測精子DNA碎片[4]、頂體反應[5]、線粒體狀態[6]、凋亡標志物[7]、活性氧[8]等。精液內不僅有精子，還有不成熟的生精細胞、各類圓細胞以及細胞碎片等，它們與精子的大小存在明顯差異。受到臨床血液學檢測中紅細胞分布寬度(RDW)用于貧血鑒別診斷[9]的啟發，這個思路是否可以用于精子質量的判斷？即精液內細胞直徑大小異質性越大，精子質量越差。本研究采用流式細胞術分析患者精液內細胞大小的異質性與精子濃度、活動力、形態及DNA碎片等質量參數之間的關系，試圖引入一個新的、簡便高效的精子質量參數指標，并探究其作為一個檢驗參數，對精子質量是否存在一定的預測價值。

資料與方法

一、研究對象

收集2019年3～4月在本中心行精液檢查的男性不育患者的241例精液樣本。精液采集方式為：要求患者禁欲2～7 d，手淫方式取精。納入標準：患者染色體正常，無遺傳性疾病家族史，近期無泌尿生殖系統感染史，無慢性代謝性疾病。排除精液體積過小(<1 ml)、精液pH異常、精子凝集異常、精液中出現大量圓細胞的樣本。

二、研究方法

1.精液常規分析：精液取出后置于37℃溫箱進行保存，待精液完全液化后，采用CASA系統(上海北昂醫藥科技)進行精液常規分析，記錄精子濃度、活動精子百分率、前向運動精子百分率等。

2.精子形態分析：按照《世界衛生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》第5版(WHO手冊第5版)標準進行精子濕片制備，采用改良巴氏染色液(南京欣迪生物)進行精子涂片染色后，使用1 000倍光學顯微鏡對精子涂片進行觀察，并兩兩比對，記錄精子頭部異常、中段異常、主段異常和正常形態精子百分率。

3.精子DNA碎片檢測：采用精子染色質結構分析實驗(sperm chromatin structure assay，SCSA)檢測精子DNA完整性。先使用染色試劑盒(浙江星博生物)對精子進行吖啶橙染色，熒光信號通過Navios流式細胞儀(Beckman Coulter，美國)進行分析；流式分析的結果通過DFI Viewer軟件進行處理，最終得出DNA碎片指數(DNA fragment index，DFI)和高DNA著色性(high DNA stainability，HDS)數據。

4.流式細胞檢測精液內細胞大小異質性：采用Navios流式細胞儀檢測精子DNA碎片的同時，記錄前向散射光(forward scatter，FSC)通道反應的精液中細胞大小的整體變異系數(Coefficient of variation，CV)。在流式細胞檢測中CV值表示的是檢測數據的分布情況，分布的越散，CV越大；數值越集中，CV越小。在流式圖形中峰看起來越寬，相對應的CV值也比較大，說明檢測的細胞大小差異大；反之，CV就很小。并通過流式細胞儀FSC通道的正態分布圖設門B、C、D區，分別對應大細胞區(大頭精子、膨脹凋亡精子、紅細胞、白細胞、巨噬細胞、生精細胞)、普通細胞區(形態正常精子)與小細胞區(圓形精子等形態異常精子、細胞碎片)，記錄C區內部CV值。

5.CV值預測精子質量評價：參考WHO手冊第5版活動精子百分率(40%)、前向運動精子百分率(32%)以及正常形態精子百分率(4%)的正常參考值繪制受試者工作特征曲線(ROC曲線)，用整體CV值評價活動精子百分率、前向運動精子百分率以及正常形態精子百分率這3個參數是否正常，進而評估整體CV值預測精子質量的可靠性。

三、統計學分析

結 果

一、一般資料

所納入患者年齡24～55歲，平均年齡(31.9±5.0)歲。納入樣本的精液參數情況見表1。如圖1所示，FSC通道圖上從左到右是細胞大小遞增，圖像越是呈正態分布(圖1A)，精液中雜細胞越少，精子大小越趨于一致且正常(圖1C)；反之流式圖像越不規則(圖1B)，光鏡下精子畸形越嚴重，且出現不成熟的生精細胞以及細胞碎片(圖1D)。

表1 精液質量參數與精液細胞異質性參數(-±s)

A：正態分布的流式圖，按細胞大小分B、C、D三區；B：異常分布的流式圖；C：正態分布的流式圖對應的精子形態正常、大小均一；D：異常分布的流式圖對應的精子畸形多、精液內細胞碎片多圖1 精液細胞大小異質性與對應精子形態圖片

二、精子大小異質性參數與精液質量相關性

相關性分析發現，精液內所有細胞分布的異質性(總CV值)以及多數精子分布的異質性(C區CV值)與精子濃度、活動精子百分率、前向運動精子百分率、正常形態精子百分率均呈顯著負相關(P<0.01)，而與DFI、HDS呈顯著正相關(P<0.01)(表2)，提示精液內細胞以及精子大小均一性越好，精子質量越好。

B區細胞所占百分率與精子濃度、頭部畸形精子百分率和DFI呈顯著正相關(P<0.01)，與正常形態精子百分率呈顯著負相關(P<0.05)(表2)；B區為小細胞區，精子如果多數處于該區，即提示精子頭部異常變多，從而影響精子質量。

C區細胞所占百分率與精子濃度、活動精子百分率、前向運動精子百分率、正常形態精子百分率均呈顯著正相關(P<0.01)，而與DFI、HDS呈顯著負相關(P<0.01)(表2)，提示精子大小越是集中在均值左右，精子質量越好。

D區細胞所占百分率與DFI、HDS呈顯著正相關(P<0.01)，與精子濃度、活動精子百分率、前向運動精子百分率、正常形態精子百分率呈顯著負相關(P<0.01)(表2)；D區為大細胞區，細胞如果多數集中在該區，即精液中大細胞多，提示可能存在精子頭部膨脹、凋亡，圓細胞數量增多等情況，精子濃度、降低精子質量降低。

表2 精液細胞大小異質性參數與精液質量相關性

三、精子大小異質性參數作為衡量精液質量指標的可行性

參考WHO手冊第5版中活動精子百分率(40%)、前向運動精子百分率(32%)以及正常形態精子百分率(4%)的正常參考值，采用整體CV值判斷這3個參數的ROC曲線如圖2。3個ROC曲線的曲線下面積分別為0.723、0.713、0.607，表明整體CV值對這3個參數有一定的預測價值，預測效果適中。

A：活動精子百分率；B：前向運動精子百分率；C：正常形態精子百分率圖2 整體CV值評價活動精子百分率、前向運動精子百分率和正常形態精子百分率的ROC曲線

討 論

精子質量評估是目前臨床評價男性生育力最直觀的手段，常用的指標有精子濃度、精子活動力、精子形態及精子DNA碎片。近年來，評估精子質量的指標層出不窮，然而由于受孕過程的多因素性，沒有一個單一的指標可以完全預測男性生育力[10]。精子濃度、精子活力等指標，雖然提供了有價值的定量數據，但不能提供精子具體功能等信息，如精子穿透透明帶的能力等[11]。精子形態分析雖然多年來一直被沿用，也有一定的指導價值，但是許多精子畸形并不是病理性的，而是生理性的，因此除了針對某些特定的精子缺陷，尤其是遺傳病因導致的精子畸形(圓頭精子、大頭多尾畸形、無頭精子和精子鞭毛多發性形態異常等)外，精子形態學評估對男性不育癥診斷的敏感性和特異性都較差[12]。而且上述方法都存在低通量、低效率以及容易受主觀影響的缺點。隨著流式細胞術的發展，精子DNA碎片檢測逐漸普遍。檢測精子DNA碎片的方法有許多種，臨床最常用的是精子染色體擴散實驗(sperm chromatin dispersion，SCD)[13]和SCSA法[14]，其中SCSA由于其高通量、高準確性而被廣泛使用。本課題組的前期研究也證明了精子DNA碎片對精子質量均有較好的預測價值[15]。雖然國內外關于精子DNA完整性用于預測男性精子受精能力的研究越來越多，但其臨床效用尚待確定[16]，有待于完善實驗設計的前瞻性研究加以探討。

臨床上采用SCSA檢測DFI是通過吖啶橙染色，借助流式細胞儀檢測熒光信號后計算結果。流式細胞儀可以同時給出很多信號，特定的熒光信號只是其中之一。FSC信號可以反映細胞的相對大小，但是想要直接測量細胞體積大小是不可靠的。有研究者曾試圖通過數學算法將FSC信號用于分析精子形態學變化，但是將這些數據外推到真正的精子形態學上是比較困難的[17]。盡管我們無法給出每一個精子精確的大小數據，但是通過FSC通道的圖像仍然可以看出精子大小分布的情況，從本研究結果看，整體CV值越小，精子大小分布越趨近，分布寬度越小，精子質量越好；反之，精子大小均一性越差，精子質量越低。流式細胞儀檢測的精子大小主要為精子頭部大小，巴氏染色的正常精子頭部長度中位數一般為4.1 μm，寬度中位數一般為2.8 μm[18]，頭部過大或過小提示精子可能伴隨著各種類型的畸形。有研究發現當一份精液中存在高百分比的小頭精子時，患者輔助生殖的受精率降低且胚胎結局差[19]。部分小頭精子還可能提示患者存在某種遺傳缺陷，有研究發現1例患者精液中多為小頭精子，測序發現其存在無名指蛋白220(ring finger protein 220，RNF220)編碼基因的致病突變[20]。精子頭部大提示可能存在精子減數分裂異常和染色質濃縮障礙，進而影響精子質量和受精能力。Guthauser等[21]通過測量精子大小與染色質濃縮程度，發現測量的所有精子染色質的平均解聚率為46%，而大頭形式則達到了64%。與小頭精子類似，部分大頭精子病例也提示存在遺傳缺陷，極光激酶C(aurora kinase C，AURKC)編碼基因缺陷已經成為大頭精子致病畸形基因篩選的重要位點[22]。流式細胞儀檢測到精子偏大可能是由于大頭缺陷，也有可能提示有過量胞漿殘留，過量的胞漿殘留對精子質量有著嚴重損害[23]。精子大小的異質性對于生育力的預測一直是大家關注的問題，早在上個世紀就有研究者對精子大小分布與生育力的相關性進行了研究，Aziz等[24]比較了生育組與未生育組之間的精子頭大小分布，發現其存在顯著差異：與未生育組相比，生育組的精子頭面積和長軸均一性更高。Mossman等[25]對從500名男子中隨機選擇103名男子提供的精液進行研究，發現不僅是精子頭部的長度，甚至其長度變化的均一性也對精子質量有預測作用。這些結論都與本研究結果相似，但是與以往研究采用光學顯微鏡觀測相比，本研究采用流式細胞術檢測的通量更高，更簡便。

綜上所述，采用流式細胞術檢測精子大小異質性，繼而反映精子質量是一種相對簡便可行的方法。但本研究仍存在一些不足，由于特異性熒光抗體的缺乏，本研究檢測的其實是精液中所有細胞的大小分布，并沒有完全針對精子，雖然我們在篩選入組病例時排除了鏡下雜細胞多的患者，而且紅細胞、粒細胞、淋巴細胞等圓細胞體積均遠大于精子，但目前的結果仍不是最精準的。近年來有部分研究探索了在流式細胞檢測中采用精子特異性抗體，但都沒有廣泛使用[2]，后續研究需要采用更好的抗體標記與更好的精子分離手段加以完善。