基于顯微視覺的酶聯斑點圖像識別計數

熊國順，張從鵬，謝佳成，解毅， 張堉 晨

（北方工業大學機械與材料工程學院，北京100144）

0 引 言

結核桿菌T細胞酶聯斑點（T-Spot）檢測具有靈敏度高、特異度高的優點，是臨床結核病診斷的重要手段[1]。目前，對酶聯斑點的計數主要依靠人工方法，對臨床醫生的專業水平要求高，同時存在效率低、勞動強度大等不足。近年來，Corkidi G等[2]利用微生物菌落表面的光學特性，采用多級閾值方法實現對粘連及大小不均菌落的分離和計數；周螢莉等[3]提出用Otsu算法結合Hough變換提取目標區域，用距離變換和分水嶺算法分割菌落，對分割后的菌落篩選計數；司秀娟等[4]設計了基于Android平臺的菌落計數系統。張立新等[5]提出一種基于改進水平集的全自動菌落分割、計數方法。國內外學者對在斑點自動識別計數方面取得了一定的研究成果[6-7]，但對T-Spot顯微圖像的自動計數研究較少，本文以開發細胞酶聯斑點自動檢測儀為目標，研究酶聯斑點自動識別計數技術，具有重要理論與現實意義。

1 系統描述

T-Spot顯微視覺平臺由運動控制系統和計算機顯微視覺系統組成[8]。實現對T-Spot的逐孔掃描采集和圖像處理，如圖1所示。選用500萬像素的UM012C型數碼顯微鏡，放大倍率為300倍；T-Spot標板選用標準的96孔酶標板。

2 目標區域提取

2.1 自動閾值分割

由于環形光源和標板小孔視野中心很難重合，存在非均勻照明現象，造成目標區域輪廓的圖像灰度不一致，無法通過單一閾值對圖像進行分割，如圖2(a)所示。本文采用自動閾值分割方法[9]，分割流程圖如圖3所示：通過判斷原圖像和參考圖像對應點的像素差值是否大于局部閾值，來分割目標區域和背景區域。通過自動閾值算法分割效果如圖2 (b)所示。

圖1 顯微視覺平臺

圖2 分割對比圖

圖3 自動閾值分割流程圖

通過自動閾值分割，可以得到目標區域的大致輪廓，排除大部分背景像素干擾，為進一步邊緣輪廓提取打下基礎。

2.2 邊緣輪廓提取

如圖2(b)所示，粗分割后的圖像具有豐富的邊緣輪廓信息及邊緣干擾信息；酶標板單孔內邊界為圖像的真實邊界，由于光照不均造成的投影邊界、附著在邊界的斑點及雜質等均為干擾信息。邊緣輪廓提取的目的是排除干擾因素，獲取目標區域真實邊界，實現精確分割。首先對分割后的圖像進行連通域劃分，根據酶標板單孔面積及圓度特征初步提取出邊緣輪廓，如圖4(a)所示。

2.2.1 邊緣輪廓篩選

對邊緣輪廓進行篩選之前需要對“粗”輪廓邊緣進行光滑處理。通過對平滑算法的研究及實驗驗證，采用基于形態學的閉運算來平滑邊界區域[10]。通過閉運算光滑處理后區域邊緣輪廓線變得光滑，適合對邊緣輪廓進行篩選。對邊緣輪廓區域重新劃分連通域，觀察發現，新的連通域由圓弧和局部自封閉輪廓組成，通過限制矩形度選出所有的圓弧區域，篩選后的輪廓圖如4(b)所示。

2.2.2 邊緣擬合

針對常規最小二乘法擬合圓對于離群值魯棒性較差的問題，引入權重來減小離群值帶來的影響[11]。權值大小與輪廓點到擬合圓的距離成反比。

擬合圓的處理流程為：首輪計算時對參與計算的每個輪廓點賦予相同的權重，擬合出圓；計算輪廓點到擬合圓的距離，根據權重函數賦予每個點對應的權值，擬合出更精確的圓；這樣，根據上一次擬合結果計算輪廓點到擬合圓的距離，通過權重函數賦予每個點新的權重，多次迭代可以得到理想的擬合結果[12]。擬合結果如圖5(a)所示，通過對擬合結果添加半徑約束得到最終擬合結果。

經過邊緣擬合得到目標區域的精確邊緣輪廓，根據擬合結果的圓心坐標及半徑信息可以從原圖中準確分割出目標區域。

圖4 邊緣提取

3 識別計數

圖5 擬合結果

3.1 基于距離變換的分水嶺分割

分割后的目標區域如圖5(b)所示，部分斑點存在明顯的粘連現象，本文選用基于距離變換的分水嶺算法[13]對斑點圖像進行處理。算法分割流程如圖6所示。

3.2 計數

通過分水嶺算法分割目標，通常會存在過分割現象，在實際應用中需要對算法進行優化[14]。本文通過對距離變換前的圖像進行形態學處理，消除噪聲、鋸齒邊緣等干擾因素；對于分水嶺分割后的區域選取合適的面積閾值，過濾由偽局部極小值點造成的過分割區域。經驗證，該方法能夠有效提高分割精度，抑制過分割現象，優化后的分割效果圖如圖7(b)所示；對經過篩選后的區域進行連通域劃分，通過計算連通域個數即可得到斑點個數。

4 實驗

通過如圖1所示顯微視覺平臺對標準的96孔酶標板進行圖像采集，共采集圖像384幅，分為128組，每組包含陽性對照孔、陰性對照孔、抗原孔圖片。利用本文設計的圖像處理程序對斑點進行計數，根據酶標板廠家提供的標準對結果判讀。

判讀標準為[15]：若陰性對照孔斑點數為0～5，抗原孔斑點數減去陰性對照孔斑點數大于等于6，結果判定為陽性，小于6為陰性；若陰性對照孔斑點數大于等于6，抗原孔斑點數大于等于2倍陰性對照孔點數，結果判定為陽性，否則為陰性。實驗統計結果如表1所示。

實驗結果顯示：結核病檢驗測試的靈敏度為96.19%, 特異度為91.30%，假陽性率為3.81%，假陰性率為8.70%，綜合準確率為95.31%。對比美國FDA臨床研究數據[16]，T-SPOT.TB用于結核病的診斷特異度為97.1%，靈敏度為95.6%；本文算法在靈敏度方面與國外研究持平。

對于儀器檢驗結果，臨床醫生僅需對照放大圖像進行復核，即可出具診斷報告，從而大大降低了醫生的勞動強度，提高了檢驗效率。

圖6 識別計數流程圖

圖7 斑點識別計數

表1 本文算法實驗結果

5 結 論

本文針對酶聯斑點人工計數存在的問題，設計了一套基于圖像處理的酶聯斑點自動識別計數算法；通過自動閾值和精確擬合方法，實現了復雜背景下的目標區域圖像的準確提取；對目標區域中粘連斑點實現有效分割，減少了過分割現象。實驗結果表明：采用本文算法對酶聯斑點自動識別計數并進行結果判讀，在陽性樣本識別方面表現良好，綜合準確率達到95.31%，可作為輔助醫師臨床檢驗的有效工具。